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    液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿酸及與常規(guī)檢測方法的比較

    2016-01-18 12:23:48張海晨李水軍孫賀偉宋云霄
    檢驗醫(yī)學(xué) 2015年5期
    關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜法液相色譜尿酸

    張海晨, 李水軍, 孫賀偉, 宋云霄

    [1. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國科學(xué)院上海臨床研究中心)檢驗科,上海 200031;

    2. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國科學(xué)院上海臨床研究中心)中心實驗室,上海 200031;

    3. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444]

    液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿酸及與常規(guī)檢測方法的比較

    張海晨1,李水軍2,孫賀偉3,宋云霄1

    [1. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國科學(xué)院上海臨床研究中心)檢驗科,上海 200031;

    2. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院(中國科學(xué)院上海臨床研究中心)中心實驗室,上海 200031;

    3. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444]

    摘要:目的建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測血清尿酸的方法,并與臨床常規(guī)生化方法進行比較,為臨床實驗室不同檢測系統(tǒng)尿酸檢測結(jié)果的一致性提供參考。方法血清添加同位素內(nèi)標尿酸-15N2,經(jīng)乙腈處理吹干重組后采用LC-MS/MS測定。以Capcell C18 MGⅢ為分析柱進行反相色譜分離,以5 mmol/L乙酸銨+0.1%乙酸水溶液和甲醇(90∶10,v/v)為流動相,等度洗脫,流速0.3 mL/min,電噴霧離子化串聯(lián)四極桿質(zhì)譜,負離子多反應(yīng)監(jiān)測,尿酸離子通道為167/124 amu(定量)、167/96 amu(定性);尿酸-15N2離子通道為169/125 amu。LC-MS/MS進行方法學(xué)評價后與臨床尿酸常規(guī)檢測方法(酶紫外法和酶比色法)進行比較。結(jié)果LC-MS/MS檢測尿酸的線性范圍為30~952 μmol/L,批內(nèi)和批間精密度分別為2.01%~6.23%和4.55%~8.08%,準確度為96.5%~103.4%。尿酸的色譜保留時間為1.5 min,單份樣品的分析時間為3 min。酶紫外法、酶比色法與LC-MS/MS的平均偏差分別為-10.02%、-9.88%;線性相關(guān)方程分別為Y酶紫外法=0.898XLC-MS/MS+2.15,r=0.978;Y酶比色法=0.845XLC-MS/MS+22.15,r=0.983。LC-MS/MS與美國標準技術(shù)研究所(NIST)定值參考物質(zhì)的平均偏差為1.56%±0.65%,與衛(wèi)生部臨床檢驗中心2014年代謝物正確度驗證樣品的定值的偏差為-0.34%~3.05%。結(jié)論采用LC-MS/MS可簡便、準確地定量檢測尿酸。酶紫外法、酶比色法的血清尿酸測定結(jié)果與LC-MS/MS具有較好的可比性。

    關(guān)鍵詞:尿酸;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;尿酸酶紫外法;尿酸酶比色法

    Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for uric acid and its comparison with clinical routine determination methodZHANGHaichen1,LIShuijun2,SUNHewei3,SONGYunxiao1

    .[1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiXuhuiCentralHospital(ShanghaiClinicalResearchCenter,ChineseAcademyofSciences),Shanghai200031,China; 2.CentralLaboratory,ShanghaiXuhuiCentralHospital(ShanghaiClinicalResearchCenter,ChineseAcademyofSciences),Shanghai200031,China; 3.BiologicalCollege,ShanghaiUniversity,Shanghai200444,China]

    Abstract:ObjectiveTo establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)for serum uric acid, and to compare LC-MS/MS with clinical routine determination methods. MethodsUric acid-15N2was added as internal standard, serum samples were precipitated with acetonitrile and dried with nitrogen flow. A reversed-phase chromatographic separation was performed on Capcell C18 MGⅢ analytical column by using 5 mmol/L ammonium acetate plus 0.1% acetate acid in water and methanol(90∶10,v/v)as mobile phase. The flow rate was 0.3 mL/min. Uric acid and internal standard were monitored by a negative electrospray ion-tandem mass spectrometry system using ion transitions of 167/124 amu (quantitation) and 167/96 amu (qualitation) for uric acid and 169/125 amu for uric acid-15N2. After being validated, the LC-MS/MS was compared with the uricase ultraviolet (UV) method and uricase colorimetric (UC) method. ResultsThe LC-MS/MS was validated over a concentration range of 30-952 μmol/L. Within-run and between-run precisions were 2.01%-6.23% and 4.55%-8.08%, respectively. The accuracy was 96.5%-103.4%. The retention time of uric acid was 1.5 min, and total run time was 3 min. The linear correlation formulas among LC-MS/MS, uricase UV method and uricase UC method were YUV=0.898XLC-MS/MS+2.15, r=0.978 and YUC=0.845XLC-MS/MS+22.15, r=0.983. The average biases were 1.56%±0.65% between LC-MS/MS and the National Institute of Standards and Technology (NIST) standard reference material and -0.34%-3.05% between LC-MS/MS and correctness verification samples, 2014 from the National Center for Clinical Laboratory. ConclusionsSerum uric acid can be simply and accurately measured by LC-MS/MS. There is good comparability between LC-MS/MS, uricase UV method and uricase UC method.

    Key words:Uric acid; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method; Uricase ultraviolet method; Uricase colorimetric method

    血尿酸是臨床診斷痛風、腎結(jié)石的傳統(tǒng)生化指標[1-2]。越來越多的臨床研究數(shù)據(jù)表明,高尿酸血癥還是高血壓、冠心病、代謝綜合征的風險因子[3-7]。低尿酸血癥則可能增加惡性腫瘤、心血管疾病、骨損傷疾病、膽囊疾病的風險[8]。目前用于檢測尿酸的方法有酶紫外法、酶比色法、磷鎢酸比色法、干化學(xué)法等?;谫|(zhì)譜法的尿酸檢測更多地應(yīng)用于參考方法的建立[9-11],用于臨床常規(guī)檢測則比較少見。我們對本實驗室自建的同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)進行了方法學(xué)驗證,并與目前臨床常用的檢測尿酸的酶紫外法和酶比色法進行比較,評價LC-MS/MS與現(xiàn)有尿酸檢測方法的可比性。

    材料和方法

    一、樣品來源

    收集上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院門診及住院的血清尿酸>476 μmol/L和<100 μmol/L的患者45例。同時收集上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院體檢中心健康體檢者135名,其中男65名,女70名,排除明顯溶血和脂濁的樣本,體檢結(jié)果無明顯異常。所有血清樣本收集后置-70℃保存。

    二、試劑和儀器

    1. 試劑尿酸標準品(純度99%,批號10105129)購自英國Alfa Aesar公司;尿酸-15N2(同位素豐度98%,批號PR-16532A)購自美國Cambridge Isotope Laboratory公司;乙酸(液相色譜純)購自美國Tedia公司;乙酸銨(優(yōu)級純)、乙腈(液相色譜純)、甲醇(液相色譜純)購自德國Merck KGaA公司。尿酸常規(guī)檢測試劑盒[酶紫外法(批號:FA5133)、酶比色法(批號:300196)]、校準液[酶紫外法(批號:4ED108)、酶比色法(批號:267256A)]購自西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。定值質(zhì)控品(水平1批號:45651、水平2批號:45652、水平3批號:45653)購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

    2. 儀器LC-MS/MS檢測系統(tǒng)由3200 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司)及液相色譜系統(tǒng)[日本島津公司,包括LC-20AD輸液泵、DGU-20A3在線脫氣儀、SIL-HTc自動進樣器]組成。酶紫外法的儀器為SIEMENS Dimension RxL全自動生化分析儀檢測,酶比色法的儀器SIEMENS ADVIA 2400全自動生化分析儀。其他儀器包括Vortex-2渦旋混合器、Eppendorf Centrifuge 5430 R冷凍高速離心機、Techne GR-150氮吹儀。

    三、LC-MS/MS分析條件

    參照文獻[12],本實驗室為適應(yīng)臨床常規(guī)測定尿酸的需要,全新自建了LC-MS/MS,采用與文獻[12]不同的流動相、洗脫方法、色譜柱和樣品處理方法。

    1. 液相條件分析柱為Capcell C18 MGⅢ(2.1 mm×100 mm,5 μm,日本資生堂精細化學(xué)公司);流動相為5 mmol/L乙酸銨+0.1%乙酸水溶液和甲醇(90∶10,v/v),等度洗脫,流速為0.3 mL/min,進樣體積為5 μL。

    2. 質(zhì)譜條件電噴霧離子源,負離子檢測;GAS1:60,GAS2:60,氣簾氣:20,碰撞氣:高,離子源電壓:4 500 V,離子源溫度:550℃;多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)掃描分析,尿酸離子通道為167/124 amu(定量)、167/96 amu(定性);尿酸-15N2離子通道為169/125 amu。

    3. 貯備液、標準溶液和內(nèi)標溶液的制備(1)尿酸貯備液:精密稱取尿酸標準品,2 mmol/L氨水溶解定容,配制濃度為1 142 μmol/L;(2)內(nèi)標貯備液:精密稱取尿酸-15N2標準品,2 mmol/L氨水溶解定容,配制濃度為1 159 μmol/L;(3)尿酸工作液:取尿酸貯備液,用5 mmol/L乙酸銨+0.1%乙酸水溶液配制成濃度為30、60、119、238、476、952 μmol/L的標準工作液,按樣品處理方法處理后進樣。

    4. 樣品處理在100 μL血清中添加10 μL尿酸-15N2貯備液為內(nèi)標,200 μL乙腈沉淀蛋白,22 000×g離心5 min,取50 μL上清液40℃氮氣吹干,200 μL 5 mmol/L乙酸銨+0.1%乙酸水溶液重組,取5 μL進樣分析。

    四、尿酸常規(guī)生化檢測方法

    采用酶紫外法和酶比色法分別檢測尿酸,嚴格按試劑盒說明書操作。

    五、統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。方法之間的差異采用配對t檢驗和ANOVA分析,相關(guān)性采用線性回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié)果

    一、 LC-MS/MS測定血清尿酸的方法學(xué)評價

    尿酸和同位素內(nèi)標的保留時間為1.5 min,每份樣品的儀器分析時間為3 min。典型的色譜圖見圖1。采用流動相A(5 mmol/L乙酸銨+0.1%乙酸水溶液)作為空白基質(zhì),用于配制標準曲線和質(zhì)控樣品,空白樣品無干擾。

    以添加濃度為X軸,樣品與內(nèi)標物的峰面積比為Y軸,進行線性回歸,經(jīng)加權(quán)最小二乘法“1/X2”權(quán)重得回歸方程為Y=0.043X+0.048,r=0.997)。尿酸濃度在30~952 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由于過低的尿酸濃度臨床意義不大,故本研究將尿酸的最低定量下限(Lower limit of quantification,LLOQ)設(shè)定為30 μmol/L,LLOQ的色譜圖見圖1。LC-MS/MS的檢測限可達1 μmol/L。

    取6個臨床血清樣品,同時用空白基質(zhì)(流動相A)配制297 μmol/L尿酸化學(xué)品,分別與血清樣品等體積混合,重復(fù)測定6次,同時測定血清樣品、化學(xué)品、混合樣品的尿酸及內(nèi)標響應(yīng)。確定混合樣品尿酸/內(nèi)標比值與理論值(血清樣品與化學(xué)品響應(yīng)均值)的百分比即可計算方法的回收率。LC-MS/MS的回收率為93.8%~107.0%。

    用空白基質(zhì)配制89、297、714 μmol/L尿酸質(zhì)控品,同時收集3個臨床血清樣品,分3個批次,每批次重復(fù)測定6次。LC-MS/MS測定血清尿酸的精密度和準確度結(jié)果見表1。

    觀察血樣在室溫(23℃)放置8 h、處理后在自動進樣器放置12 h、凍融3次、-20℃保存14 d以及尿酸貯備液-20℃放置5 d的穩(wěn)定性。與初始濃度相比,其相對偏差分別為-4.5%、-2.6%、-6.8%、2.1%和-0.9%。

    采用 LC-MS/MS檢測135名體檢者的血清尿酸。男性尿酸水平[(398±70)μmol/L]明顯高于女性[(303±73)μmol/L](P<0.001),見圖2。

    注:尿酸及內(nèi)標的色譜保留時間均為1.5 min;(a)空白基質(zhì);(b)LLOQ,尿酸濃度為30 μmol/L;(c)患者血清樣品,尿酸濃度為392 μmol/L

    圖1 尿酸典型色譜圖

    圖2LC-MS/MS測定男、女性血清尿酸的比較

    二、方法學(xué)比較

    采用LC-MS/MS、酶紫外法和酶比色法分別測定135名體檢者血清尿酸濃度,經(jīng)線性回歸分析,回歸方程分別為Y酶紫外法=0.898XLC-MS/MS+2.15,r=0.978;Y酶比色法=0.845XLC-MS/MS+22.15,r=0.983。見圖3。

    注:(a)LC-MS/MS與酶紫外法的相關(guān)性,Y酶紫外法=0.898XLC-MS/MS+2.15,r=0.978;(b)LC-MS/MS與酶比色法的相關(guān)性,Y酶比色法=0.845XLC-MS/MS+22.15,r=0.983

    圖3酶紫外法、酶比色法與LC-MS/MS的相關(guān)分析

    以兩種方法的尿酸測定均值為橫坐標,以兩種方法尿酸測定值百分偏差為縱坐標,作Bland-Altman圖,分析酶紫外法、酶比色法與LC-MS/MS的一致性。酶紫外法與LC-MS/MS的平均偏差為-10.02%,酶比色法與LC-MS/MS的平均偏差為-9.88%,見圖4。方差分析顯示3種方法之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

    采用LC-MS/MS測定美國標準技術(shù)研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)參考物質(zhì)SRM1950中的尿酸水平[定值±不確定度為(254±5)μmol/L),偏差為1.56%±0.65%(n=3);采用LC-MS/MS測定衛(wèi)生部臨床檢驗中心2014年代謝物、總蛋白正確度驗證的樣品[編號分別為201411、201412,定值±不確定度分別為295.0±12.0、(536.0±22.1)μmol/L)]的偏差為-0.34%~3.05%(2水平,n=3),測定結(jié)果均落在不確定度允許范圍內(nèi)。測定衛(wèi)生部臨床檢驗中心2014年常規(guī)化學(xué)室間質(zhì)量評價(external quality assessment,EQA)樣品,與靶值的偏差為3.68%±1.19%(5水平,n=3)。

    圖4LC-MS/MS與酶紫外法、酶比色法的Bland-Altman圖

    討論

    得益于儀器成本的大幅下降和自動化程度的不斷提高,最近10年質(zhì)譜技術(shù)在臨床檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用得到了突飛猛進的發(fā)展。LC-MS/MS將色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的特異、靈敏、多組分檢測能力有機結(jié)合,成為臨床檢驗領(lǐng)域最富生命力的新技術(shù)之一。目前,LC-MS/MS已經(jīng)在臨床檢驗如常規(guī)生化、內(nèi)分泌、治療藥物監(jiān)測、維生素、多肽蛋白等領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用[13]。目前基于LC-MS/MS的尿酸檢測主要用于建立參考方法[9-11,14],可以實現(xiàn)高度精確的尿酸檢測。參考方法對分析過程和色譜分離要求嚴格,因此操作繁瑣、時間冗長,不適合用于臨床常規(guī)應(yīng)用。目前鮮見LC-MS/MS用于臨床常規(guī)的報道。由于上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院藥物臨床試驗項目及臨床校對的需要,本實驗室自建了測定血清尿酸的LC-MS/MS方法。本研究建立的LC-MS/MS采用同位素稀釋質(zhì)譜法,血清用乙腈沉淀后吹干,常規(guī)反相液相色譜分離,每個樣品的色譜分析時間僅為3 min,可以實現(xiàn)簡單、快速的檢測。空白基質(zhì)與真實血清有良好的互換性,樣品在室溫、凍融、長期儲存等條件下,尿酸均能保持相對穩(wěn)定。由于尿酸具有稠環(huán)化學(xué)結(jié)構(gòu),不易溶于水和有機溶劑,易溶于堿性水溶液,但尿酸在堿性條件下穩(wěn)定性不佳。本研究借鑒了參考方法建立時采用的尿酸貯備液配制方法[11,15],采用2 mmol/L氨水配制濃度1~2 mmol/L尿酸貯備液,-20℃保存,解決了其穩(wěn)定性和溶解性問題。考慮到本方法為自建方法,本研究測定了NIST的參考物質(zhì)SRM1950以及2014年衛(wèi)生部臨床檢驗中心代謝物正確度驗證的樣品,偏差總體上控制在5%以內(nèi),說明本方法具有良好的準確性和可靠性,完全可以滿足尿酸常規(guī)檢測的要求。

    臨床現(xiàn)有的尿酸檢測方法有酶紫外法、酶比色法等多種,有進口和國產(chǎn)儀器/試劑之分,又存在封閉平臺和開放平臺等組合形式[16]。對于我國這種多樣化的現(xiàn)狀,要實現(xiàn)檢驗結(jié)果的互認最重要的前提是建立我國的參考測量體系、開展標準化工作,以實現(xiàn)檢驗結(jié)果的溯源性[17]。而進行方法學(xué)比對,特別是與參考方法進行比對,是實現(xiàn)檢驗結(jié)果一致性的重要途徑[18]。本方法與酶紫外法、酶比色法的偏差平均高10%左右。總體而言,兩種常規(guī)生化方法和LC-MS/MS具有較好的一致性,但是從圖4可以看出,仍有約5%的低濃度樣品偏差超過20%。因此,對于臨床一些異常的低值結(jié)果,如條件允許,建議用LC-MS/MS復(fù)核可疑數(shù)據(jù)。另外建議參加正確度驗證計劃或者用參考物質(zhì)進行校正,可有效提高結(jié)果的準確性和方法間的可比性。

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    (本文編輯:龔曉霖)

    收稿日期:(2015-01-21)

    中圖分類號:

    文章編號:1673-8640(2015)05-0422-05R446.1

    文獻標志碼:ADOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.004

    通訊作者:李水軍,聯(lián)系電話:021-54031835。

    作者簡介:張海晨,男,1973年生,副主任技師,主要從事臨床生物化學(xué)檢驗工作。

    基金項目:上海市徐匯區(qū)衛(wèi)生與計劃生育委員會科研基金資助項目(SHXp01301)

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