含植物提取物固體飲料中總黃酮的檢測

高麗霄，林漢卿，劉梅森，臧成國（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東深圳518109）

含植物提取物固體飲料中總黃酮的檢測

高麗霄，林漢卿，劉梅森*，臧成國
（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東深圳518109）

摘要：建立一種簡單、準確度高、適用性強的方法，用于檢測含植物提取物固體飲料中總黃酮的含量。對樣品處理的提取溶劑濃度、超聲時間、提取料液比進行優(yōu)化，并對該測定方法低濃度范圍內(nèi)的標準曲線及測定方法的精密度和準確度進行分析。樣品最佳處理條件為：提取溶劑為70%乙醇，超聲時間30 min，提取料液比1∶2.5（g/mL），該方法的RSD在1.03%～7.83%范圍內(nèi)，精確度較好，平均加樣回收率為98.44%，標準曲線在低濃度0～20 μg/mL范圍內(nèi)的線性方程為Y=0.012 7X-0.002 4，R=0.999 3，線性關(guān)系良好。該法操作簡單，對于含植物提取物固體飲料中總黃酮的測定適用性好，準確度高，可為固體飲料中總黃酮測定方法標準的制定提供參考。

關(guān)鍵詞：總黃酮；測定；分光光度法；植物提取物固體飲料

固體飲料產(chǎn)品是指以糖、乳或乳制品、蛋或蛋制品、果汁或植物提取物等為原料，添加適量的輔料或食品添加劑制成的固體制品[1]。市場為了迎合國內(nèi)外追求健康、回歸自然的消費觀念，將衛(wèi)生部公布的藥食兩用天然植物原料越來越多地應用于固體飲料中。黃酮是天然植物的代表性功效成分，它是具有苯駢吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物的總稱，總黃酮的含量常作為含植物提取物固體飲料的評價指標[2]。總黃酮測定方法主要為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和分光光度法[3-6]。HPLC法測定需要多種標準對照品，且檢測過程復雜，分光光度法根據(jù)同類物質(zhì)經(jīng)顯色后在在同一波長下具有共同吸收來測定樣品中含量，只需一種對照品，操作簡單快速，耗費低，因此，目前現(xiàn)行有效的食品、藥品或保健品標準中總黃酮測定方法主要是以蘆丁作為標準對照品，采用分光光度計法進行測定[7-10]。但這些標準針對含植物提取物固體飲料中總黃酮的檢測還存在問題如下：（1）樣品取樣量偏低，標準曲線總黃酮濃度范圍偏高。固體飲料產(chǎn)品屬于普通食品，其中添加的植物提取物一般為水提取的比例提取物，且與其他配料混合后，總黃酮含量較低，而現(xiàn)行有效的藥典或保健食品標準針對的產(chǎn)品屬于藥品或保健品，總黃酮含量較高，在測定時樣品取樣量低，普遍在0.15 g～1.5 g之間，若直接引用這些標準會造成含植物提取物固體飲料中總黃酮檢測值不在標準曲線的適宜范圍內(nèi)，因此需降低標準曲線范圍，增大取樣量，并選擇合適的料液比，使產(chǎn)品中總黃酮被充分提取[11-12]。（2）現(xiàn)行標準中提取總黃酮的有機溶劑濃度不適宜，造成產(chǎn)品測試液為濁液，無法通過分光光度計測定。含植物提取物固體飲料產(chǎn)品中糖分含量普遍較高，且有可能添加經(jīng)過處理的蛋白類成分或脂類成分，按照現(xiàn)有的總黃酮檢測標準操作后，可能會造成溶液粘度大，過濾分離困難，且測試液為乳濁液等問題，因此需優(yōu)化提取總黃酮的有機溶劑溶度，并采用超聲處理使得產(chǎn)品中總黃酮充分溶出[13]。（3）現(xiàn)有標準中樣品總黃酮測定的操作具有特征性和針對性，不具有廣泛應用性[14-16]。如《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中總黃酮測定須經(jīng)聚酰胺層析柱純化，而針對成分復雜且黃酮含量低的產(chǎn)品，可能存在吸附和解吸不徹底等問題，造成檢測值偏差較大[12]；而國家標準《柑橘類水果及制品中總黃酮含量的測定》中，總黃酮測定標準品選用了橙皮苷，不具有普遍性[16]。針對以上問題，本研究對含植物提取物固體飲料中總黃酮測定的處理條件進行優(yōu)化，以期得到準確度和重現(xiàn)性好、適用性強的總黃酮測定方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物提取物固體飲料：購自當?shù)爻?；蘆丁標準對照品：廣州藥檢所；5%亞硝酸鈉溶液（避光保存）；4%氫氧化鈉溶液；10%硝酸鋁溶液；無水乙醇，國產(chǎn)分析純。

AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；752-P紫外可見分光光度計：上海現(xiàn)科儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHA-B水浴恒溫振蕩器：金壇市岸頭良友實驗儀器廠；HRX-30C超聲波發(fā)生器：深圳市慧冉超聲設(shè)備有限公司。

1.2測定方法

1.2.1標準曲線的制備

蘆丁標準品儲備液：稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品100 mg，用適量稀乙醇溶液加熱溶解，冷卻至室溫后，定容至100 mL；準確移取上述溶液5.0 mL 于100 mL容量瓶中，加稀乙醇溶液定容，搖勻，備用。

準確移取蘆丁標準品儲備液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、10.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加水至10 mL，添加1 mL亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再加入1 mL硝酸鋁溶液，繼續(xù)靜置6 min后，加10 mL氫氧化鈉溶液并用水定容至刻度，靜置15 min。以未加蘆丁標準品儲備液為空白對照，在波長500 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2樣品處理

精確稱取適量樣品，置于錐形瓶中，用一定量稀乙醇溶液溶解，密封，超聲處理后，在30℃下回旋振蕩浸提10 h，靜置過夜后過濾，濾液進行減壓濃縮，濃縮液定容于25 mL容量瓶中作為待測液。

1.2.3樣品的測定

取待測液10 mL，添加1 mL亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再加入1 mL硝酸鋁溶液，搖勻，繼續(xù)靜置6 min后，加10 mL氫氧化鈉溶液并用水定容至刻度，靜置15 min，在波長500 nm處測定吸光度，同時，以不添加硝酸鋁溶液配制空白液。

1.2.4樣品處理工藝優(yōu)化

研究提取溶劑濃度、超聲時間、提取料液比對測定結(jié)果的影響，并選出最優(yōu)的樣品處理條件。

1.2.5測定方法的精密度、準確度分析

1.3計算公式

樣品中總黃酮的含量（X）按下列公式計算：

式中：X為樣品中總黃酮含量，mg/kg；A為由標準曲線所得總黃酮含量，μg/mL；M為樣品量，g；V1為待測液的體積，mL；V2為配制測試液吸取的待測液體積，mL；V3為配制的測試液總體積，mL；

2　結(jié)果與分析

2.1乙醇濃度的選擇

黃酮類化合物常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等。但由于甲醇、丙酮等的毒性較大，因此提取黃酮一般采取乙醇作為溶劑，乙醇的濃度在50%～100%之間。

稱取20 g樣品于錐形瓶，分別溶于50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液50 mL，超聲處理15 min，在30℃下回旋振蕩浸提10 h，靜置過夜后過濾，濾液進行減壓濃縮，濃縮液定容于25 mL容量瓶中作為待測液進行測定。測定結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同乙醇濃度所得測試液Fig.1　The effect of ethanol concentration on detecting solution

測定結(jié)果表明：當乙醇濃度為50%～60%時，提取液過濾分離困難，且測試液為乳白色液體，無法通過分光光度法測定，原因可能是樣品中含有一定量經(jīng)處理的蛋白類成分，乙醇濃度較低時，乙醇溶液中的水分會將蛋白類成分提取出來，造成測試液不澄清透亮，因此，無法測得結(jié)果；當乙醇濃度為80%～100%時，測試液加入氫氧化鈉后變?yōu)闈嵋?，原因可能是植物提取物固體飲料成分復雜，含有葡萄糖、麥芽糊精、可溶性膳食纖維、蛋白質(zhì)等多種成分，在含水量較低的堿性環(huán)境下，整個體系不穩(wěn)定，可能發(fā)生了絡合等現(xiàn)象，造成測試液為濁液，無法測定黃酮含量，具體原因有待進一步研究；在乙醇濃度為70%時，測試液為澄清溶液，可進行吸光度測定，因此選擇乙醇濃度為70%。2.2超聲時間的選擇

植物提取物固體飲料成分復雜，不同產(chǎn)品制備過程迥異，這些原因均會影響總黃酮的溶出。超聲波可產(chǎn)生的強烈振動、空化效應和攪拌等特殊作用，可加速有效成分的溶出，因此，對樣品進行超聲處理，可充分提取產(chǎn)品中總黃酮，提高測定的準確性。

稱取20g樣品于錐形瓶，溶于70%乙醇溶液50mL，分別超聲處理15、20、25、30、35、40 min后，在30℃下回旋振蕩浸提10 h，靜置過夜后過濾，濾液進行減壓濃縮，濃縮液定容于25 mL容量瓶中作為測試液進行測定。測定結(jié)果如圖2所示。

圖2　超聲時間的選擇Fig.2　The optimization of ultrasonic time

在超聲時間15 min～30 min內(nèi)，隨著超聲時間的延長，吸光值不斷升高，在超聲時間30 min～40 min范圍內(nèi)，吸光值趨于穩(wěn)定，統(tǒng)計學上無顯著性差異，因此可以選擇超聲時間為30 min。

2.3提取料液比的選擇

稱取20 g樣品于錐形瓶，分別按料液比1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶7.5、1∶10（g/mL）溶于70%乙醇溶液中，超聲處理30 min后，在30℃下回旋振蕩浸提10 h，靜置過夜后過濾，濾液進行減壓濃縮，濃縮液定容于25 mL容量瓶中作為測試液進行測定。測定結(jié)果表明：當料液比為1∶1（g/mL）時，樣品與溶劑無法充分接觸，總黃酮無法充分溶于溶劑中；當料液比在1∶5（g/mL）～1∶10（g/mL）時，由于植物提取物固體飲料的主要成分是葡萄糖、麥芽糊精等低聚糖，隨著料液比的提高，這些糖分的提取率亦不斷升高，最后所得測試液中糖分含量升高，造成測試液粘稠且混濁，得到的吸光值不穩(wěn)定，結(jié)果見表1；料液比為1∶2.5（g/mL）時，溶出的糖分量低，適宜測定，因此選擇料液比為1∶2.5（g/mL）。

表1　不同料液比測試結(jié)果Table 1　The result of different ratio of solid to liquid

2.4蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線見圖3。

圖3　總黃酮測定標準曲線Fig.3　The standard curve of flavonoids determination

由于植物提取物固體飲料中總黃酮含量較低，而測試液中糖分含量很高，無法進行有效濃縮，因此須建立低范圍的標準曲線，實驗表明蘆丁含量在低濃度0～20 μg/mL之間線性良好，符合朗伯-比爾定律，其回歸方程為Y=0.012 7X-0.002 4，相關(guān)系數(shù)R=0.999 3。

2.5精密度試驗

在優(yōu)化的樣品處理條件下，對5種不同植物提取物固體飲料樣品進行測定，并計算相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表2。

表2　精密度測定結(jié)果Table 2　The result of precision

該方法的RSD值在1.03%～7.83%范圍內(nèi)，精密度良好。

2.6準確度實驗

在優(yōu)化的處理條件下，制得待測液，然后向待測液中加入濃度為50 μg/mL的蘆丁標準品溶液0.8、1.0、1.2 mL，測得結(jié)果見表3，該方法的平均回收率為98.44%。

表3　準確度測定結(jié)果Table 3　The result of recovery

2.7檢出限

參照相關(guān)文獻[17-18]，得到本法的檢出限為1.0 μg/mL。

3　結(jié)論

本研究優(yōu)化的含植物提取物固體飲料總黃酮測定方法為：精確稱取一定量樣品，置于錐形瓶中，按料液比1∶2.5（g/mL）加入70%稀乙醇溶液溶解，密封，超聲處理30 min，在30℃下回旋振蕩浸提10 h，靜置過夜后過濾，濾液進行減壓濃縮，濃縮液定容于25 mL容量瓶中作為待測液進行測定。

蘆丁在低濃度0～20 μg/mL范圍內(nèi)，標準曲線線性方程為Y=0.012 7X-0.002 4，R=0.999 3，線性關(guān)系良好。本法測定總黃酮的相對標準偏差為1.03%～7.83%，平均回收率為98.44%。該方法簡便、準確度較高，是測定固體飲料總黃酮較為理想的方法之一，能廣泛應用于含植物提取物固體飲料的檢測中。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.042

收稿日期：2014-04-12

作者簡介：高麗霄（1985—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：健康食品。

*通信作者

Study on the Determination of Total Flavonoids in Solid Drink with Plant Extract

GAO Li-xiao，LIN Han-qing，LIU Mei-sen*，ZANG Cheng-guo
（Shenzhen Weicky Biotechnology Co.，Ltd.，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

Abstract：A more applicable and accurate method was developed to determine the total flavonoids in solid drink with plant extract by spectrophotometric method in this study.The effects of the concentration of solvent，

ultrasonic time and ratio of solid to liquid on the determination of total flavonoids were studied.The standard curve in low rutin concentration and the precision and accuracy of that method were analyzed.The optimum conditions were as follow：the concentration of solvent was 70%ethanol，the ultrasonic time was 30 min and the ratio of solid to liquid was 1∶2.5（g/mL）.Under this condition，this method showed good linearity（Y=0.0127X-0.002 4，R=0.999 3）in low rutin concentration（0-20 μg/mL）and average recovery（98.44%）as well as low RSD（1.03%-7.83%）.This simple method was regarded to be very useful and high accuracy for the determination of total flavanoids in solid drink with plant extract.

Key words：total flavonoids；determination；spectrophotometric method；solid drink with plant extract