黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4化學(xué)成分研究

楊秀芳，王鵬飛，馬養(yǎng)民（陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710021）

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黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4化學(xué)成分研究

楊秀芳，王鵬飛，馬養(yǎng)民
（陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710021）

摘 要：根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列對(duì)分離自黑果枸杞根部的內(nèi)生真菌RER4進(jìn)行鑒定，結(jié)果該真菌鑒定為米曲霉（Aspergillus oryzae）.采用大米固體培養(yǎng)基對(duì)RER4進(jìn)行發(fā)酵，利用多種色譜方法從乙酸乙酯提取物中分離純化得到8個(gè)化合物，借助ESI－MS、NMR等波譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)分別為：麥角甾醇（1）、尿黑酸內(nèi)酯（2）、6－檸檬酸甲酯（3）、琥珀酸（4）、1，5－檸檬酸二甲酯（5）、赤薛醇（6）、甘露醇（7）、阿拉伯糖醇（8）.其中化合物尿黑酸內(nèi)酯首次從米曲霉發(fā)酵物中分離得到.

關(guān)鍵詞：黑果枸杞；內(nèi)生真菌；米曲霉；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定

0　引言

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科枸杞屬植物［1］，是我國(guó)西北荒漠地區(qū)一種特有的野生植物資源［2］.據(jù)《四部藥典》、《晶珠本草》等藏藥經(jīng)典記載，其味甘，性平，用于治療心熱病，心臟病，月經(jīng)不調(diào)，停經(jīng)等病癥，屬于傳統(tǒng)藏藥［3］.

植物內(nèi)生真菌是一個(gè)多樣性十分豐富的生物類(lèi)群，其物種豐富，數(shù)量龐大，可產(chǎn)種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物［4］.現(xiàn)代研究表明，一些內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物具有與宿主植物代謝產(chǎn)物相同或相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，而有些則是具有藥用生物活性的其它代謝產(chǎn)物，且極有可能是未被開(kāi)發(fā)的新化合物［5］.因此，對(duì)這類(lèi)相對(duì)未被開(kāi)發(fā)的微生物資源進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離具有藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物及潛在生物活性的化合物不僅能夠豐富人類(lèi)的藥物寶庫(kù)，還能夠緩解由于過(guò)度開(kāi)采藥用植物帶來(lái)的資源危機(jī).因而引起人們的廣泛關(guān)注，成為目前研究的熱點(diǎn)之一.

對(duì)黑果枸杞內(nèi)生真菌研究?jī)H限于本課題組，分離得到81株內(nèi)生真菌［6］，其中對(duì)內(nèi)生真菌E21、R43已進(jìn)行分離研究［7，8］.本研究以一株分離自黑果枸杞根部的真菌米曲霉（Aspergillus oryza，編號(hào)RER4）為研究對(duì)象，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離，得到8個(gè)化合物.本研究完善了對(duì)黑果枸杞內(nèi)生真菌的研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用黑果枸杞內(nèi)生真菌奠定了一定的工作基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1 菌株

菌株RER4分離自甘肅省靖遠(yuǎn)縣的黑果枸杞植物的根部，經(jīng)純化培養(yǎng)后以PDA斜面培養(yǎng)基4℃保存于本實(shí)驗(yàn)室.四株活性測(cè)試細(xì)菌大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 儀器、培養(yǎng)基及試劑

AVANCEIII－400超導(dǎo)核磁波譜，瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司；Bruker－avanceⅢ－400Hz，德國(guó)布魯克公司；SGWX－4顯微熔測(cè)定儀，北京市科儀電光儀器廠(chǎng)；200－300目柱色譜硅膠，青島海洋化工廠(chǎng)；薄層色譜硅膠，青島海浪硅膠干燥劑廠(chǎng)；SephadexLH－20柱色譜凝膠，上海浩然生物技術(shù)有限公司.

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200.0g，葡萄糖20g，瓊脂18g，水1 000mL.察氏培養(yǎng)基：瓊脂1.5 ～2.0g，蔗糖3g，NaNO30.3g，K2HPO40.1g，KCl 0.05g，F(xiàn)eSO40.001g，MgSO4·7H2O 0.05 g，蒸餾水100mL，pH7.0～7.2.以上所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.3 內(nèi)生真菌的分離與純化

取黑果枸杞根部樣品，用自來(lái)水洗凈表面并晾干，用無(wú)菌水沖洗3遍，75%酒精浸泡2min，之后于2%的次氯酸溶液浸泡1min，隨后用75%酒精浸泡1min，再用無(wú)菌水清洗，用濾紙吸干表面水分備用.將組織切塊，置于PDA培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng).待菌絲長(zhǎng)出后，挑取尖端菌絲轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基上，幾次純化后得到共附生真菌并轉(zhuǎn)接到試管斜面上保存?zhèn)溆?

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將供試菌株RER4接種于PDA平板上，置于28℃培養(yǎng)3～7d，觀(guān)察記錄菌落、菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)基基底有無(wú)染色和孢子形態(tài)等特征，以其作為依據(jù)進(jìn)行鑒定［9］.

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

將活性菌株RER4接種于察氏液體培養(yǎng)基中，28℃、120rpm培養(yǎng)3d后過(guò)濾，過(guò)濾后得到菌絲體.利用CTAB法提取菌絲體基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度.以提取到的基因組DNA為模板，通過(guò)引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）以及ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）進(jìn)行擴(kuò)增目標(biāo)菌株18SrDNA區(qū)域.

PCR反應(yīng)體系為：Template（基因組DNA）0.5μL，5×Buffer（with Mg2＋）2.5μL，dNTP（各2.5 mM）1μL，ITS1（10μM）0.5μL，ITS4（10μM）0.5 μL，加雙蒸餾水至25mL.

PCR循環(huán)程序?yàn)椋?8℃進(jìn)行預(yù)變性3min，后在98℃下變性25s，在55℃下退火25s，72℃延伸1 min，持續(xù)30個(gè)循環(huán)后，72℃修復(fù)延伸10 min，4℃下終止反應(yīng)保存待用.

取5.0μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用EB（Ethidium bromide，溴化乙錠）染色，在1%瓊脂糖溶液中電泳，150V、100mA條件下觀(guān)察20min，記錄電泳結(jié)果.將PCR產(chǎn)物電泳條帶切割后，用PCR引物進(jìn)行測(cè)序.將得到的ITS序列在Genban（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進(jìn)行Blast分析，用MEGA5.0（鄰接法Neighbor－Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).對(duì)分離菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中登陸的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)關(guān)系進(jìn)行分析［10］.

1.5 發(fā)酵和代謝產(chǎn)物分離

1.5.1 內(nèi)生真菌的發(fā)酵

將活化后的菌株RER4接種在PDA培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基后，用打孔器制成直徑為6mm的菌餅，按每100mL察氏培養(yǎng)基中接種1個(gè)菌餅的量，接種2L，在28℃、120rpm的搖床中振蕩6d.將上述種子液按培養(yǎng)基10%的量加入滅菌后的大米培養(yǎng)基中，在室溫下靜置培養(yǎng)28d.

1.5.2 代謝產(chǎn)物的提取

將風(fēng)干的固體發(fā)酵物用乙酸乙酯萃取后減壓濃縮得240g提取物，提取物采用硅膠柱色譜分離，以石油醚、石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇、甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，得到5個(gè)組分（Fr.1－Fr.5）.

1.5.3 各組分抑菌試驗(yàn)

采用濾紙片法對(duì)上述5個(gè)組分進(jìn)行抑菌活性測(cè)試，結(jié)合化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定分離純化的組分，分離代謝產(chǎn)物.

1.5.4 代謝產(chǎn)物的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

在活性測(cè)試的基礎(chǔ)上，對(duì)活性高的組分以石油醚/乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，各組分多次使用硅膠柱層析、凝膠柱層析、重結(jié)晶等手段獲得單體純品化合物，所有化合物經(jīng)1H－NMR和13CNMR分析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，確定其結(jié)構(gòu).

2　結(jié)果與討論

2.1 菌株RER4的鑒定

首先對(duì)RER4進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定.其菌落外觀(guān)為黑褐色，邊緣為白色菌絲，在PDA培養(yǎng)基中無(wú)色素產(chǎn)生.顯微鏡下觀(guān)察，RER4菌絲發(fā)達(dá)多枝，具有大而飽滿(mǎn)的孢子囊，孢子密集而且易散落，因此初步確定內(nèi)生真菌為曲霉屬真菌（如圖1所示）.其次對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的ITS序列長(zhǎng)576bp，該序列與米曲霉（Aspergillus oryzae）序列（HQ285587.1）的同源性為99%，進(jìn)化樹(shù)（圖2）顯示，RER4與米曲霉聚在一支，支持率為100%.綜合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析結(jié)果，最終確定RER4為米曲霉（Aspergillus oryzae），Genbank登錄號(hào)為KF198066.

圖1　內(nèi)生真菌RER4形態(tài)學(xué)特征

圖2　基于18SrDNA－ITS序列的菌株RER4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

表1　RER4代謝產(chǎn)物不同組分抑菌活性

2.2 發(fā)酵提取物的抑菌活性

采用濾紙片法，將5個(gè)組分對(duì)4株細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1.測(cè)試結(jié)果表明：5個(gè)組分對(duì)4株細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中Fr.2、Fr.3以及Fr.4對(duì)于4株細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng).結(jié)合化學(xué)成分分析結(jié)果，確定Fr.2、Fr.3 和Fr.4為分離對(duì)象.

2.3 代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

從黑果枸杞內(nèi)生真菌RER4發(fā)酵物的乙酸乙酯萃取物Fr.2、Fr.4中共分離出8個(gè)單體化合物（Fr.3分離的化合物另行報(bào)道），利用波譜技術(shù)結(jié)合理化性質(zhì)對(duì)這8個(gè)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果如下：

（1）化合物1

白色針狀結(jié)晶（甲醇），mp：127.4℃～128.1℃，Lieberman－Burchard反應(yīng)為陽(yáng)性，1H－NMR （400 MHz，CDCl3）δ：3.66（1H，m，H－3），5.59 （1H，d，J＝3.2Hz，H－6），5.40（1H，t，J＝2.0Hz，H－7），0.65（3H，s，H－18），0.95（3H，s，H－19），1.05 （3H，d，J＝6.5 Hz，H－21），5.21（2H，m，H－22，23），0.85（6H，t，J＝6.4Hz，H－26，27），0.93（3H，d，J＝6.9Hz，H－28）；13C－NMR（100MHz，CDCl3）δ：38.38（C－1），31.99（C－2），70.47（C－3），40.79（C－4），139.79（C－5），119.59（C－6），116.29（C－7），141.40（C－8），46.23（C－9），37.03（C－10），21.12（C－11），39.07（C－12），42.82（C－13），54.56（C－14），23.01（C－15），28.32（C－16），55.70（C－17），12.06（C－18），17.63（C－19），40.47（C－20），21.12（C－21），135.58（C－22），131.97（C－23），42.82（C－24），33.09（C－25），9.67（C－26），19.98（C－27），16.29（C－28）.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的基本一致，故確定化合物1為麥角甾醇.結(jié)構(gòu)式如圖3所示.

（1）化合物2

圖3　麥角甾醇

橘色針狀晶體（甲醇），mp：137.2℃～139.5℃，負(fù)源HRESI－MS：m/z，［M－H］－＝149.023 9，提示化合物的分子量為150.031 6，推測(cè)化合物的分子式為C8H6O3，不飽和度為6.1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：3.85（2H，s，H－3），6.76（1H，d，J＝3.2 Hz，H－6），5.40（1H，t，J＝2.0 Hz，H－7），0.65（3H，s，H－18），0.95（3H，d，J＝2.4Hz，H－5），9.35（1H，s，6－OH），6.66（1H，dd，J＝8.6，2.4 Hz，H－7），6.97（1H，d，J＝8.6Hz，H－8）；13C－NMR （100 MHz，DMSO－d6）δ：33.73（C－2），112.26（C－3），147.18（C－4），114.60（C－5），110.99（C－6），154.32（C－7），125.57（C－8）.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道基本一致，結(jié)合HMBC確定化合物2為尿黑酸內(nèi)酯，其結(jié)構(gòu)如圖4所示.

圖4　尿黑酸內(nèi)酯

（3）化合物3

無(wú)色晶體（甲醇），mp：144.8～146.1℃，負(fù)源HRESI－MS：m/z，［M－H］－＝205.034 1，化合物的分子量為206.041 9，分子式為C7H10O7.1H－NMR （400 MHz，DMSO－d6）δ12.35（2H，brs，－COOH），5.53（1H，s，－OH），3.62（3H，s，－CH3O），2.78（2H，d，J＝15.2Hz，H－4），2.64（2H，d，J＝15.2Hz，H－2）.13C－NMR（100MHz，DMSO－d6）δ：171.59（C－1），43.46（C－2），73.37（C－3），43.46 （C－4），171.59（C－5），173.89（C－6），52.45（C－7）.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13，14］基本一致，故確定化合物3為6－檸檬酸甲酯，結(jié)構(gòu)如圖5所示.

圖5　6－檸檬酸甲酯

（4）化合物4

無(wú)色晶體（甲醇），mp：184.9℃～186.0℃，1H－NMR（400MHz，DMSO－d6）：δ12.16（1H，s，－COOH），2.42（2H，s，H－2，H－3）；13C－NMR （100MHz，DMSO－d6）：δ174.08（C－1，C－4），29.22 （C－2，C－3），化合物4的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道［15，16］的基本一致，故確定化合物4為琥珀酸，結(jié)構(gòu)如圖6所示.

圖6　琥珀酸

（5）化合物5

無(wú)色晶體（甲醇），mp：95.2℃～96.8℃.和化合物3的核磁譜圖區(qū)別在于1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）在δ3.57（6H，s）處給出了兩個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào).以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17，18］報(bào)道的基本一致，確定化合物5為1，5－檸檬酸二甲酯，其結(jié)構(gòu)如圖7所示.

圖7　1，5－檸檬酸二甲酯

（6）化合物6

無(wú)色晶體（甲醇），mp：125.2℃～126.5℃.1HNMR（400 MHz，DMSO－d6）δ4.38（4H，s，－OH），3.53（2H，m，H－2，H－3），3.36（4H，m，H－1，H－4）；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ72.51（C－2，C－3），63.28（C－1，C－4）.化合物6核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］報(bào)道的赤薛醇基本一致，結(jié)構(gòu)如圖8所示.

圖8　赤薛醇

（7）化合物7

白色粉末，mp：166.2℃～167.9℃.1H－NMR （400MHz，DMSO－d6）δ4.33（2H，t，J＝5.2 Hz，OH－1，6），4.41（2H，d，J＝5.2Hz，OH－2，5），4.14 （2H，d，J＝7.1Hz，OH－3，4），3.61（2H，m，H－2，H－5），3.54（2H，t，J＝7.7Hz，H－3，H－4），3.42（4H，m，H－1，H－6）；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ63.82（C－1，C－6），69.66（C－2，C－5），71.29（C－3，C－4）.化合物7的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］報(bào)道的甘露醇基本一致，故確定化合物7為甘露醇，結(jié)構(gòu)如圖9所示.

圖9　甘露醇

（8）化合物8

無(wú)色晶體（甲醇），mp：101.3℃～102.8℃.1HNMR（400MHz，DMSO－d6）：δ4.19（1H，d，J＝5.6 Hz，1－OH），4.42（1H，d，J＝5.6Hz，2－OH），4.45（1H，d，J＝5.6Hz，3－OH），4.32（1H，t，J＝5.6Hz，4－OH），4.12（1H，d，J＝6.8Hz，5－OH），3.66（1H，m，H－2），3.59（1H，m，H－3，），3.45（1H，m，H－4），3.29（H－1），3.41（H－5）.13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）：δ62.86（C－1），70.47（C－2），71.40（C－3），70.11（C－4），63.68（C－5）.以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］報(bào)道的阿拉伯糖醇基本一致，故確定化合物8為阿拉伯糖醇，結(jié)構(gòu)如圖10所示.

圖10　阿拉伯糖醇

3　結(jié)論

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析結(jié)果，把分離自黑果枸杞根部的內(nèi)生真菌RER4鑒定為米曲霉（Aspergillus oryzae）.從其固體發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取相中得到5個(gè)組分，抑菌試驗(yàn)表明，F(xiàn)r.2、Fr.3以及Fr.4對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用；從Fr.2及Fr.4中分離得到8個(gè)化合物，其中尿黑酸內(nèi)酯首次從米曲霉發(fā)酵物中分離得到，這一化學(xué)成分的獲得，表明植物內(nèi)生真菌具有豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物，是開(kāi)發(fā)新型藥物的重要來(lái)源，這對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用黑果枸杞植物資源奠定了基礎(chǔ).

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Chemical constituents of endophytic fungi RER4fromLycium ruthenicum

YANG Xiu－fang，WANG Peng－fei，MA Yang－min
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Key Laboratory of Auxiliary Chemistry ＆Technology for Chemical Industry，Ministry of Education，Shaanxi University of Science ＆Technology，Xi′an 710021，China）

Abstract：The fungus strain RER4isolated from the root of Lycium ruthenicum.Was identified as Aspergillus oryzae by its morphological characteristics and internal transcrised spacer （ITS）sequence analyses.Solid state fermentation was used to culture the endophytic fungi RER4on the rice medium，8compounds were isolated and purified from the eyhyl acetate extract of endophytic fungi RER4by various chromatographic methods and their structures were ergosterol，5－h(huán)ydroxy－benzofuran－2（3H）(－)one，3－h(huán)ydroxy－3(－)（methoxycarb onyl）pentanedi－oic acid，succinic acid，2－h(huán)ydroxy－4－methoxy－2(－)（2－meth oxy－2－oxoethyl）(－)4－oxobutanoic acid，erythritol，mannitol，adonitol by ESI－MS and NMR.Among compound 5－h(huán)ydroxybenzofuran－2（3H）(－)one was firstly isolated from the medium of Aspergillus oryzae.

Key words：Lycium ruthenicum；endophytic fungi；Aspergillus oryzae；chemical constituents；structural elucidation

作者簡(jiǎn)介：楊秀芳（1963－），女，陜西銅川人，教授，研究方向：天然產(chǎn)物加工

基金項(xiàng)目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（20116125110001）

收稿日期：2015－03－21

文章編號(hào)：1000－5811（2015）04－0121－06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：R932