綿陽荔枝草中總黃酮的提取及含量測定

摘要 [目的]提取及測定綿陽荔枝草中總黃酮的含量。[方法]用超聲波乙醇浸提法從荔枝草中提取黃酮類物質(zhì)，通過正交設(shè)計試驗，得出乙醇浸提法提取荔枝草中黃酮類化合物最佳試驗條件，并對提取的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行光譜掃描、顯色反應(yīng)等定性鑒定，用紫外分光光度法測定其含量。[結(jié)果]提取荔枝草中總黃酮的最佳工藝條件：60%乙醇為溶劑系統(tǒng)，料液比為1：30，在超聲波溫度為35 ℃下提取35 min，測得荔枝草中總黃酮的含量為1.20%，平均回收率為97.43%～100.17%。[結(jié)論]此方法采用全物理過程，無任何污染，是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑，為荔枝草的廣泛開發(fā)和利用提供一定理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 荔枝草；正交試驗法；總黃酮；提取工藝；含量測定

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）05-073-05

Extraction and Determination of the Content of Total Flavonoids in Salvia plebeia R.Br in Mianyang

LIU Xiaoyan （School of Chemistry and Chemical Engineering，Mianyang Normal University，Mianyang，Sichuan 621000）

Abstract [Objective] The research aimed to extract and determine the content of total flavonoids in Salvia plebeia R.Br.[Method] The flavonoids extracted from Salvia plebeia R.Br by the method of ultrasonic ethanol extraction and the orthogonal experiment，the optimal experimental conditions of the ethanol extraction extracted flavonoids from Salvia plebeia R.Br were obtained.And the content of the extracted compounds had been characterized by ultraviolet spectrophotometry.[Result] The optimum conditions of extracting total flavonoids from Salvia plebeia R.Br were as follows： the solvent was 60% ethanol； the ratio of material to liquid 1∶30； ultrasonic temperature 35 ℃； the optimum time was 35 min. The results shows the content determination of total flavonoids in Salvia plebeia R.Br was 1.20% and the average recovery rate was 97.43%-100.17%.[Conclusion] This method without any pollution， low cost， simple operation， provides a theoretical basis for the development and utilization of Salvia plebeia R.Br widely.

Key words Salvia plebeia R.Br；Orthogonal experiment；Total flavonoids；Extraction process； Content determination

作者簡介 劉曉燕（1965- ），女，四川德陽人，副教授，從事無機化學(xué)和環(huán)境化學(xué)研究。

收稿日期 20141229

荔枝草（Salvia plebeia R.Br）為唇形科雪見草的全草[1]，別名癩疙寶草，其性味苦、辛、涼，以全草入藥，為常用中藥，分布于印度、朝鮮、阿富汗、越南、日本、馬來西亞、緬甸、泰國以及中國大陸的青海、新疆、西藏、甘肅等地，多生在路旁、山坡、溝邊或田野潮濕的土壤上，目前已由人工引種栽培[2-3]。荔枝草具有抗氧化功能[4-5]，鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用[6]，抗病毒作用，治療肺癌作用；荔枝草性味微苦、涼，具有解毒消腫[7-8]、利濕止癢、清熱涼血等作用[9-10]。目前荔枝草的相關(guān)研究已有很多報道，包括化學(xué)成分、提取工藝[11-12]、藥理活性等的研究，但對綿陽荔枝草中總黃酮的提取及含量的測定尚未見報道。筆者采用超聲波乙醇浸提法，用紫外分光光度法以蘆丁為對照品，并對荔枝草根、葉中總黃酮的含量進(jìn)行測定，為荔枝草的廣泛開發(fā)和利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 1012A型恒溫干燥箱（上海滬南電爐烘箱廠）、KQ300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、T6新世紀(jì)紫外分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、微型高速萬能試樣粉粹機（湖北省黃驊新興電器廠）、SHD2000型循環(huán)水式多用真空泵（河南鞏義市英予華儀器廠）。

1.2 試劑 荔枝草（于2月份采自綿陽市游仙區(qū)）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；95%乙醇、無水乙醇、石油醚、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH，均為AR，成都市科龍化工試劑廠。

1.3 試驗方法 摘取新鮮荔枝草葉、根（綿陽市游仙區(qū)）→洗凈后陽光晾曬備用→分離根、葉→恒溫烘干（60 ℃）→粉碎→稱量→溶劑浸泡12 h（乙醇濃度、料比）→超聲波處理[13]（溫度、時間）→減壓抽濾→石油醚萃取→濃縮定容→稀釋→測定吸光度值→分析試驗結(jié)果。

1.3.1 原料處理。摘取新鮮荔枝草葉、根（綿陽市游仙區(qū)），洗凈后陽光晾曬備用，分離根、葉，用烘干箱在60 ℃下烘干，再用中草藥粉碎機粉碎。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置。準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品于小燒杯中，加入少量30%的乙醇溶液，使標(biāo)準(zhǔn)樣品的溶解，轉(zhuǎn)至100 ml容量瓶中，用30%的乙醇溶液定容至100 ml，即得0.1 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml于25 ml比色管中，加入0.7 ml 5%亞硝酸鈉溶液混合均勻，靜置7 min后再加入0.7 ml 10%硝酸鋁溶液混合均勻，靜置7 min后，加入5 ml 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻后用30%乙醇溶液定容至刻度線，再充分搖勻，靜置15 min，在波長為510 nm處比色測定各樣品液吸光度，試劑空白為參比液，在平行處理的條件下測定3次，求其平均值。

1.3.4 正交試驗設(shè)計。以提取溶劑系統(tǒng)即乙醇濃度、料液比、超聲波處理溫度、超聲波處理時間作為影響提取物中總黃酮含量的4個主要因素，其中乙醇濃度取4個水平，料液比、超聲波處理溫度、超聲波處理時間各取3個水平，選用L9（14×33）正交試驗表安排試驗，共108組，其中乙醇濃度為95%、80%、60%、0%，料液比為1∶10、1∶20、1∶30，超聲波處理時溫度為25、30、35 ℃，超聲波處理時間為15、25、35 min，超聲波處理功率100 W。稱取荔枝草根、葉各2 g，加入4種不同的溶劑系統(tǒng)，用3種不同料液比，平行操作條件下，在常溫下密封靜置浸泡12 h，分別在25、30、35 ℃不同溫度下進(jìn)行15、25、35 min不同超聲波時間處理，減壓抽濾后，用石油醚萃取3次后置于恒溫水箱中濃縮，在室溫下冷卻后轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶中，用30%乙醇溶液定容，再移取0.5 ml待測液于25 ml比色管中，按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定即可。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液作為橫坐標(biāo)、吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。用最小乘法進(jìn)行線性回歸分析得出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=12.543x+0.000 3（R2=0.999 9）。

2.2 正交試驗

2.2.1 溶劑系統(tǒng)的選擇。以不同的溶劑系統(tǒng)（溶劑濃度分別為95%、80%、60%、0%）作為影響因素，在平行操作條件下分別測定其稀釋液的吸光度，根據(jù)試驗稀釋的倍數(shù)計算得到其質(zhì)量濃度（表1）。由表1可知，溶劑系統(tǒng)對荔枝草總黃酮提取以60%的乙醇水溶液最佳選擇，用乙醇溶劑既可以提取出黃酮苷元又可以提取出黃酮苷，提取的產(chǎn)率更高。通過試驗現(xiàn)象可以看出，用水作溶劑系統(tǒng)時，試驗過程中發(fā)現(xiàn)過濾速度極慢，且水的極性大，還很容易把蛋白質(zhì)、糖類等溶于水的成分提取出來，不利于黃酮類物質(zhì)的提取。

2.2.2 料液比的選擇。以不同的料液比（1∶10、1∶20、1∶30）作為影響因素，在平行操作條件下分別測定其稀釋液的吸光度，根據(jù)試驗稀釋的倍數(shù)計算得到其質(zhì)量濃度（表2）。由表2可得，在料液比為1∶10、1∶20、1∶30的條件下處理，經(jīng)過1∶30處理后荔枝草提取溶液中總黃酮含量更高，由此可以得出提取荔枝草中總黃酮含量料液比以1∶30為最佳選擇。

2.2.3 超聲時間的選擇。不同的超聲時間（15、25、35 min）作為影響因素，在平行操作條件下分別測定其稀釋液的吸光度，根據(jù)試驗稀釋的倍數(shù)計算得到其質(zhì)量濃度（表3）。從表3可以得出，超聲波在15、25、35 min的條件下處理，經(jīng)過35 min處理后荔枝草提取溶液中總黃酮含量更高，由此可以得出提取荔枝草中總黃酮含量超聲波時間以35 min更為最佳選擇。

2.2.4 超聲溫度的選擇。以最佳溶劑系統(tǒng)60%乙醇、最佳料液比1∶30、最佳超聲時間35 min 的條件下，平行測定在不同超聲波溫度下，超聲波溫度對荔枝草中總黃酮含量的提取效果的影響，在平行操作條件下分別測定其稀釋液的吸光度，根據(jù)試驗稀釋的倍數(shù)計算得到其質(zhì)量濃度（表4）。從表4可以得出，超聲波在25、30、35 ℃的條件下處理，經(jīng)過35 ℃處理后荔枝草提取溶液中總黃酮含量更高，由此可以得出提取荔枝草中總黃酮含量超聲波溫度以35 ℃更為最佳選擇。

2.3 提取物的分析

2.3.1 提取物定性鑒定。

2.3.1.1 紫外光譜分析。黃酮類的化合物大部分具有C6C3C6的基本結(jié)構(gòu)，在240～400 nm紫外光譜下大多數(shù)黃酮類化合物具有2個吸收峰，在320～380 nm光譜帶Ⅰ是由B環(huán)取代基性質(zhì)決定，240～270 nm光譜帶Ⅱ是由環(huán)取代基性質(zhì)決定的。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在經(jīng)過加入亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉顯色處理后帶Ⅰ和帶Ⅱ轉(zhuǎn)移至450～510 nm和415～470 nm處，而在510 nm左右所提取的樣品圖譜（圖3）的吸收峰基本與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜（圖2）相似。

2.3.1.2 顯色反應(yīng)。黃酮類化合物基本碳架上含有堿性的氧原子，且絕大多數(shù)均是帶有酚羥基的衍生物，因此能夠與一些金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)或與一些較強的還原性試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。根據(jù)黃酮類化合物的這種特性可以對其樣品進(jìn)行定性鑒定。定性鑒定如下：①加中性醋酸鉛溶液。取1 ml待測溶液于小試管中，滴加幾滴中性醋酸鉛溶液，搖勻靜

止觀察顏色變化，溶液出現(xiàn)黃色粒狀沉淀。②鋅粉（+鹽酸）。取1 ml待測溶液于小試管中，加入適量鋅粉，滴加幾滴鹽酸，搖勻靜止觀察顏色變化，由黃色并轉(zhuǎn)至微紅。③三氯化鐵溶液。取1 ml待測溶液于小試管中，滴加幾滴三氯化鐵溶液，搖勻靜止觀察顏色變化，溶液呈墨綠色。④碳酸鈉溶液。取1 ml待測溶液于小試管中，滴加一定量碳酸鈉溶液水溶液，搖勻靜止觀察顏色變化，溶液呈亮黃色。⑤濃硫酸。取1 ml待測溶液于小試管中，滴加幾滴濃硫酸，搖勻靜止觀察顏色變化，由深黃色轉(zhuǎn)至橙紅色。⑥氫氧化鈉水溶液。取1 ml待測溶液于小試管中，滴加適量氫氧化鈉水溶液，搖勻靜止觀察顏色變化，溶液呈黃色。通過以上試驗證明是黃酮類物質(zhì)。

2.3.2 荔枝草葉、根總黃酮含量測定。在最佳試驗條件下，即60%乙醇為溶劑系統(tǒng)，料液比為1∶30，超聲波溫度為35 ℃超聲時間為35 min，對荔枝草根和葉進(jìn)行提取，在平行操作條件下分別測定其稀釋液的吸光度，根據(jù)試驗稀釋的倍數(shù)計算得到其質(zhì)量濃度（表5）。由表5可見，荔枝草不同部位總黃酮含量有一定差異，其中荔枝草根中的總黃酮含量大于它的葉中總黃酮含量。

2.3.3 加標(biāo)回收試驗。準(zhǔn)確稱取3份已知總黃酮含量的葉和根，并加入一定量蘆丁對照品0.050 0 g/L，按“1.3.3”制得樣品液，在510 nm波長測定樣品液的吸光度，進(jìn)行回收試驗。用回歸方程計算它的總黃酮含量。將一定的蘆丁加入荔枝草葉和根樣品液中做回收試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率分別為95.01%～98.97%、99.76%～100.53%（表6～7），均符合定量分析要求。

3 結(jié)論

用超聲波乙醇浸提法從荔枝草中提取黃酮類物質(zhì)，得出乙醇浸提法提取荔枝草中黃酮類化合物最佳試驗條件，并對提取的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行光譜掃描、顯色反應(yīng)等驗證，用紫外分光光度法測定其含量。結(jié)果表明，采用正交試驗得出提取荔枝草總黃酮的最佳試驗條件：60%乙醇為溶劑系統(tǒng)，料液比為1∶30，在超聲波溫度為35 ℃下提取35 min，測得荔枝草中總黃酮的含量為1.20%，平均回收率為97.43%～100.17%。且用超聲波乙醇浸提法，達(dá)到省時、高效、節(jié)能的目的，此方法采用全物理過程，無任何污染，是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑，為荔枝草的廣泛開發(fā)和利用提供一定理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯 黃小燕 責(zé)任校對 況玲玲