不同培養(yǎng)條件下透析液和反滲水微生物監(jiān)測的比較分析

周悅昌，　任麗娜，　王旭輝，　陳建文，　陳妙佩，　毛鴻忠，　韓立杰

不同培養(yǎng)條件下透析液和反滲水微生物監(jiān)測的比較分析

周悅昌1，任麗娜1，王旭輝1，陳建文3，陳妙佩3，毛鴻忠3，韓立杰2

(1. 牡丹江巿第二人民醫(yī)院檢驗科，黑龍江 牡丹江 157000；

2. 牡丹江巿第二人民醫(yī)院血液凈化中心，黑龍江 牡丹江 157000；

3. 屏基醫(yī)療財團法人屏東基督教醫(yī)院教學研究部腎臟科研究小組，臺灣 屏東 811)

摘要：目的比較不同培養(yǎng)基、孵育溫度及培養(yǎng)時間的選擇對透析液和反滲水微生物監(jiān)測總菌落計數(shù)的差異，確認透析液和反滲水微生物監(jiān)測的最佳培養(yǎng)條件。方法采用無菌透析液和無菌反滲水配置模擬污染水樣本，傾注法接種于伊紅美藍瓊脂(EMB)、大豆酪蛋白瓊脂(TSA)、胰蛋白胨葡萄糖浸液(TGEA)培養(yǎng)基，于25℃和35℃分別進行培養(yǎng)，并記錄培養(yǎng)48、72 h及7 d的生長情況。結果不論是25℃還是35℃，TGEA的生長情況均最佳且最接近預期菌落數(shù)(P<0.05)；各種培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h比48 h生長好(P<0.05)；培養(yǎng)7 d后的菌落數(shù)與培養(yǎng)72 h比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論使用傾注平板法及TGEA培養(yǎng)基對透析液和反滲水進行微生物監(jiān)測，需同時在25℃及35℃條件下培養(yǎng)至少72 h，方可產生有效的監(jiān)測報告，確?；颊叩耐肝霭踩?/p>

關鍵詞：血液透析液；反滲水；總菌落數(shù)計算

Comparison analysis of microbiological monitoring between hemodialysate and reverse osmosis water under different mediaZHOUYuechang1，RENLina1，WANGXuhui1，CHENJianwen3，CHENMiaopei3，MAOHongzhong3，HANLijie2

.(1.DepartmentofClinicalLaboratory，theSecondPeople′sHospitalofMudanjang，HeilongjiangMudanjiang157000,China； 2.BloodPurificationCenter，theSecondPeople′sHospitalofMudanjang，HeilongjiangMudanjiang157000,China； 3.TeamofNephrologicalResearch,DepartmentofMedicalResearch，PingtungChristianHospital，TaiwanPingtung811,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the difference between media， incubation temperatures and culture times on the choice of hemodialysate and reverse osmosis water for microbiological monitoring of heterotrophic plate count， and further to confirm the best culture method of microbiological monitoring for hemodialysate and reverse osmosis. MethodsThe polluted samples were simulated by using sterile dialysate and sterile reverse osmosis water， and then were incubated in 25℃ and 35℃ with eosin methylene blue agar(EMB)， tryptone soy agar(TSA) and tryptone glucose extract agar(TGEA)for 48 h， 72 h and 7 d， respectively. ResultsEither on 25℃ or 35℃， the bacteria′s growth condition in TGEA was better than those under other conditions(P<0.05). The colony numbers of 72 h incubation were more than those of 48 h incubation in all media(P<0.05). However， there was no statistical significance of colony numbers between 7 d incubation and 72 h incubation(P > 0.05). ConclusionsThe microbiological monitoring for hemodialysate and reverse osmosis water needs to use pour plate method with TGEA， incubating in 25℃ and 35℃ for 72 h， which may provide the effective reports for ensuring the safety of hemodialysis patients.

Key words:Hemodialysate; Reverse osmosis water; Heterotrophic plate count

血液透析主要是靠血液與透析液在半透膜間進行彌散作用移除尿毒素，水是很好的溶劑，但進行高通量血液透析時微生物及其代謝產物會通過反彌散作用(back filtration)或透析器破膜方式進入血液，特別是當以透析液做為補充液時，微生物及其代謝產物更會直接進入人體[1-2]，導致菌血癥和膿毒血癥的發(fā)生。因此，要避免血液透析帶來的長期慢性微發(fā)炎反應，讓透析更安全，透析液的微生物監(jiān)測是血液透析質量達標的第一步[3]。

目前，透析液和反滲水的微生物培養(yǎng)普遍存在敏感性低、假陰性率高的情況，造成臨床上低估透析液和反滲水的污染問題，增加了透析患者的安全隱患。各國對透析液和反滲水的微生物含量雖訂有嚴格標準，但檢驗方式、培養(yǎng)方法及采樣方式仍存在很大的差別。培養(yǎng)基與培養(yǎng)時間不同得到的結果也不同[4]；水生細菌適合在乏營養(yǎng)環(huán)境中生長，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中反而生長緩慢，甚至不能存活[5-6]；不同的孵育溫度和時間，培養(yǎng)的結果也會有所差異[7-8]，如22℃培養(yǎng)7 d、37℃培養(yǎng)2 d或30℃培養(yǎng)5 d[9-11]。因此，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物指標不超標，并不代表真的不超標。2001年EDTA best practice guideline、2003年國際腎臟病學會(International Society of Nephrology， ISN)及2005年德國衛(wèi)生指南(German hygiene guideline)推薦使用胰蛋白胨葡萄糖浸液瓊脂(tryptone glucose extract agar， TGEA)[5，9，12]。對于總菌落數(shù)計數(shù)，美國公共衛(wèi)生協(xié)會(American Public Health Association, APHA)推薦以傾倒平板法做為水培養(yǎng)的標準方法[6，13]。

我們采用2種不同菌落數(shù)的標準菌液，以傾倒平板法接種于3種不同的培養(yǎng)基，分25℃及35℃進行培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)48、72 h及7 d的生長情況，以確認最佳的培養(yǎng)條件，供透析液和反滲水微生物監(jiān)測使用。

材料和方法

一、材料

1.標準菌株大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853e。

2.培養(yǎng)基大豆酪蛋白瓊脂(tryptone soy agar, TSA)、伊紅美藍瓊脂(eosin methylene blue agar, EMB)、TGEA。

3.主要儀器法國生物梅里埃公司DensiCHEK plus比濁儀、生物安全柜、細菌培養(yǎng)箱、振蕩器。

二、方法

1.采樣(1)透析液采集(透析機采樣)：以酒精消毒橡膠采樣閥30 s，全新注射器抽取管路中的透析液，放入無菌收集瓶(采樣方式見圖1)；(2)反滲水采集：以酒精消毒采集口，放入無菌收集瓶后經高溫高壓滅菌確保達到無菌狀態(tài)。二者使用前先置于254 nm紫外線下照射8 h，確保殺滅可能的微生物[14]。

2.實驗設計(1)采用無菌透析液和無菌反滲水配制濃度為McFarland 0.5的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的菌懸液，再利用無菌透析液和無菌反滲水進行稀釋配制，模擬約6和60 CFU/mL菌落數(shù)污染的水樣本(稀釋倍數(shù)分別為25×106和2.5×106)，在振蕩器上溫和混勻，以傾倒平板法接種于TSA、EMB、TGEA培養(yǎng)基，分別于25℃、35℃進行培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)48 h、72 h的生長情況，以無菌透析液和無菌反滲水作為空白對照；EMB組、TSA組和TGEA組的平行檢測數(shù)為36；25℃組和35℃組的平行檢測數(shù)為54；48 h組和72 h組的平行檢測數(shù)為108，以各組實際檢測數(shù)列表，進行統(tǒng)計學分析；(2)僅用金黃色葡萄球菌模擬約6和60 CFU/mL菌落數(shù)污染的水樣，采用傾倒平板法接種于TSA、EMB、TGEA培養(yǎng)基，分別于25℃、35℃進行培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)48、72 h及7 d的生長情況，以無菌透析液和無菌反滲水作為空白對照；實驗中72 h組和7 d組的平行檢測數(shù)為36，以各組實際檢測數(shù)列表，進行統(tǒng)計學分析。

圖1　采樣方式

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用獨立樣本t檢驗、單因子變異數(shù)分析比較不同培養(yǎng)基、孵育溫度及培養(yǎng)時間對透析用水總菌落計數(shù)的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

以TGEA的生長最佳也最接近預期菌落數(shù)，其次為TSA，再次為EMB，各組間菌落數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。25℃下各培養(yǎng)基的生長情況優(yōu)于35℃(P<0.05)。各培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h的生長情況優(yōu)于48 h(P<0.05)，金黃色葡萄球菌在EMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h未見生長。見表1、表2。

以金黃色葡萄球菌模擬污染水樣本培養(yǎng)結果顯示培養(yǎng)7 d的菌落數(shù)與培養(yǎng)72 h比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但菌落明顯變大。見表3、表4、圖2。

表1　模擬污染透析液及模擬污染反滲水在各培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)48、72 h的菌落生長情況

表2　模擬污染透析液及模擬污染反滲水在25℃各培養(yǎng)基培養(yǎng)48、72 h的菌落生長情況

表3　以金黃色葡萄球菌模擬污染透析液及反滲水在各培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)48、72 h及7 d的菌落生長情況

表4　以金黃色葡萄球菌模擬污染透析液及反滲水在各培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)48、72 h及7 d的菌落生長情況

(a)

(b)

注： (a)透析液，35℃培養(yǎng)； (b)反滲水，35℃培養(yǎng)

圖2模擬污染透析液及模擬反滲水樣本金黃色葡萄球菌(2.5×106CFU/L)在各種培養(yǎng)基48、72 h及7 d培養(yǎng)菌落生長情況

討論

腎功能替代療法在終末期腎臟疾病的治療技術已經相當成熟，而感染卻占慢性血液透析患者死亡率的12%～38%[15]。長期血液透析的患者每周暴露于約400～600 L的透析液中[4]。目前，高通透量血液透析及在線式血液透析過濾術被廣泛應用，利用大孔徑和大表面積的透析膜來增加中、大分子溶質的去除[2，16-17]，但微生物及其代謝產物也會通過反擴散作用進入血液[1，4]，加上透析液做為補充液，因此存在更大的微生物污染風險[2]。革蘭陰性菌可以在所有類型的水樣中生長，即使是在只含有少量有機物質的反滲水、蒸餾水或去離子水中也會生長，而且會在透析系統(tǒng)中形成生物膜，抵抗消毒并不斷釋放代謝產物[9]。這些細菌對血液透析患者的潛在危險主要表現(xiàn)為兩種方式：一是在適當?shù)臈l件下產生菌血癥并導致患者發(fā)生膿毒性休克；二是這些生物的細胞壁成分含有脂多糖(內毒素)，能產生熱原反應。

各國對透析用水的微生物含量均有標準[18]。美國腎臟醫(yī)學會依據美國醫(yī)療儀器協(xié)會RD52:2004的規(guī)范[19-20]，透析液和反滲水均要求細菌數(shù)低于200 CFU/mL[2，21]；英國腎臟醫(yī)學會依據ISO 13959:2001[11]，日本透析治療學會依據ISO 11663:2009[22-24]，均要求細菌數(shù)低于100 CFU/mL，并每月進行微生物監(jiān)測[2，21，25]。因此，選擇有效的培養(yǎng)基、接種方法、孵育溫度、培養(yǎng)時間及采樣方式是透析用水微生物監(jiān)測的關鍵。

JACKSON等[13]研究了傾注平板瓊脂[(35±0.5)℃，培養(yǎng)(48±2)h]計數(shù)與玻片熒光法對水質培養(yǎng)的敏感度，結果顯示二者相關性極高(r=0.95， slop=0.99+0.06)。這也相對證明傾注平板法在透析液及反滲水微生物監(jiān)測中的優(yōu)勢。

本研究觀察了EMB、TSA及TGEA培養(yǎng)基在同等條件下培養(yǎng)48、72 h，結果顯示TGEA培養(yǎng)基菌落生長最佳，而且在低菌落數(shù)(6 CFU/mL)模擬污染水樣本中依然生長良好；EMB是選擇性培養(yǎng)基，主要用于分離革蘭陰性腸道致病菌，它可抑制革蘭陽性菌的生長，故金黃色葡萄球菌在EMB培養(yǎng)48 h觀察未見生長。由此可見，透析液及反滲水微生物培養(yǎng)時對培養(yǎng)基的選擇相當重要。各種培養(yǎng)基72 h比48 h生長好；同樣培養(yǎng)時間25℃組比35℃組生長好。在金黃色葡萄球菌模擬污染水樣本培養(yǎng)中，25℃組和35℃組培養(yǎng)7 d的菌落數(shù)均增加不多(見表3)，但菌落明顯增大(見圖2)。

綜上所述，透析液和反滲水微生物監(jiān)測培養(yǎng)基的選擇TGEA優(yōu)于TSA，而EMB會抑制革蘭陽性菌的生長，所以并不適合；培養(yǎng)溫度25℃優(yōu)于35℃；培養(yǎng)時間72 h優(yōu)于48 h。因此，使用傾注平板法及TGEA培養(yǎng)基對透析液和反滲水進行微生物監(jiān)測，同時在25℃及35℃條件下培養(yǎng)至少72 h，方可產生有效的監(jiān)測報告，確?；颊叩耐肝霭踩?/p>

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(本文編輯：范基農)

收稿日期：(2014-10-31)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0478-06R446.11

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.017

作者簡介：周悅昌，男，1978年生，碩士，副主任技師，主要從事臨床檢驗工作。