脂肪酸結(jié)合蛋白評(píng)價(jià)大鼠缺血性心肌損傷的價(jià)值

脂肪酸結(jié)合蛋白評(píng)價(jià)大鼠缺血性心肌損傷的價(jià)值

余雷李醇文黃明鉅1寧宗2

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急救部，重慶400000)

摘要〔〕目的探討脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血中對(duì)評(píng)價(jià)心肌損傷中的價(jià)值。方法將128只大鼠隨機(jī)分成4組，采用異丙腎上腺素建立不同程度的心肌缺血模型，分為正常對(duì)照組和低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組，取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用Western印跡法檢測(cè)不同程度心肌缺血大鼠血清中H-FABP表達(dá)水平，分析心肌缺血后血清H-FABP含量與時(shí)間關(guān)系，分析大鼠心肌缺血嚴(yán)重程度與血清H-FABP含量之間關(guān)系。結(jié)果①心肌缺血大鼠模型建立成功，大鼠心肌缺血后血清中H-FABP含量2 h已有升高，4 h明顯增高，與正常對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，16 h已有下降，32 h基本降至正常。②大鼠血清H-FABP升高的倍數(shù)隨其心肌缺血程度加重而遞增(P<0.05)。結(jié)論H-FABP在心肌缺血發(fā)生的早期即有明顯升高，持續(xù)時(shí)間較短，H-FABP可作為缺血心肌損傷早期診斷的心肌標(biāo)志物和評(píng)價(jià)損傷程度指標(biāo)。

關(guān)鍵詞〔〕心肌缺血；脂肪酸結(jié)合蛋白；蛋白免疫印跡

中圖分類號(hào)〔〕R466〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：廣西教育廳科研資助項(xiàng)目(No.201012MS063)

通訊作者：寧宗(1968-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師， 主要從事急診危重癥、急性中毒救治研究。

1重慶市三峽中心醫(yī)院2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科

第一作者：余雷(1982-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事急診危重癥研究。

心肌缺血性損傷，特別是急性心肌梗死(AMI)是嚴(yán)重威脅人類生命健康的主要疾病之一，對(duì)AMI的早期診斷及缺血導(dǎo)致心肌損傷程度的評(píng)價(jià)尤為重要，目前診斷AMI的重要指標(biāo)有肌酸激酶(CK),肌酸激酶同工酶(CK-MB)等，對(duì)其測(cè)定存在早期診斷靈敏度不高，損傷程度評(píng)價(jià)特異性差等不足。心肌脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)是一種高度特異性的主要分布在心肌細(xì)胞內(nèi)的低分子量可溶性蛋白，在心肌細(xì)胞受損時(shí)能快速從心肌細(xì)胞釋放進(jìn)入血液〔1,2〕，在心肌梗死后患者血液中出現(xiàn)早，且特異性較高〔3〕。本研究采用鹽酸異丙腎上腺素構(gòu)建大鼠心肌缺血模型，通過檢測(cè)心肌缺血后的大鼠血清中H-FABP的表達(dá)，探討H-FABP含量變化與心肌缺血后時(shí)間關(guān)系，評(píng)價(jià)與心肌缺血程度的關(guān)系。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組健康Wistar大鼠128只，雌雄不限，體重140～150 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(腹腔注射生理鹽水20 mg/kg)，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組(腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素10、20、40 mg/kg)，每組32只，隨機(jī)分配。

1.2 主要試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素購于上海禾豐有限公司，血液總蛋白提取試劑盒購于北京白泰克生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自Thermo公司，H-FABP和GAPDH羊抗鼠一抗購自Santa Cruz Biotechnology,Inc，PVDF膜購自北京索萊寶科技有限公司，紅外熒光染料標(biāo)記的驢抗羊二抗購自美國LI-COR公司，成像系統(tǒng)為統(tǒng)美國LI-COR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，圖像分析軟件為LI-COR公司開發(fā)的Odyssey。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺血大鼠模型的建立按照10、20、40 mg/kg計(jì)算，準(zhǔn)備藥物，每組每只大鼠所需注射鹽酸異丙腎上腺素的量，分別為1、2、4 ml，正常對(duì)照組即注射生理鹽水2 ml。注射后2 h做心電圖觀察。在用藥后第2、4、16、32小時(shí)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)在每組中分別隨機(jī)取出8只大鼠，挖眼球取血4 ml左右，置于無菌離心管中，用血液總蛋白提取試劑盒提取總蛋白。

1.3.2 Western印跡法檢測(cè)H-FABP表達(dá)將提取的大鼠血清總蛋白用BAC法測(cè)定蛋白濃度，體積按4∶1加5×上樣緩沖液混勻，根據(jù)測(cè)算的濃度確定30 μg為上樣量，換算出各自的實(shí)際上樣體積，用普通PCR儀煮沸5 min變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白(5%濃縮膠，12%中間膠，15%分離膠)，濃縮膠跑40 V的恒壓，分離膠跑80 V的恒壓，按照蛋白質(zhì)Marker切下H-FABP和GAPDH膠段，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2 h，PBS-T洗滌1次，5 min，分別加入1∶800稀釋的H-FABP羊抗鼠多克隆抗體和1∶1 000稀釋的羊抗鼠GAPDH多克隆抗體，室溫1 h，4℃過夜。PBS-T洗滌4次，每次5 min。在分別加入1∶10 000稀釋的紅外熒光染料標(biāo)記的驢抗羊二抗，室溫震搖2 h，PBS-T洗滌3次，每次5 min，PBS洗滌1次,10 min。美國LI-COR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描，采用Odyssey分析軟件進(jìn)行條帶灰度值的分析。每個(gè)樣本條帶與相對(duì)應(yīng)樣本GAPDH條帶的灰度值相比，求出其比值即為H-FABP的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1 大鼠心肌缺血模型構(gòu)建成功與正常對(duì)照組大鼠比較，各實(shí)驗(yàn)組注射鹽酸異丙腎上腺素后其心電圖出現(xiàn)典型的心肌缺血性改變(ST段抬高，T波倒置，病理性Q波)，劑量越大心肌缺血越嚴(yán)重，表明大鼠心肌缺血模型構(gòu)建成功。見圖1。

2.2 Western印跡法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血清H-FABP表達(dá)如圖2、表1所示，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清H-FABP含量在注射鹽酸異丙腎上腺素后2 h已有升高，4 h更高，藥物劑量增大血清H-FABP含量增高(P<0.05)，在心肌缺血后16 h已有下降，32 h

圖1　各組大鼠心電圖變化

1～4：正常對(duì)照組、低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組 圖2　 Western印跡檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn) 大鼠血清H-FABP表達(dá)

組別2ph16p2h正常對(duì)照組0.69±0.320.71±0.240.74±0.260.59±0.23低劑量實(shí)驗(yàn)組2.03±0.941)3.29±1.151)2)3)2.54±1.261)0.63±0.253)中劑量實(shí)驗(yàn)組3.36±1.221)4.37±1.361)2)3)2.73±1.151)1.12±0.463)高劑量實(shí)驗(yàn)組4.30±1.841)2)6.58±2.461)2)3)4.21±1.961)2)1.34±0.441)3)

與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組比較：1)P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)其他實(shí)驗(yàn)組比較：2)P<0.05，與同劑量組不同時(shí)間點(diǎn)比較：3)P<0.05

基本降至正常(P<0.05)，心肌缺血程度越嚴(yán)重，H-FABP含量越高(P<0.05)。

3討論

H-FABP是一種小分子量(約15 000)的胞質(zhì)蛋白，富含于心肌細(xì)胞內(nèi)，具有心肌特異性，與心肌細(xì)胞內(nèi)的長鏈脂肪酸相結(jié)合，將其從細(xì)胞質(zhì)膜向脂化和氧化部位運(yùn)輸，從而進(jìn)入能量代謝體系氧化分解，最終生成三磷酸腺苷，為心肌收縮提供能量〔4〕，由于心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧高度敏感〔5,6〕，當(dāng)心肌缺血時(shí)，需要?jiǎng)訂T脂肪酸供能，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)H-FABP迅速升高，又由于其分子量小，可快速釋放入血，其血漿濃度在心肌細(xì)胞因缺血受損后 1.5～3 h開始升高，6～8 h達(dá)峰〔1,2〕。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，提示血清H-FABP濃度可用于心肌缺血早期診斷。McCann等〔7〕在664 例因胸痛入院患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者在胸痛癥狀出現(xiàn)4 h內(nèi)檢測(cè)，其H-FABP診斷急性心肌梗死的敏感性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肌鈣蛋白T(cTnT)(73%比55%，P=0.043)，其特異性為71%，而其他心肌標(biāo)志物診斷急性心肌梗死的敏感性和特異性都未超過cTnT。Glatz等〔8〕通過研究也曾推薦H-FABP可作為急性心肌梗死早期診斷的心肌標(biāo)志物。本次研究還發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血后16 h已有下降，在32 h基本降至正常，此發(fā)現(xiàn)與Chan等〔9〕研究結(jié)果一致，他們通過代謝動(dòng)力學(xué)研究顯示H-FABP血漿濃度于梗死后早期快速升高并達(dá)到頂峰，但血漿濃度恢復(fù)正常的時(shí)間也相對(duì)早，只需要30 h，具有較高的敏感性。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽酸異丙腎上腺素劑量的增大，大鼠心肌細(xì)胞缺血越嚴(yán)重，通過Western印跡法檢測(cè)大鼠血清中H-FABP的含量亦是越高的，心肌缺血嚴(yán)重性增加，心肌梗死的面積相應(yīng)擴(kuò)大，表明H-FABP高低與心肌梗死面積大小是正相關(guān)的。臨床上AMI 后心肌梗死面積的評(píng)估對(duì)于預(yù)后判斷有著重要價(jià)值，梗死面積常通過一些間接方法估算，如心臟超聲(射血分?jǐn)?shù)，室壁運(yùn)動(dòng)異常)、心肌核素灌注顯像、心電圖的改變(累及的導(dǎo)聯(lián)數(shù))、 CK-MB峰值等。H-FABP在胸痛發(fā)作后迅速釋放入血并在較短時(shí)間內(nèi)清除，若按足夠的頻度采集標(biāo)本，可用于早期測(cè)定AMI 的梗死面積。Glatz等〔10〕和 Sohmiya等〔11〕的研究證實(shí)，應(yīng)用血漿H-FABP測(cè)定梗死面積與CK-MB、α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)測(cè)定梗死面積的相關(guān)性非常好，H- FABP的優(yōu)點(diǎn)在于比CK-MB、α-HBDH能更早地測(cè)定梗死面積，它們各自需要的時(shí)間是24、48、72 h。 另外，心力衰竭時(shí)由于心肌細(xì)胞相對(duì)缺血、缺氧，其結(jié)構(gòu)和功能都會(huì)發(fā)生改變，造成心肌損傷，而且心力衰竭越嚴(yán)重，這種損傷越明顯，加重心肌缺血，Komamura等〔12〕曾對(duì)92 例擴(kuò)張型心肌病患者進(jìn)行4年隨訪，觀察患者血漿H-FABP的濃度變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿H-FABP濃度≥5．4 ng/ml的患者與低于此濃度的患者相比，生存率明顯降低(P<0．000 1)。

總之，H-FABP作為靈敏的心肌缺血生化指標(biāo)，在AMI早期診斷，評(píng)估梗死面積等方面均有重要臨床價(jià)值，但由于存在時(shí)間窗，H-FABP檢測(cè)若能與CK、CK-MB、cTnI等標(biāo)志物結(jié)合應(yīng)用，臨床意義更大。

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〔2014-03-21修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)