線粒體乙醛脫氫酶2突變型基因的心肌保護(hù)作用

張?jiān)?jiān)，金周晟，陳鴻飛，吳一泉，徐旭仲

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　麻醉科，浙江　溫州　325015；2.北京阜外醫(yī)院　小兒心臟外科，北京100037）

線粒體乙醛脫氫酶2突變型基因的心肌保護(hù)作用

張?jiān)?jiān)1，2，金周晟1，陳鴻飛1，吳一泉1，徐旭仲1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325015；2.北京阜外醫(yī)院小兒心臟外科，北京100037）

目的：觀察施行心臟手術(shù)的患者，攜帶線粒體乙醛脫氫酶2（ALDH2）突變型基因?qū)π募∪毖俟嘧p傷的保護(hù)作用。方法：將北京阜外醫(yī)院小兒心臟外科71例施行法洛四聯(lián)癥根治術(shù)的患者根據(jù)ALDH2基因型檢測(cè)結(jié)果分成2組：突變型組（攜帶ALDH2*2突變型基因）和野生型組（攜帶ALDH2*1野生型基因）。收集術(shù)中切除的右心室流出道心肌組織，采用分光光度計(jì)法檢測(cè)ALDH2酶活性，丙二醛（MDA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量。體外循環(huán)升主動(dòng)脈開放后20 h取血檢測(cè)心肌肌鈣蛋白值（cTnI）。結(jié)果：突變型組患者術(shù)中缺血心肌組織毒性醛類MDA含量更低（P=0.013），心肌保護(hù)物質(zhì)GSH含量更高（P=0.011），并且突變型組患者術(shù)后有更低的cTnI值（P=0.015），更短的術(shù)后住院時(shí)間（P=0.017）。結(jié)論：攜帶ALDH2突變型基因可以明顯降低術(shù)中缺血心肌組織毒性醛類物質(zhì)的堆積，提高心肌組織GSH含量，并且具有更好的臨床預(yù)后，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

線粒體乙醛脫氫酶2；心臟手術(shù)；缺血再灌注損傷；心肌保護(hù)

1.1一般資料 選擇2014年2月-2014年12月在北京阜外醫(yī)院施行法洛四聯(lián)癥根治術(shù)的患者71例，手術(shù)均由一位主任醫(yī)師主刀完成。所有病例均無術(shù)前呼吸支持及術(shù)前正性肌力藥物的使用史，排除術(shù)中需主動(dòng)脈二次阻斷以及術(shù)后并發(fā)嚴(yán)重感染的病例。所有病例均經(jīng)由北京阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并簽署患者家屬知情同意書。根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，將實(shí)驗(yàn)分為2組：突變型組（攜帶ALDH2*2突變型基因）26例，男16例，女10例；野生型組（攜帶ALDH2*1野生型基因）45例，男29例，女16例。2組患者年齡、體質(zhì)量、主動(dòng)脈騎跨率、室間隔缺損大小、術(shù)前經(jīng)皮氧飽和度、體外循環(huán)時(shí)間、主動(dòng)脈阻斷時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　2組患者臨床資料比較

表1　2組患者臨床資料比較

項(xiàng)目　　突變型組（n=26）野生型組（n=45）　P年齡（月）　10.0± 3.0　11.0± 4.0　0.166體質(zhì)量（kg）　8.7± 1.4　9.5± 2.6　0.141主動(dòng)脈騎跨率（%）　45.0± 4.0　44.0± 4.0　0.734室間隔缺損大?。╩m）　12.3± 2.5　11.5± 2.2　0.337術(shù)前經(jīng)皮氧飽和度（%）　82.0± 6.0　83.0± 5.0　0.431體外循環(huán)時(shí)間（min）　117.0±21.0　123.0±24.0　0.328主動(dòng)脈阻斷時(shí)間（min）　81.0±22.0　91.0±27.0　0.118

1.2基因測(cè)序 患者麻醉后經(jīng)由深靜脈導(dǎo)管取血1 mL，EDTA抗凝，-80 ℃低溫冰箱保存。采用等位基因特異性PCR法檢測(cè)ALDH2基因型［7］。主要過程如下：將患者靜脈血使用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，提取物于4 ℃保存，獲取DNA后通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的DNA片段，擴(kuò)增引物上游5’-AAAATAAAGACTTTGGG GCAATA-3’，下游5’-CTTAAAATGGGAAATTAGTAGGAA AC-3’，按模板DNA 2 μg 2*MasterMix 25 μL（包括0.1 uTaqDNA Polymerase，500 mmol Tris-Hcl pH 8.7，20 mmol KCl，4 mmol MgCl），引物2 μL，雙蒸水補(bǔ)足配成50 μL反應(yīng)體系，在ABI7000熒光定量PCR儀上擴(kuò)增，先95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，最后4 ℃收集產(chǎn)物保存，目標(biāo)片段長(zhǎng)度200 bp。使用DNA純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）通過反復(fù)吸附、離心等步驟收集DNA?；驕y(cè)序我們使用ABI3730x1毛細(xì)管測(cè)序儀（北京博尚生物科技有限公司），根據(jù)ALDH2基因多態(tài)性關(guān)鍵SNP位點(diǎn)突變G-A，通過分析測(cè)序圖確定ALDH2野生型基因和突變型基因。

1.3標(biāo)本收集和檢測(cè)

1.3.1心肌組織：收集法洛四聯(lián)癥根治術(shù)中切除的患者右心室流出道心肌組織，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法分別從2組患者心肌組織中隨機(jī)抽取15例樣本，使用分光光度計(jì)法分別檢測(cè)ALDH2酶活性以及MDA、GSH含量［8］。通過裂解、震蕩、離心等步驟制備樣品，使用分光光度儀檢測(cè)計(jì)算。

1.3.2血液cTnI：2組患者分別均在體外循環(huán)升主動(dòng)脈開放后20 h經(jīng)由頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管取血2 mL，使用Bayer ACS 180檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)cTnI值，檢測(cè)試劑由Bayer公司提供。

1.4術(shù)后住院時(shí)間 查閱患者術(shù)后病歷資料，記錄2組患者術(shù)后住院時(shí)間。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血液cTnI值 突變型組為（14.87±4.05）ng/ mL，野生型組為（17.46±4.68）ng/mL，突變型組顯著低于野生型組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.015）。

2.2心肌組織ALDH2酶活性、MDA、GSH含量 ALDH2酶活性2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.214），MDA含量突變型組顯著低于野生型組（P=0.013）。GSH含量突變型組顯著高于野生型組（P=0.011）。見表2。

表2　2組患者心肌組織檢測(cè)結(jié)果比較（n=15，

表2　2組患者心肌組織檢測(cè)結(jié)果比較（n=15，

與野生型組比：aP＜0.05

組別　ALDH2活性（U/mg）MDA含量（μg/mg）GSH含量（nmol/mg）突變型組　0.58±0.15　3.02±0.83a　0.31±0.05a野生型組　0.60±0.12　3.74±1.18a　0.20±0.06a

2.3術(shù)后住院時(shí)間 術(shù)后住院時(shí)間≥14 d的例數(shù)突變型組（為1例）顯著少于野生型組（共12例），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。

3　討論

ALDH2酶是醛類代謝的關(guān)鍵酶，并且在心肌組織中高度表達(dá)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)LDH2酶活性可以降低大鼠心肌缺血損傷，其機(jī)制與ALDH2酶代謝缺血心肌中的毒性醛類物質(zhì)有關(guān)［9］。也有研究通過大鼠轉(zhuǎn)基因人ALDH2突變型基因，發(fā)現(xiàn)攜帶ALDH2突變型基因的大鼠心肌更能耐受缺血再灌注損傷［10］。在臨床上，對(duì)于攜帶不同ALDH2基因型人群，是否存在上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的差異，是本研究的重點(diǎn)。

我們之所以選擇法洛四聯(lián)癥患者，是因?yàn)樵摷膊∈桥R床上較常見的先天性心臟病，且具有較為統(tǒng)一的解剖缺陷基礎(chǔ)。術(shù)中我們收集到了施行法洛四聯(lián)癥手術(shù)患者右室流出道切除的心肌組織，進(jìn)行了MDA和GSH含量的檢測(cè)分析。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，相對(duì)于活性氧自由基具有更長(zhǎng)的半衰期以及更強(qiáng)的心臟毒性［11］，它的高低間接反映了心肌細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，是評(píng)價(jià)心肌損傷的常用指標(biāo)［12］。本研究中突變型組MDA含量顯著降低，說明突變型組心肌組織中能夠產(chǎn)生損傷的毒性物質(zhì)更少。GSH對(duì)防止心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展有著非常重要的作用，其通過直接消除氧自由基、抑制鈣超載、抗凋亡等作用產(chǎn)生心肌保護(hù)［13］，突變型組心肌組織GSH含量顯著增加。

在本研究中我們觀察到ALDH2突變型基因攜帶患者，在經(jīng)過體外循環(huán)心肌缺血再灌注打擊后，心肌損傷程度更低，具有更良好的臨床預(yù)后。cTnI是目前臨床上評(píng)價(jià)心肌損傷的特異性以及敏感性最高的指標(biāo)，術(shù)后4～6 h升高，20 h左右達(dá)到最高值，術(shù)后20 h對(duì)cTnI值的檢測(cè)可以作為心臟手術(shù)圍術(shù)期并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［14］。術(shù)后住院時(shí)間的長(zhǎng)短也能客觀地反映患者術(shù)后的恢復(fù)情況，在北京阜外醫(yī)院施行法洛四聯(lián)癥根治手術(shù)的患者平均住院天數(shù)是7～10 d，≥14 d被認(rèn)定為出院延遲。在本實(shí)驗(yàn)中，突變型組病例術(shù)后20 h cTnI值、術(shù)后住院天數(shù)≥14 d的比率均顯著高于野生型組。這些臨床資料表明突變型組預(yù)后較好。

然而，我們?cè)诩〗M織ALDH2酶活性的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，野生型組和突變型酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.214），這與正常生理情況下不同基因型編碼酶的活性有顯著差異的情況不同?？赡茉蚴牵后w外循環(huán)導(dǎo)致術(shù)中心肌的缺血損傷，并且產(chǎn)生大量的醛類物質(zhì)堆積，醛類物質(zhì)對(duì)ALDH2有很強(qiáng)的抑制作用，ALDH2的抑制又使其對(duì)醛類物質(zhì)的代謝減少，進(jìn)而又加重醛類物質(zhì)對(duì)ALDH2活性的抑制作用，產(chǎn)生惡性循環(huán)，再加上術(shù)中低溫環(huán)境對(duì)ALDH2酶活性的干擾［15］，最終導(dǎo)致野生型和突變型組在心肌ALDH2酶活性比較上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。那么ALDH2突變型基因是通過哪種物質(zhì)誘導(dǎo)GSH表達(dá)增加進(jìn)而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的？這為我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)埋下了伏筆，我們亦將對(duì)該機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

總之，我們通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攜帶ALDH2突變型基因?qū)w外循環(huán)術(shù)后心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制毒性MDA含量，增加保護(hù)物質(zhì)GSH含量有關(guān)?；谠摪l(fā)現(xiàn)，在臨床上將來有可能針對(duì)攜帶不同ALDH2基因型患者，采取不同的術(shù)前“預(yù)處理”，個(gè)體化治療，以期達(dá)到對(duì)圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)。

［1］Roger VL， Go AS， Lloyd-Jones DM， et al. Heart disease and stroke statistics—2011 update: a report from the American Heart Association［J］. Circulation， 2011， 123（4）: e18-e209.

［2］Hill BG， Bhatnagar A. Beyond reactive oxygen species: aldehydes as arbitrators of alarm and adaptation［J］. Circ Res，2009， 105（11）: 1044-1046.

［3］Churchill EN， Disatnik MH， Mochly-Rosen D， et al. Timedependent and ethanol-induced cardiac protection from ischemia mediated by mitochondrial translocation of εPKC and activation of aldehyde dehydrogenase 2［J］. J M Cell Cardiol，2009， 46（2）: 278-284.

［4］Contractor H， St?ttrup NB， Cunninqton C， et al. Aldehyde dehydrogenase-2 inhibition blocks remote preconditioning in experimental and human models［J］. Basic Res Cardiol，2013， 108（3）: 343.

［5］Brooks PJ， Enoch MA， Goldman D， et al. The alcohol flushing response: an unrecognized risk factor for esophageal cancer from alcohol consumption［J］. PLoS Med， 2009， 6（3）: e50.

［6］Budas GR， Disatnik MH， Mochly-Rosen D. Aldehyde dehydrogenase 2 in cardiac protection: a new therapeutic target？［J］. Trends Cardiovasc Med， 2009， 19（5）: 158-164.

［7］張?jiān)?jiān)， 龔丁旭， 陳偉， 等. 線粒體乙醛脫氫酶基因突變型對(duì)人心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 41（4）： 340-342.

［8］唐純志， 賴新生， 楊君軍， 等. 電針對(duì)老年性癡呆大鼠腦內(nèi)SOD、MDA、GSH-Px影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 陜西中醫(yī)， 200 5，26 （2）： 180-181.

［9］Chen CH， Budas GR， Churchill EN， et al. Activation of aldehyde dehydrogenase-2 reduces ischemic damage to the heart［J］. Science， 2008， 321（5895）: 1493-1495.

［10］ Endo J， Sano M， Katayama T， et al. Metabolic remodeling induced by mitochondrial aldehyde stress stimulates tolerance to oxidative stress in the heart［J］. Circ Res， 2009， 105 （11）: 1118-1127.

［11］ Hill BG， Bhatnaqar A. Beyond reactive oxygen species: al-dehydes as arbitrators of alarm and adaptation［J］. Circ Res，2009， 105（11）: 1044-1046.

［12］ Eaton P， Li JM， Hearse DJ， et al. Formation of 4-hydroxy-2-nonenal-modified proteins in ischemic rat heart［J］. Am J Physiol， 1999， 276（3 Pt 2）: H935-943.

［13］ Singh A， Lee KJ， Lee CY， et al. Relation between myocardial glutathione content and extent of ischemia-reperfusion injury ［J］. Circulation， 1989， 80（6）: 1795-1804.

［14］ Ahn KT， Choi JO， Lee GY， et al. Usefulness of high-sensitivity troponin I for the monitoring of subclinical acute cellular rejection after cardiac transplantation［J］. Transplant Proc， 2015， 47（2）: 504-510.

［15］ 趙曙光， 趙子牛， 倪樂丹， 等. 體外循環(huán)溫度對(duì)冷晶體停搏液心肌保護(hù)效果的影響［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2002， 32（4）：233-234.

（本文編輯：胡苗苗）

Effect of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 genotype on cardio-protection in patients with ischemia-reperfusion injury

ZHANG Yujian1，2， JIN Zhousheng1， CHEN Hongfei1， WU Yiquan1， XU Xuzhong1. 1.Department of Anesthesiology， the First Affiliated of Hospital Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015；2.Center for Pediatrict Cardiac Surgery， Fuwai Hospital， Beijing， 100037

Objective: To investigate the protection of human mitochondrial aldehyde dehydrognase 2 gene mutations for patients undergone cardiopulmonary bypass （CPB）. Methods: A prospective cohort of TOF patients （n=71） was recruited to investigate the influence of the ALDH2*2 allele on cardio-protection after surgical repair. The patients were divided into 2 groups: ALDH2*2 （n=45） and ALDH2*1 （n=26）. The right atrial appendage was harvested. ALDH2 activity， MDA and GSH were analysed. The cTnI was tested 20 hours later after the surgery. The time in hospital were recorded. Results: ALDH2*2 carriers showed highter GSH. ALDH2*2 carriers showed lower MDA， cTnI， and shorter postoperative length of hospital stay. Conclusion: ALDH2*2 allele has a myocardial protection effect after ischemic reperfusion injury， it may associated with greater expression of GSH level.

human mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2； cardiopulmonary bypass； ischemic reperfusion injury； myocardial protection

Q319.1

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.006

1資料和方法

2015-04-07

張?jiān)?jiān)（1984-），男，福建古田人，住院醫(yī)師，碩士。

徐旭仲，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：xuzhong@263.net。

心肌缺血再灌注損傷是導(dǎo)致心臟手術(shù)高風(fēng)險(xiǎn)、高病死率的常見原因［1］，臨床上需要一種新的心肌保護(hù)方案來降低心臟手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。目前研究證實(shí)醛類是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的重要原因，因此機(jī)體對(duì)醛類物質(zhì)的代謝顯得尤為重要［2］。線粒體乙醛脫氫酶2（ALDH2）是醛類代謝的關(guān)鍵酶［3］，人編碼ALDH2酶的基因在504位點(diǎn)上存在單核苷酸多態(tài)性，由此導(dǎo)致突變型基因（編碼酶活性降低或喪失）和野生型基因（編碼酶活性正常）的差異［4］。40%的東亞人攜帶突變型基因［5］，這部分人群是否會(huì)由于編碼的酶活性降低導(dǎo)致對(duì)醛類物質(zhì)代謝減少，加重缺血心肌損傷，目前還沒有定論［6］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過收集施行法洛四聯(lián)癥根治術(shù)患者心肌組織，檢測(cè)心肌氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)丙二醛（MDA）和心肌保護(hù)通路關(guān)鍵因子還原型谷胱甘肽（GSH）含量，結(jié)合患者術(shù)后住院時(shí)間，觀察攜帶突變型基因的心肌保護(hù)作用。