平陽霉素化療對口腔鱗癌bcl－xl、Bak蛋白表達的影響

張永寬，薛振恂，王興強，王維璽，荊歡歡

平陽霉素是廣泛用于治療口腔鱗狀細胞癌的化療藥物，有效率較高，但也有很多的不良反應(yīng)。在臨床工作中，有的患者接受了大劑量的平陽霉素治療，但化療效果卻不佳，表現(xiàn)出較強的耐藥性。因此，研究平陽霉素對口腔鱗癌化療的耐藥機制，具有很重要的意義。bcl－xl及Bak基因口腔癌中重要的凋亡調(diào)控基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及多耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究檢測平陽霉素對口腔鱗癌bcl－xl及Bak蛋白表達水平的影響，探討平陽霉素對口腔鱗癌化療的機制。

1 資料與方法

1.1 納入標準及分組 納入標準：①接受平陽霉素術(shù)前誘導(dǎo)化療的口腔鱗癌病例；②患者接受平陽霉素化療前未接受過其他化療或放療。

病例分組：按WHO化療療效標準分為：①有效組：完全緩解（CR：腫瘤完全消失）和部分緩解（PR：腫瘤最大直徑及其最大的垂直橫徑的乘積縮小50%以上）；②無效組：穩(wěn)定（SD）：腫瘤兩徑乘積縮小不足50%或增大不足25%，進展（PD）：腫瘤兩徑乘積增大超過25%或出現(xiàn)新病灶。無效組作為對照組。

根據(jù)上述條件篩選出用藥前后的標本蠟塊每組均為20對，用藥前后的同一患者的蠟塊標本為一配對樣本。

1.2 一般資料 取自第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院及解放軍第150中心醫(yī)院病理科，共40例。有效組：20 例，其中男 11 例，女 9 例；年齡（54.5±6.4）歲；體質(zhì)量（61.3±4.0） kg；部位：頰黏膜 1 例，舌部 5 例，牙齦11例，腭部2例，唇部1例；病理分級：Ⅰ級13例，Ⅱ級7例；生長方式：外生型17例，潰瘍型3例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期9例；給藥方式：肌肉注射12例，靜脈注射8例；最終劑量（165±60）mg。 無效組：20例，其中男 13例，女 7例；年齡（55.3±5.3）歲；體質(zhì)量（60.6±6.3） kg；部位：頰黏膜 3例，舌部8例，牙齦6例，腭部3例；病理分級：Ⅰ級11例，Ⅱ級9例；生長方式：外生型15例，浸潤型2例，潰瘍型3例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期10例；給藥方式：肌肉注射13例，靜脈注射7例；最終劑量（147±63） mg。

1.3 主要試劑與儀器 兔抗人bcl－xl多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗人Bak多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組化SABC試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司）；微波爐（格蘭仕公司）；石蠟切片機（AO820德國）；光學(xué)顯微鏡 （OLYMPUS日本）；顯微照相系統(tǒng)（OLYMPUS 日本）。

1.4 免疫組化染色步驟

1.4.1 bcl－xl染色步驟 按照博士德公司 SABC免疫組化試劑盒的步驟操作：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度乙醇溶液水化，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性（37℃，10 min），用微波法進行抗原修復(fù)（95～100 ℃，15 min）， 自然冷卻后 PBS 洗 5 min×3次，用10%正常山羊血清封閉（37℃，20 min），滴加1∶50 的兔抗人 bcl－xl一抗。4℃過夜后 37℃復(fù)溫 1h，PBS 5 min×3次，然后滴加1∶100的生物素標記二抗（37 ℃，20 min），PBS 洗 5 min×3 次，滴加 1∶100 的辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素（37℃，20 min），PBS洗5 min×4次，DAB顯色劑顯色10 min后終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，封片。陰性對照：用PBS代替一抗工作液。

1.4.2 BAK染色步驟 按照博士德公司SABC免疫組化試劑盒的步驟操作：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度乙醇溶液水化，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 （37℃，10 min）， 胰蛋白酶抗原修復(fù)（0.1%，pH 7.8，37 ℃，10 min），PBS 洗 5 min×3 次，用10%正常山羊血清封閉 （37℃，20 min）， 滴加1∶50的兔抗人BAK一抗。4℃過夜后37℃復(fù)溫1 h，PBS洗5 min×3次，然后滴加1∶100的生物素標記二抗（37 ℃，20 min），PBS 洗 5 min×3 次，滴加 1∶100 的辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素（37℃，20 min），PBS洗5 min×4次，DAB顯色劑顯色10 min后終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水透明，封片。陰性對照：用PBS代替一抗工作液。

1.5 分析及統(tǒng)計學(xué)方法 用顯微鏡觀察結(jié)果，隨機取五個視野，記數(shù)陽性細胞率及染色強度，然后按下列方法計算該切片的積分：陽性細胞比例積分：0～4% ：0，5%～25% ：1，26%～50% ：2，51%～75% ：3，76%～100%：4。染色強度積分：陰性：0，弱陽性：1，中度陽性：2，強陽性：3。記分方法：如一切片中有20%強陽性細胞，35%中度陽性細胞，10%弱陽性細胞，其積分為：陽性率20%時的積分1×強陽性積分3＋陽性率35%時的積分2×中度陽性積分2＋陽性率10%時的積分1×若陽性積分1＝8。每一對數(shù)據(jù)為一配對資料，用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 均衡性檢驗 有效組和無效組患者在年齡、體重、給藥方式及總劑量等方面未見顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 平陽霉素對有效組標本中 bcl－xl、Bak蛋白表達的影響

2.2.1 平陽霉素對 bcl－xl蛋白表達的影響 在治療前的標本中，bcl－xl蛋白表達強陽性的為9例，中度陽性的為6例，弱陽性為3例，陰性為2例。而治療后的標本中可見bcl－xl蛋白表達明顯降低，中度陽性為10例，弱陽性為6例，陰性為4例。用SPSS19.0進行配對樣本t檢驗后認為具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2.2 平陽霉素對Bak蛋白表達的影響 治療前的標本中，有4例為強陽性，7例為中度陽性，8例為弱陽性，1例為陰性。在治療后的標本中，有5例為強陽性，9例為中度陽性，4例為弱陽性，2例為陰性。用SPSS19.0進行配對樣本t檢驗，結(jié)果為治療前后無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 平陽霉素對無效組標本中 bcl－xl、Bak蛋白表達的影響

2.3.1 平陽霉素對無效組標本中 bcl－xl蛋白表達的影響 在治療前的標本中，bcl－xl蛋白表達強陽性的為7例，中度陽性的為8例，弱陽性為4例，陰性為1例。而治療后的標本中強陽性的為6例，中度陽性為10例，弱陽性為2例，陰性為2例。用SPSS19.0進行配對樣本t檢驗，結(jié)果認為治療前后無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3.2 平陽霉素對無效組標本中Bak蛋白表達的影響 治療前的標本中，有3例為強陽性，6例為中度陽性，7例為弱陽性，4例為陰性。在治療后的標本中，有4例為強陽性，8例為中度陽性，5例為弱陽性，3例為陰性。用SPSS19.0進行配對樣本t檢驗，結(jié)果認為治療前后無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

bcl－2蛋白家族在調(diào)節(jié)細胞程序性死亡中起到中樞作用，包括抑制凋亡和促進凋亡成員。抑制凋亡有 bcL－2、bcl－xL、bcl－w、mcl－1，促進凋亡有 Bax、Bak、Bik、Noxa 及 Bim。 bcl－xL 是 bcl－2 基因家族的重要成員，是高度保守的基因，它可通過不同的剪接機制產(chǎn)生兩個大小不同、作用相反的mRNA。其中長型 mRNA（bcl－xl）編碼 223 個氨基酸殘基，比短型mRNA（bcl－xs）編碼的氨基酸多63個，而這63個氨基酸與bcl－2蛋白有73%的同源區(qū)域，bcl－xl蛋白的功能與bcl－2相似，能與Bax、Bak等蛋白形成異二聚體，中和Bax、Bak的促凋亡作用，從而抑制細胞凋亡。bcl－xl是獨立于bcl－2蛋白以外的抑制凋亡的蛋白，與bcl－2蛋白具有拮抗性的表達。bcl－xl在長壽命的正常細胞和腫瘤細胞中表達，有文獻報道bcl－xl是口腔鱗癌中表達的主要抑凋亡蛋白［1］。

Bak是bcl－2基因家族Bax亞系的又一促凋亡基因，它編碼一個由216個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，與 bcl－2 蛋白有 28%的同源性，含有 BH1、BH2、BH3 功能區(qū)，BH3 是連接 bcl－2、bcl－xl的部分，被認為是死亡配體，能與bcl－2、bcl－xl結(jié)合后影響其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。它能與bcl－2、bcl－xl形成異二聚體，與 bcl－xl聚合的作用更強，從而中和 bcl－2、bclxl的抑凋亡作用， 也能不依賴于與 bcl－2、bcl－xl形成異二聚體的作用而獨自發(fā)揮促凋亡的作用［2］。

目前有研究表明化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡伴隨著bcl－2基因家族表達的改變，通過改變該家族各基因表達的平衡來影響細胞凋亡。Jones等［3］研究發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的卵巢細胞癌A2780細胞凋亡伴隨著Bak蛋白表達水平的上調(diào)，Liu等［4］發(fā)現(xiàn)用紫杉醇誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細胞的凋亡伴隨著bcl－xl mRNA和蛋白表達的下調(diào)和Bak蛋白的上調(diào)，Christensen等［5］研究凋亡調(diào)控機制時用博來霉素作用于肝細胞，發(fā)現(xiàn)博來霉素誘導(dǎo)的肝細胞凋亡伴隨著 bcl－2、bcl－xl蛋白表達的下調(diào)，及 p53、Bak、Bax蛋白表達的上調(diào)。Zhao等［6］的研究表明，苦丁茶多酚在體外能顯著誘導(dǎo)BcaCD885腫瘤細胞的凋亡，并能上調(diào) caspase－3、caspase－8、caspase－9、Fas/FasL、Bax、p53、p21、E2F1、p73 和 下 調(diào) bcl－2、bclxL、HIAP－1、HIAP－2 基因及蛋白的表達。Luo 等［7］研究二甲雙胍對口腔鱗癌的作用時，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能顯著下調(diào)bcl－2和bcl－xL蛋白的表達，下調(diào)Bax蛋白的表達。

該研究通過對平陽霉素治療前后的兩組口腔鱗狀細胞癌標本的免疫組織化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)有效組中平陽霉素能使口腔鱗癌細胞中bcl－xl蛋白的表達下調(diào)，對Bak蛋白的表達沒有影響。而對無效組中的bcl－xl、Bak蛋白的表達沒有影響。有研究證明bcl－xl的蛋白表達水平和其mRNA水平具有顯著的相關(guān)性［8］，因此，平陽霉素是否能使 bcl－xl的mRNA的表達也相應(yīng)下調(diào)，尚需進一步研究證明。

bcl－xl能夠保護由 p53 介導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡［9］。很多細胞凋亡誘發(fā)因素能使線粒體外膜斷裂，而線粒體外膜的不連續(xù)導(dǎo)致細胞色素C由線粒體釋放到細胞質(zhì)，線粒體上的bcl－xl蛋白能阻止細胞色素C的釋放，并能使細胞通過阻止線粒體膜的電位下降適應(yīng)生長因子去除或藥物的作用［10］。從而抑制細胞的凋亡。而且bcl－xl蛋白能直接特異性的與細胞色素C結(jié)合，bcl－xl蛋白高表達的細胞中的細胞色素C減少。通過阻止細胞質(zhì)內(nèi)的細胞色素C的有效性，bcl－xl蛋白能有效地阻止細胞凋亡的發(fā)生［11］。有關(guān)實驗表明：bcl－xl能有效地增強腫瘤對化療藥物的耐受性［12］，有人用反義 bcl－xl核酸下調(diào) bcl－xl的表達，來提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［13］。而本實驗的結(jié)果表明：平陽霉素在化療過程中顯著地降低了bcl－xl蛋白的表達，可能降低了腫瘤對化療藥物的耐受性，因此導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡。

該研究結(jié)果表明有效組中平陽霉素能有效地下調(diào)bcl－xl蛋白的表達水平，可能誘導(dǎo)了口腔癌細胞的凋亡，是否是平陽霉素對口腔鱗癌化療的機制之一，還需要進一步研究。

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