牽張力對(duì)C2C12細(xì)胞株MEF2A基因表達(dá)的影響

劉春利，劉曉偉，肖丹娜，高輝

（1.天津市口腔醫(yī)院正畸科，天津300041；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，天津300162）

有些正畸治療尤其功能矯形治療或者正畸正頜聯(lián)合治療的病例，在治療后不僅硬組織發(fā)生改建，相應(yīng)的軟組織也需要發(fā)生適應(yīng)性改變，從而適應(yīng)新的功能環(huán)境。頜面部肌肉結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性改建是這些治療成功的一個(gè)關(guān)鍵因素[1-2]。機(jī)械牽張刺激對(duì)頜面部肌肉改建的影響與治療效果的維持關(guān)系密切，因此摸索合適的機(jī)械牽張刺激對(duì)于治療效果以及輔助矯治裝置的研發(fā)有重要意義。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子MEF2是一種調(diào)節(jié)肌肉特異性轉(zhuǎn)錄的基因，可以激活多種肌肉相關(guān)基因的表達(dá)，從而對(duì)肌肉組織的分化、維持和再生起重要作用[3]。MEF2A是其在骨骼肌中主要表達(dá)的亞型之一[4]，對(duì)MEF2A的研究是對(duì)骨骼肌細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制研究的重要組成部分。為了模擬機(jī)械牽張力對(duì)頜面部肌肉作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞加力裝置對(duì)C2C12細(xì)胞施加不同時(shí)間段相同力度的機(jī)械牽張刺激，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)加力刺激后C2C12細(xì)胞MEF2A的基因表達(dá)規(guī)律，初步探索0.5 Hz，加力板變形量2 000μstrain的牽張力對(duì)骨骼肌細(xì)胞的影響，為探索功能矯治的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑及儀器 C2C12細(xì)胞，DMEM/F12培養(yǎng)基，新生小牛血清(成都哈里生物工程有限公司 )，CO2孵箱（Forma Scientific.Inc.美國(guó)），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLY MPUS IX70），F(xiàn)orcel四點(diǎn)彎曲加力裝置（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院正畸與成都電子科技大學(xué)聯(lián)合研制），F(xiàn)TC2000實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀（加拿大楓嶺公司），Trizol（美國(guó)MRC公司），RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit（立陶宛 MBI公司），Gel Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司），引物合成及探針修飾（上海生物工程有限公司）。

1.2 小鼠成肌細(xì)胞株C2C12培養(yǎng)及加力

1.2.1 成肌樣細(xì)胞株C2C12的傳代培養(yǎng) 將成肌樣細(xì)胞株C2C12按1×107/L的密度，接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的中號(hào)玻璃培養(yǎng)瓶中，加入約10mL含10%新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于CO2孵箱(37℃，50mL/LCO2)。當(dāng)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層，鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底80%以上時(shí)，在無(wú)菌條件下傳代。用PBS液清洗培養(yǎng)瓶3次，加入25 g/L胰酶和22 g/LEDTA，室溫消化3～5min，加入含有10%新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按1×107/L密度分別置于各培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)隔天換液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分兩大組：第1組為空白對(duì)照組，第2組為加力組，每組按不同時(shí)段加力 1、2、4、8、12 h，每實(shí)驗(yàn)時(shí)段收集 3 個(gè)樣本。

1.2.3 四點(diǎn)彎曲加力裝置對(duì)C2C12細(xì)胞加力 將BD Falcon公司的75 cm2藍(lán)蓋斜頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶從中間剖開(kāi)，取細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)時(shí)用的底面（厚度1.15 mm），分成3 cm×8 cm大小兩塊，周緣平滑四角圓鈍，以避免加力過(guò)程中的應(yīng)力集中。洗凈加力用細(xì)胞培養(yǎng)板，滅菌后接種細(xì)胞。采用傳代后的C2C12細(xì)胞，按2×105密度接種于加力板上(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)種板)，然后將其放入培養(yǎng)皿中，貼壁6 h后加入含100mL/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，再將培養(yǎng)基換為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以同步化C2C12的細(xì)胞周期。采用Forcel四點(diǎn)彎曲體外細(xì)胞力學(xué)加載裝置對(duì)接種在加力板上的成肌樣細(xì)胞進(jìn)行加力，頻率0.5Hz，加力板變形量為2 000μstrain，對(duì)細(xì)胞按不同時(shí)間段施加周期性牽張力。各加力組重復(fù)3次（n＝3），加力結(jié)束后分別收獲細(xì)胞。

1.3 樣本采集 以PBS沖洗加力后細(xì)胞，無(wú)菌濾紙吸凈多余PBS液，然后原位裂解細(xì)胞，嚴(yán)格按照Invitrogen公司的TRIZOL試劑說(shuō)明書(shū)提取RNA，并收取RNA樣本置于經(jīng)DEPC水處理過(guò)的1.5mL離心管中，存放于-20攝氏度。

1.4 RT-PCR檢測(cè)MEF2A-mRNA的表達(dá)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 MEF2A上游引物：5′－CACGCTACATAGAAATGTGT－3′，下游引物：5′－CTTGAGTTTACAAATCCATT－3′，探針：CTGTAGTGCTCAACATCCCAC，該產(chǎn)物產(chǎn)生144bpcDNA片段；ATCB：上游引物：5′－GAAGATCAAGATCATTGCTCCT－3′，下游引物：5′－TACTCCTGCTTGCTGATCCA－3′，探針：5′－ CTGTCCACCTTCCAGCAGA－3′，該產(chǎn)物產(chǎn)生111BP cDNA片段。

1.4.2 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定RNA的濃度和純度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，30μL反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑：10×buffer3 μL，MgCl2(25mmol)3 μL，dNTP(25mmol)0.36 μL,PCR Forward Primer（10 μmol）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，探針（10 μmol/L）0.6 μL，Template 0.3 μL，ddH2O 18.74 μL。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：預(yù)變性：94℃、2min 1個(gè)循環(huán)；PCR 反應(yīng)：94 ℃、20 s，46 ℃、20 s，60 ℃、30 s 45 個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包，采用t檢驗(yàn)以及單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為有顯著性差別。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)際ACTB內(nèi)參和MEF2A相對(duì)分子質(zhì)量條帶 MEF2A與內(nèi)參照ACTB的實(shí)際電泳條帶和理論擴(kuò)增條帶基本一致，說(shuō)明二者的實(shí)際擴(kuò)增相對(duì)分子質(zhì)量與理論值基本相符。凝膠電泳檢查結(jié)果見(jiàn)圖1。同時(shí)，總RNA提取完整無(wú)降解，滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。見(jiàn)圖2。

圖1 ACTB和MEF2A擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶Fig 1 Electrophoresisbanding amplification productsof ACTB and MEF2A

2.2 對(duì)照組與加力組MEF2A基因表達(dá)比較 采用t檢驗(yàn)，相同時(shí)間段加力組與空白對(duì)照組相比，MEF2A基因表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05），采用單因素方差分析對(duì)加力組不同時(shí)間段MEF2A基因的表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)加力后各時(shí)間段MEF2A基因表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)牽張力誘導(dǎo)MEF2Am RNA表達(dá)（Ct值）比較Tab1 CompareMEF2A geneexpression affected by strain forcebetween different timegroups

組別 樣本數(shù) 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h空白組 15 6.90±0.605 6.45±0.491 6.91±0.314 6.99±0.340 6.01±0.439加力組 15 6.31±0.464 6.29±0.536 6.06±0.578 6.59±0.528 6.33±0.489

3 討論

在口周肌肉受到的各種刺激當(dāng)中，張力刺激尤為重要。因?yàn)榭谥芗∪飧街陬M骨上，當(dāng)咀嚼時(shí)或是戴用矯形裝置時(shí)，頜面部骨骼肌會(huì)因被拉伸而處于張力作用下，矯形治療中和治療后頜面部骨骼肌改建及其穩(wěn)定性與張力刺激有關(guān)。MEF2A廣泛存在于骨骼肌中，其DNA結(jié)合活性在骨骼肌中高度表達(dá)[5]，參與調(diào)控肌細(xì)胞的分化和肌肉特異性蛋白表達(dá)[6-7]，張力刺激對(duì)于MEF2A影響的研究是研究張力對(duì)于骨骼肌改建影響的重要組成部分。

本研究中采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀，此裝置采用梁變形原理，通過(guò)數(shù)控步進(jìn)電機(jī)使細(xì)胞培養(yǎng)板發(fā)生形變，以此對(duì)培養(yǎng)板表面的細(xì)胞產(chǎn)生恒定的周期性張力。曾有學(xué)者對(duì)細(xì)胞的多種施力方式進(jìn)行研究[8-9]，細(xì)胞可以耐受的應(yīng)變量約1 000μstrain～4 000μstrain[10]。本實(shí)驗(yàn)中采用低頻率（0.5Hz）2000μ strain大小的周期性張力，對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行加力，加力后用顯微鏡觀察加力板上的細(xì)胞，此力值在細(xì)胞所能承受力值范圍內(nèi)，而且該力下細(xì)胞的貼壁及生長(zhǎng)情況良好，脫落率極低，符合本實(shí)驗(yàn)的要求。

以往研究表明周期性牽張力作為一種有效刺激對(duì)牙周膜細(xì)胞、骨髓破骨細(xì)胞等均有影響[11-12]，而其對(duì)骨骼肌細(xì)胞的影響也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。為了探明周期性牽張力對(duì)骨骼肌改建的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，本研究選擇MEF2A作為研究對(duì)象，MEF2A是成肌因子中的一個(gè)重要分型，此次研究也為后續(xù)研究周期性牽張力對(duì)其它成肌因子的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)C2C12細(xì)胞在周期性張力作用下，MEF2A基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加力12 h以?xún)?nèi)MEF2A基因表達(dá)量與對(duì)照組比較和加力組各時(shí)間段橫向比較均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其表達(dá)量沒(méi)有隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，各相鄰加力時(shí)間之間MEF2A基因表達(dá)量未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示周期性牽張力在12 h以?xún)?nèi)不能以改變MEF2A基因表達(dá)的形式影響骨骼肌細(xì)胞。在矯形治療中，短時(shí)間的加力過(guò)程可能不足以引起頜面部骨骼肌的明顯改建，需要延長(zhǎng)治療中骨骼肌的受力時(shí)間，同時(shí)佐證了戴用功能矯治器建議每天戴用14 h以上甚至全天戴用[13]，才能保證治療效果，并需要延長(zhǎng)治療滿(mǎn)意后的效果保持時(shí)間。本次實(shí)驗(yàn)研究采用0.5Hz加力頻率，型變量為2 000μstrain，在生理范圍內(nèi)其他頻率和加力形變量對(duì)于C2C12的MEF2A基因表達(dá)的影響需進(jìn)一步研究。

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