端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在胃癌組織中的表達及臨床意義

劉麗覃宇周葛蓮英

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1內(nèi)鏡室，2胃腸外科；3廣西醫(yī)科大學研究生學院

臨床研究

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在胃癌組織中的表達及臨床意義

劉麗1，3覃宇周2葛蓮英1

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1內(nèi)鏡室，2胃腸外科；3廣西醫(yī)科大學研究生學院

目的探討端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）在胃癌組織中的表達并分析其臨床意義。方法以實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測胃癌組織中hTERT mRNA的表達，同時用MaxVisionTM即用型快速免疫組化一步法檢測胃癌組織中hTERT蛋白的表達，分析hTERT mRNA及其蛋白表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關系，并結(jié)合隨訪資料分析其與胃癌患者預后的關系。結(jié)果hTERT mRNA在胃癌組織中的表達升高（P<0.05）；hTERT蛋白在胃癌組織中的陽性表達率（83.3%）明顯高于正常胃組織（40.0%）（P＜0.05）。hTERT mRNA和蛋白表達水平呈正相關（r=0.733，P<0.05）；hTERT mRNA的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期相關（P<0.05）。胃癌患者hTERT mRNA高表達組與低表達組的生存曲線存在明顯差異（P=0.015）。結(jié)論hTERT在胃癌組織中的表達升高，且和胃癌進展相關，可作為反映胃癌進展及預后的生物學指標。

胃腫瘤；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；實時熒光定量PCR；免疫組織化學；表達；預后

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，全世界每年大約有951 600例新發(fā)病例和723 100例的死亡病例［1］。近年來，越來越多的研究表明端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［2～4］。雖然國內(nèi)外已有在胃癌組織中檢測hTERT mRNA和蛋白表達的研究［5～12］，但報道的結(jié)果不盡一致。因此，本研究采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術［13］和Max VisionTM即用型快速免疫組化一步法［14］檢測hTERT mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達水平，探討兩者在胃癌組織中的表達及其關聯(lián)性，并分析hTERT mRNA與胃癌臨床病理參數(shù)及患者預后的關系。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2007～2010年在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院行胃癌手術切除標本60例（胃癌組）和30例相對正常胃組織（距離腫瘤>10 cm，正常組）。所有患者術前均未行化療、放療或其他治療，手術切除標本均經(jīng)病理檢查證實。術后病理分級采用美國第七版AJCC胃癌TNM分期指南的標準。所有獲取的標本均立即置于液氮中，然后轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中待用。石蠟包埋組織均采用10%福爾馬林固定。采用電話或者書信對患者進行隨訪，隨訪截止日期為2015年4月30日。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，且取得患者同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

總的RNA提取試劑為美國Ambion公司提供的TRIzoI Reagent，RNA濃度和純度的測定使用購自德國的Nanodrop 2000，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒為美國Thermo Scientific公司提供；PCR引物系列 hTERT上游引物為 5′-CTCCCAT-TTCATCAGCAAGTTT-3′，下游引物為5′-CTTGGCTTTC-AGGATGGAGTAG-3′（Invitrogen公司合成）；β-actin上游引物為5′-ACCGAGCGCGGCTACAGC-3′，下游引物為5′-CTCATTGCCAATGGTGAT-3′（上海生工合成）。實時熒光定量PCR儀為安捷倫Mx3005P，免疫組化采用邁新的Max VisionTM即用型快速免疫組化一步法試劑盒，hTERT兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司，DAB試劑盒購自福州邁新技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取 所有樣本總RNA的提取根據(jù)TRIzoI Reagent說明書進行操作?？俁NA的濃度和純度用Nanodrop 2000進行測定。選擇A260/A280為1.8～2.1用于下一步試驗。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄實驗 按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書操作方法進行逆轉(zhuǎn)錄反應?？俁NA取3μg，選擇oligo（dT）18引物逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應條件如下：65℃5 min，冰浴2 min，42℃60 min，70℃5 min。

1.3.3 實時熒光定量PCR 按照Thermo Scientific SYBR Green qPCR Kit的說明書結(jié)合預實驗進行，PCR反應體系為20μl，包括10μl SYBR-Green qPCR Master Mix，hTERT上下游引物各1μl，2μl逆轉(zhuǎn)錄cDNA原液和6μl無酶水。反應條件為95℃7 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，43個循環(huán)。每個反應做3次重復實驗。每次反應結(jié)束均做溶解曲線。β-actin做內(nèi)參基因。hTERT mRNA的相對表達水平用2-ΔCt計算，-ΔCt=Ctβ-actin-CthTERT。

1.3.4 免疫組化法檢測和結(jié)果判定 所有組織標本均用10%福爾馬林固定，石蠟包埋并連續(xù)切片。采用Max VisionTM即用型快速免疫組化一步法，操作步驟按該試劑盒說明書進行。陰性對照采用PBS代替一抗。hTERT蛋白陽性結(jié)果判定標準：hTERT蛋白呈棕黃色顆粒定位于細胞質(zhì)或細胞核中。染色強度及分級標準如下：陽性細胞著色為棕黃色顆粒，以此計算陽性細胞數(shù)：≤10%為0分；11%～50%為1分；51%～ 75%為2分；>75%為3分。根據(jù)顯色程度判定陽性強度：基本不著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。每張切片著色程度得分與陽性細胞百分率得分相乘為最后得分。0～1分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～6分為中等陽性（++）；6分以上為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理實驗數(shù)據(jù)。計量資料的比較采用方差分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或者連續(xù)校正χ2檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗，相關分析采用Spearman秩相關；應用Kaplan-Meier分析繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗比較兩組患者生存曲線的差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hTERT mRNA及蛋白的表達情況

hTERT mRNA在胃癌組和正常組中均有表達，但兩組hTERT mRNA的表達有明顯差異（P<0.001），hTERT mRNA在胃癌組中的表達明顯高于正常組（P<0.001）。見圖1。

hTERT蛋白在胃癌組和正常組中均有表達，主要表達位于細胞質(zhì)中。其中正常組hTERT蛋白的表達主要見于胃黏膜腺上皮下2/3層。胃癌組和正常組中hTERT蛋白的陽性表達率分別為83.3%、40.0%，胃癌組中hTERT蛋白的陽性表達率比正常組明顯升高，二者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 hTERT蛋白在胃癌組織中的陽性表達

運用Spearman秩相關分析hTERT mRNA和蛋白表達水平的關系，結(jié)果顯示hTERT mRNA和蛋白表達水平呈正相關（r=0.733，P<0.05）。

2.2 hTERT mRNA的表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關系

在胃癌組中以hTERT mRNA表達的平均數(shù)為截點，分為hTERT mRNA高表達者和hTERT mRNA低表達者。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中hTERT mRNA高表達者所占比例比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高（70.2%vs 23.1%，P=0.002）；在遠處轉(zhuǎn)移組中hTERT mRNA高表達者所占比例比無遠處轉(zhuǎn)移者高（100%vs 51.9%，P=0.029）；在Ⅲ期+Ⅳ期患者中hTERT mRNA高表達者所占比例比Ⅰ期+Ⅱ期患者高（71.1%vs 36.4%，P=0.009）。hTERT mRNA的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度及浸潤深度無關（P>0.05）。見表1。

表1 hTERT mRNA的表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關系

（續(xù)表）

2.3 hTERT mRNA的表達與患者生存預后的關系

以hTERTmRNA在胃癌組中表達的平均數(shù)為截點，分為hTERT mRNA高表達組、hTERT mRNA低表達組進行統(tǒng)計分析并繪制生存曲線，通過log-rank檢驗顯示胃癌患者hTERTmRNA高表達組與hTERTmRNA低表達組的生存曲線具有明顯差異（P=0.015），其中hTERT mRNA在高表達組患者的中位生存時間為24個月，hTERT mRNA低表達組的中位生存時間為64個月，表明hTERT mRNA的高表達能夠影響胃癌患者預后。見圖3。

圖3 hTERT mRNA高表達組與hTERT mRNA低表達組患者生存曲線的比較

3 討論

胃癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟、多基因參與的復雜過程。其中端粒酶參與胃癌的發(fā)生［15］，它可使細胞發(fā)展成為永生化細胞或具有無限增殖能力的癌細胞，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［16］。hTERT是端粒酶催化亞單位，其表達與端粒酶活性相平行，是端粒酶活性的決定因素［17］。為此，本實驗用qRT-PCR和Max VisionTM即用型快速免疫組化一步法檢測hTERT在胃癌組織中的表達水平，探討hTERT與胃癌發(fā)展、預后的關系。

本研究顯示hTERT mRNA在正常胃組織及胃癌組織中的表達逐漸升高（P<0.001），表明hTERT參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。Max VisionTM法檢測顯示hTERT蛋白主要表達在細胞質(zhì)，其中，hTERT蛋白在正常胃組織中的表達主要集中在胃黏膜腺體下2/3層的腺體細胞質(zhì)中。其原因可能是胃黏膜更新速度較快，上皮干細胞中存在hTERT的活化［9］。本研究中hTERT蛋白在正常胃組織的陽性表達率（40.0%）與國外報道大致相同［9～11］，而國內(nèi)萬順梅等［7］的研究中hTERT蛋白在25例正常胃組織中陽性表達率為0。張赟等［6］的研究中hTERT蛋白在10例正常胃組織中的陽性表達率為10.0%。這些報道與本研究結(jié)果差異較大，其原因可能是其納入的正常胃組織樣本較少，或是本研究采用了更加靈敏的Max VisionTM法［14］檢測hTERT蛋白的表達。本研究經(jīng)Spearman秩相關分析提示hTERT mRNA與蛋白的表達水平呈正相關（r=0.733，P<0.05），說明hTERT基因在mRNA和蛋白的水平表達一致。張赟等［6］研究也表明hTERT mRNA和蛋白的表達呈正相關（r=0.565），與筆者的結(jié)果一致。臨床病理因素分析顯示hTERT mRNA與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關，與Lu等［18］和胡海雷［19］的實驗結(jié)果基本相同；但研究顯示 hTERT mRNA與腫瘤浸潤深度有關，與筆者的結(jié)果不一致，分析可能是本研究未納入T1期、T2期樣本，未統(tǒng)計比較T1期+T2期與T3期+T4期兩組患者的差異，僅比較T3期與T4期患者hTERT mRNA的表達水平，結(jié)果提示T3期與T4期患者hTERT mRNA的表達水平無差異。生存分析提示hTERT mRNA高表達組患者的術后中位生存時間比低表達組更短（P=0.015），說明hTERTmRNA高表達和患者預后不良有關。門樹成等［20］的研究表明hTERT mRNA高表達組患者的5年生存率（17.4%）比hTERT mRNA低表達組（60.0%）低（P=0.002），與胃癌不良預后相關。

最近研究［21］表明，hTERT能夠促進胃癌細胞的侵襲是通過提高對FOXO3a的泛素化和上調(diào)ITGB1，hTERT/MDM2-FOXO3a-ITGB1信號通路在hTERT誘導的胃癌細胞入侵方面發(fā)揮重要作用。Liu等［2］研究顯示在胃癌細胞系中hTERT可以促進上皮向間皮轉(zhuǎn)化和誘導多能癌細胞，進而促進胃癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)，可見hTERT在胃癌發(fā)展過程中起重要作用。

綜上，hTERT在胃癌組織中的表達升高，且和胃癌進展、預后相關。因此，hTERT可作為反映胃癌進展及預后的生物學指標，但在臨床治療應用方面還需深入研究。

［1］ Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［2］ Liu Z，Li Q，Li K，et al.Telomerase reverse transcriptase promotes epithelial-mesenchymal transition and stem cell-like traits in cancer cells［J］.Oncogene，2013，32（36）：4203-4213.

［3］ Duarte MC，Babeto E，Leite KR，et al.Expression of TERT in pre-cancerous gastric lesions compared to gastric cancer［J］.Braz J Med Biol Res，2011，44（2）：100-104.

［4］ 胡福軍，李沛，董子明，等.胃癌組織中hTERT mRNA表達的定量研究［J］.浙江實用醫(yī)學，2009，14（3）：177-178，187.

［5］ 吳繼鋒，邵晉晨，王道斌，等.胃癌組織端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的表達及意義［J］.中國腫瘤臨床，2004，31（5）：281-291.

［6］ 張赟，伍冬梅，李春鳴.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白及mRNA在胃癌中的表達及相關性研究［J］.貴州醫(yī)藥，2011，35（3）：211-214.

［7］ 萬順梅，房殿春，葛勤利，等.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在胃癌組織中的表達及其臨床病理意義［J］.西北國防醫(yī)學雜志，2010，31（6）：413-415.

［8］ 魏青林，張丹，楊仕明.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和Gli1、Gli2在胃癌中的表達及意義［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2015，37（9）：902-906.

［9］ Yasui W，Tahara E，Tahara H，et al.Immunohistochemical detection of human telomerase reverse transcriptase in normal mucosa and precancerous lesions of thestomach［J］.JpnJ Cancer Res，1999，90（6）：589-595.

［10］Li W，Li L，Liu Z，et al.Expression of the full-length telomerase re-verse transcriptase（hTERT）transcript in both malignant and normal gastric tissues［J］.Cancer Lett，2008，260（1-2）：28-36.

［11］Cheng YB，Guo LP，Yao P，et al.Telomerase and hTERT：can they serve as markers for gastric cancer diagnosis?［J］.World J Gastroen-terol，2014，20（21）：6615-6619.

［12］王曉燕，陳萍，吳鶯，等.端粒酶和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在胃癌組織中的表達及臨床意義［J］.臨床薈萃，2010，25（4）：299-301.

［13］ Provenzano M，Mocellin S.Complementary techniques：validation of gene expression data by quantitative real time PCR［J］.Adv Exp Med Biol，2007，593：66-73.

［14］ 林秋蘭，趙麗華，林競，等.Max VisionTM即用型快速免疫組化一步法染色的病理應用［J］.診斷病理學雜志，2008，15（4）：344.

［15］Gumus-Akay G，Unal AE，Bayar S，et al.Telomerase activity could be used as a marker for neoplastic transformation in gastric adenocar-cinoma：but it does not have a prognostic significance［J］.Genet Mol Res，2007，6（1）：41-49.

［16］ Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer［J］.Sci-ence，1994，266（5193）：2011-2015.

［17］Autexier C，Lue NF.The structure and function of telomerase reverse transcriptase［J］.Annu Rev Biochem，2006，75：493-517.

［18］Lu MH，Deng JQ，Cao YL，et al.Prognostic role of telomerase activity in gastric adenocarcinoma：A meta-analysis［J］.Exp Ther Med，2012，3（4）：728-734.

［19］胡海雷.實時熒光定量RT-PCR檢測胃癌患者外周血hTERTmRNA表達水平［J］.放射免疫學雜志，2011，24（2）：182-185.

［20］門樹成，黃寶俊.hTERT mRNA在胃癌中表達及其與預后的關系［J］.中國當代醫(yī)藥，2013，20（35）：4-6.

［21］Hu C，Ni Z，Li BS，et al.hTERT promotes the invasion of gastric can-cer cells by enhancing FOXO3a ubiquitination and subsequent IT-GB1 upregulation［J］.Gut，2015.［Epub ahead of print］.

［2015-06-09收稿］［2015-10-25修回］［編輯 阮萃才］

Expression and clinical significance of hTERT in gastric cancer

Liu Li1，3，Qin Yuzhou2，Ge Lianying1（1Department of Endoscopy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Department of Gastrointestinal Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；3Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

Ge Lianying.E-mail：gelianying2015@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of human telomerase reverse transcriptase（hTERT）in gastric cancer tissues.MethodsQuantitative real-time PCR was used to measure levels of hTERT mRNA in gastric tissues，while MaxVisionTMimmunohistochemistry was used to detect expression of hTERT protein in gastric tissue sections.Possible correlations of hTERT mRNA and protein levels with clinicopathological characteristics and with patient survival were explored.ResultsThe mRNA encoding hTERT was overexpressed in gastric caner tissues and adjacent tumor tissues（P<0.05），while the rate of hTERT protein-positive staining was significantly higher in gastric cancer tissues（83.3%）than in normal tissues（40.0%，P<0.05）.Levels of hTERT mRNA correlated positively with protein levels（r=0.733，P<0.05）.Up-regulation of hTERT was significantly associated with lymph node metastases，distant metastases and TNM stage（P<0.05）.Kaplan-Meier survival analysis showed significantly higher survival rates for patients expressing low levels of hTERT than for those expressing high levels（P=0.015）.Conclusions These results suggest that hTERT is overexpressed in gastric cancer tissues，and that such overexpression is associated with gastric cancer progression.Assaying hTERT levels may provide an indicator of disease progression and prognosis.

Gastric neoplasm；Human telomerase reverse transcriptase；Quantitative real-time PCR；Immunohistochemistry；Expression；Prognosis

R735.2

A

1674-5671（2015）06-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.06.03

廣西教育廳科研基金資助項目（201012MSO38）

葛蓮英。E-mail：gelianying2015@163.com