牙齦卟啉單胞菌脂多糖對人牙周膜細(xì)胞成骨分化能力的影響

薛 棟，蔣少云，鄧嘉胤，董允允，張 蕊

（天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科,天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，天津300070）

人牙周膜細(xì)胞（humanperiodontalliga mentcells,HPDLCs）是包括了成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及這些細(xì)胞的前體細(xì)胞或成體干細(xì)胞的特異性細(xì)胞群[1]，具有成纖維細(xì)胞樣和成骨細(xì)胞樣雙重特征，能夠維持牙周膜功能的穩(wěn)定，在細(xì)胞更新、組織修復(fù)以及組織再生中發(fā)揮重要的作用，具有干細(xì)胞的特性以及多向分化的潛能。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.g）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是牙周病重要的致病因子，其不僅能夠直接作用于牙周組織引起組織的破壞；同時(shí)，也是一種潛在的細(xì)胞活化因子，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌多種炎性因子，在牙周病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過體外P.gLPS刺激HPDLCs，觀察其對HPDLCs成骨分化的影響，同時(shí)探討P.gLPS對HPDLCs成骨分化的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青/鏈霉素、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；I型膠原酶、β-甘油磷酸鹽、地塞 米 松 、3 －（4，5 －dimethylthiazol－2 －yl）－2，5 －diphenyltetrazoliumbromide （MTT）、L-抗壞血酸（Sigma公司，美國）；PBS緩沖液；Trizol總RNA提取試劑（Invitrogen，美國）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、real-timePCR試劑盒（Promega，美國）；P.gLPS（Invivogen，美國）；5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate/nitrobluetetrazolium(BCIP/NBT)溶液（華興博創(chuàng)生物，中國）。

1.2 HPDLCs體外培養(yǎng)[2-3]經(jīng)患者知情同意，選取12～18歲因正畸治療需要拔除的新鮮健康的雙尖牙，PBS反復(fù)沖洗，刮取根中1/3牙周膜組織剪碎成1mm3小組織塊，采用I型膠原酶+組織塊法進(jìn)行HPDLCs的原代培養(yǎng)，待細(xì)胞從組織塊中爬出并達(dá)80%匯合時(shí)，進(jìn)行首次傳代，取第3～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。A組：含5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HPDLCs；B組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)（含10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 μg/mL維生素 C、1×10-8mol/L地塞米松、5%胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)液）培養(yǎng) HPDLCs；C 組：1μg/mLP.g LPS+成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測HPDLSCs的增殖能力 依照上述分組，將HPDLCs接種于每孔2×103個(gè)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板內(nèi)。每組分別設(shè)5個(gè)復(fù)孔，隔天換液。用0.5mg/mLMTT檢測細(xì)胞增殖活性，37℃孵育4h后，于波長490nm測各孔光密度（opticaldensity，OD）值。

1.3.3 堿性磷酸酶染色 將HPDLCs以5×104/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，棄原培養(yǎng)液，依照上述分組分別加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)7d后，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌2～3遍，每孔加入1mL BCIP/NBT工作液，室溫避光放置15min，PBS洗滌2～3遍，觀察染色情況。

1.3.4 茜素紅染色以及茜素紅半定量檢測 培養(yǎng)同上，第21天后吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌2～3遍，加入0.1%茜素紅（alizarinred-S），室溫放置 30min，PBS 清洗 2～3遍，拍照觀察。照相后，吸棄PBS，每孔加入1mL氯化十六烷吡啶，室溫放置15min，將溶液移入96孔板，150μL/孔，酶聯(lián)免疫檢測儀于波長562nm檢測OD值。

1.4 Real-timePCR檢測成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 分組同前。分別于第3、7及14天采用Trizol總RNA法提取各組細(xì)胞RNA，參照試劑盒說明書合成cDNA模版，用獲得的cDNA進(jìn)行real-timePCR檢測成骨相關(guān)基因：I型膠原蛋白（collagen1，COL1）、堿性磷酸酶（alkalinephophatase，ALP）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（runt-relatedtranscriptionfactor2，RUNX2）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）。其引物序列見表1。以GAPDH作為組內(nèi)對照，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法進(jìn)行處理。

表1 合成引物序列及聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物長度Tab1 Primerse quences and the length of poly merase chainreaction products

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用單因素方差分析（one-wayANOVA）對所得數(shù)據(jù)分別進(jìn)行方差分析，并用Bonferroni法進(jìn)行多樣本均數(shù)的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPDLCs的培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)5～9d時(shí)，組織塊周圍有細(xì)胞爬出，3周左右可達(dá)80%匯合。細(xì)胞呈長梭形、多邊形等，胞質(zhì)形成的突起向外呈放射狀（圖1）。

圖1 體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞（×100）Fig1 Humanperi odontalliga mentcell sculture dinvitro（×100）

2.2 HPDLCs的增殖能力 第3～5天，B組與C組的OD值低于A組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且B組與C組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。隨后，A、B及C3組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（圖2）。

2.3 P.gLPS刺激后堿性磷酸酶染色結(jié)果 第7天B組與C組的堿性磷酸酶活性均明顯強(qiáng)于A組，而且B組的染色最明顯（圖3）。

圖23 組不同培養(yǎng)條件下HPDLCs的增殖能力Fig2 Proliferation of HPDL Csinthreegroups

圖3 堿性磷酸酶染色Fig3 Alkaline phosphatas estaining

2.4 P.gLPS刺激后茜素紅染色和茜素紅半定量檢測的結(jié)果 21d后茜素紅染色，與A組相比，B組與C組均可見茜素紅染色陽性礦化結(jié)節(jié)形成（圖4）。茜素紅染色定量結(jié)果顯示，B組與C組的OD值均明顯增高（圖5），其差異與A組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但C組的OD值明顯低于B組，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 茜素紅染色Fig4 Alizarinre dstaining

2.5 P.gLPS刺激后real-timePCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平

2.5.1 COL1mRNA的表達(dá) 在第3、7、14天，與A組相比，B組與C組COL1表達(dá)均升高（P<0.05），而C組較B組COL1表達(dá)降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 6）。

圖5 茜素紅染色定量檢測Fig5 Quantitative detection of alizarinre dstaining

圖6 Real-timePCR測定COL1mRNA水平Fig6 The expression of COL1mR NAinHPDLCs

2.5.2 ALPmRNA的表達(dá) 在3、7、14d，與 A組相比，B組與C組ALP表達(dá)均升高（P<0.05）；但在3d時(shí)，B組與C組間ALP表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而在7d及14d時(shí)，C組ALP表達(dá)明顯低于B 組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）（圖 7）。

圖7 Real-timePCR測定ALPmRNA水平Fig7 The expression of ALPmR NAin HPDLCs

2.5.3 RUNX2mRNA的表達(dá) 與A組相比，B組與C組RUNX2表達(dá)明顯升高（P<0.05），且呈時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間的延長其表達(dá)更明顯；同時(shí)C組較B組 RUNX2表達(dá)顯著降低（P<0.05）（圖8）。

圖8 Real-timePCR測定RUNX2mRNA水平Fig8 The expression of RUNX2m RN Ain HPDL Cs

2.5.4 OCNmRNA的表達(dá) 3d時(shí)，與A組相比，B組與C組OCN表達(dá)升高，但兩兩比較時(shí)C組與A組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），B組與A組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），C組較B組OCN表達(dá)明顯減少（P<0.05）；在7d及14d，B組與C組OCN表達(dá)均較A組升高（P<0.05），而且C組較B組OCN表達(dá)明顯減少（P<0.05）（圖 9）。

圖9 Real-timePCR測定OCNmRNA水平Fig9 The expression of OCNm RNAin HPDL Cs

3 討論

牙周膜細(xì)胞是牙周及根尖周組織中的主要細(xì)胞成分，其在牙周支持組織的發(fā)育、修復(fù)以及再生的過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明HPDLCs具有成骨的能力，能表達(dá)較高的ALP水平，產(chǎn)生較高的與礦化相關(guān)蛋白質(zhì)及I型膠原等[4]，因此牙周膜細(xì)胞被認(rèn)為是研究牙周組織修復(fù)重建的重要細(xì)胞之一。本研究通過ALP染色、茜素紅染色以及成骨相關(guān)基因的檢測進(jìn)一步證實(shí)了牙周膜韌帶細(xì)胞具有成骨分化的能力。

張鳳秋等[5]研究牙周優(yōu)勢菌內(nèi)毒素對HPDLCs增殖的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)P.gLPS濃度小于0.1μg/mL時(shí)促進(jìn)HPDLCs增殖，濃度在1μg/mL時(shí)對細(xì)胞增殖無明顯影響，而當(dāng)其濃度大于10μg/mL時(shí)則可抑制HPDLCs的生長。同時(shí)也有研究表明P.gLPS濃度低于0.1μg/mL時(shí)對HPDLCs既無增殖也無抑制作用，而濃度達(dá)1μg/mL時(shí)對HPDLCs有明顯抑制作用[6]。筆者前期實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)P.gLPS濃度為10μg/mL可明顯抑制HPDLCs的增殖，這與部分學(xué)者的報(bào)道一致[5-6]。而1μg/mLP.gLPS對細(xì)胞增殖無明顯影響。為排除細(xì)胞增殖的改變對細(xì)胞分化結(jié)果的影響，本研究以此濃度建立炎癥狀態(tài)下細(xì)胞骨向分化模型。

ALP是參與骨等礦化組織代謝以及再生的標(biāo)志性酶，其表達(dá)的增多或降低是決定骨礦化程度是否良好的關(guān)鍵條件[7]。本實(shí)驗(yàn)通過ALP染色以及實(shí)時(shí)定量PCR顯示，當(dāng)P.gLPS刺激后，ALP的mRNA表達(dá)較單純成骨誘導(dǎo)組降低，從而導(dǎo)致ALP活性下降，提示P.gLPS降低了HPDLCs成骨分化的礦化程度，從而影響了牙周組織的修復(fù)及改建過程。

COL1是成骨細(xì)胞分化過程中的重要基質(zhì)，為組織的礦化提供基礎(chǔ)。從筆者的研究結(jié)果顯示，P.g LPS降低COL1的表達(dá)，使得細(xì)胞分化、組織礦化過程中的礦化基質(zhì)降低，從而干擾礦化過程。茜素紅染色結(jié)果顯示礦化結(jié)節(jié)在P.gLPS刺激下明顯減少，可能是由于礦化基質(zhì)的減少所致。Viale-Bouroncle等[8]研究結(jié)果顯示，COL1促進(jìn)牙囊細(xì)胞表達(dá)ALP，但是不刺激其礦化過程。因而推測，在本研究中ALP的下降有可能與COL1降低有關(guān)，但因細(xì)胞的種類不同需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞的成骨分化是由特定的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。在非成骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中過表達(dá)RUNX2能夠誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，RUNX2作為成骨特異性激活因子，在成骨細(xì)胞發(fā)育、分化以及骨形成與重建過程中起到重要的作用[9-11]。在P.g LPS刺激后細(xì)胞中RUNX2的表達(dá)明顯下降，從而干擾了細(xì)胞的成骨向分化。

OCN是骨組織中最豐富的非膠原蛋白，能夠反映骨形成的速率，是骨細(xì)胞活性和骨代謝的特異性指標(biāo)；其維持骨正常的礦化速率，抑制異常羥基磷灰石結(jié)晶的形成，抑制軟骨的礦化速率[12-14]。Pacios等[15]研究伴放線桿菌引起的牙周炎癥糖尿病動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，在使用抗生素治療后OCN表達(dá)升高，說明在炎性狀態(tài)下，OCN的水平降低，導(dǎo)致牙周骨組織的形成減少，阻礙了正常的骨改建過程。本實(shí)驗(yàn)中，P.gLPS刺激能使OCNmRNA的表達(dá)較單純成骨誘導(dǎo)組降低，可見P.gLPS干擾了HPDLCs的成骨礦化過程，降低了其骨形成的速率。

炎性微環(huán)境下HPDLCs的成骨分化功能受多方面調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥組織來源的PDLCs成骨分化能力較健康組織來源的PDLCs明顯降低[16]。Gilbert等[17]發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-a）可能通過作用于胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）I，骨形成蛋白（bonemorphogenic proteins，BMP）-6 或骨骼肌 LIM蛋白（skeletal LIM protein，LMP）-1表達(dá)的遠(yuǎn)端，從而抑制細(xì)胞的成骨分化。在我們課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)P.g LPS能刺激人牙齦成纖維細(xì)胞分泌TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[18]，而且其他學(xué)者也證實(shí)牙周致病菌及P.g LPS能刺激HPDLCs分泌 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-8[19]，筆者推測，可能是P.g LPS改變了HPDLCs生存的微環(huán)境，產(chǎn)生了過多的炎性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子對細(xì)胞的成骨分化產(chǎn)生抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過研究HPDLCs在炎性狀態(tài)下成骨分化能力的變化，提出炎性狀態(tài)下外界刺激可能通過負(fù)調(diào)節(jié)HPDLCs中骨相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制其成骨分化能力，進(jìn)一步降低牙周組織的自我修復(fù)和重建能力，從而說明了消除炎癥是促進(jìn)牙周組織再生的必需條件。

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