四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的克隆與分析

陽太億　劉俊仙　劉菁　蔣菁　韓柱強(qiáng)　賀梁瓊　唐秀梅　鐘瑞春　黃志鵬　吳海寧　唐榮華　熊發(fā)前

摘要：克隆與分析四倍體野生種花生的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，可為研究其轉(zhuǎn)錄活性、功能及調(diào)控提供序列基礎(chǔ)。使用根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)的簡并引物對，利用PCR技術(shù)對四倍體野生種花生（Arachis monticola）的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)回收、克隆和測序，對目的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，目的條帶大小約260 bp，克隆獲得了32條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，序列長度范圍為257～269 bp，A+T所占比例范圍為54.47%～68.77%，A+T與G+C比例為1.20～2.20。核苷酸序列間相似性范圍為46.4%～98.9%，存在較高異質(zhì)性，表現(xiàn)為缺失突變與點(diǎn)突變;氨基酸序列間相似性范圍為6.3%～100%，有12條序列發(fā)生了終止密碼子突變，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性。絕大部分序列的保守基序一致，但各序列間的保守基序也存在一定差異，呈現(xiàn)一定程度的異質(zhì)性。32條序列系統(tǒng)聚類為4個(gè)家族，家族Ⅰ和家族Ⅲ分別占總序列數(shù)的31.25%和37.50%。對四倍體野生種花生與其它物種植物同一類型逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示所有序列被分為6類，其中，Ⅰ類和Ⅱ類分別包含15條和9條四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列，表明四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列具有比較高的保守性;同時(shí)四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列與葡萄、擬南芥、馬鈴薯、野茶樹、辣椒、甜菜、煙草、番茄、綠豆以及歐洲云杉等具有較近的親緣關(guān)系，表明它們之間可能存在橫向傳遞。本研究獲得的逆轉(zhuǎn)錄酶序列為基于LTR逆轉(zhuǎn)座子的花生屬分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生;四倍體野生種;Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子;逆轉(zhuǎn)錄酶;異質(zhì)性

中圖分類號：S565.2：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0009-13

Cloning and Analysis of Reverse Transcriptase of

Ty1-copia-like Retrotransposons in Arachis monticola

Yang Taiyi， Liu Junxian*， Liu Jing， Jiang Jing， Han Zhuqiang， He Liangqiong， Tang Xiumei，

Zhong Ruichun， Huang Zhipeng， Wu Haining， Tang Ronghua， Xiong Faqian

（Institute of Economic Crops， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China）

Abstract The reverse transcriptase sequences of Ty1-copia retrotransposons from tetraploid wild peanut species were cloned and analyzed， which could provide sequence basis for studying its transcriptional activity， function and regulation. The genomic DNA of Arachis monticola was amplified by PCR using a pair of degenerate primers designed according to the conservative region of reverse transcriptases of Ty1-copia retrotransposons. Then the target band was recovered， cloned and sequenced and the obtained sequences were analyzed through the bioinformatics method. The results showed that the size of the target band was approximately 260 bp and thirty-two reverse transcriptase sequences were obtained. The length of sequences ranged from 257 bp to 269 bp. The proportion of A+T ranged from 54.47% to 68.77%. The ratio of A+T to G+C was 1.20～2.20. The similarity between nucleotide sequences ranged from 46.4% to 98.9%. These indicated that the nucleotide sequences of reverse transcriptases existed higher heterogeneity in the form of deletion mutation and point mutation. The similarity between amino acid sequences ranged from 6.3% to 100% and twelve sequences had termination codon mutations， which indicated that the amino acid sequences of reverse transcriptase existed high heterogeneity. The conservative motifs of most sequences were identical， but also there were some differences between them， showing a certain degree of heterogeneity. The thirty-two reverse transcriptase sequences were clustered into four families. FamilyⅠand Family Ⅲ accounted for 31.25% and 37.50% of the total sequences， respectively. Phylogenetic tree was constructed according to the amino acid sequences of the same type of reverse transcriptases in tetraploid wild peanut species and some other plant species. The results showed that all sequences were classified into six categories. Among them， ClassⅠand ClassⅡ contained fifteen and nine reverse transcriptase sequences from tetraploid wild peanut species， respectively， which showed that the reverse transcriptase sequences of tetraploid wild peanut species were highly conservative. Meanwhile， the reverse transcriptase sequences of tetraploid wild peanut species had close relationship with grape， Arabidopsis， potato， Camellia sinensis， pepper， sugarbeet， tobacco， tomato， mung bean and Picea abies. It indicated that horizontal transmission might occur between these plant species. The reverse transcriptase sequences obtained in this study laid a foundation for the development and application of molecular markers in Arachis based on LTR retrotransposons.

Keywords Peanut; Tetraploid wild species; Ty1-copia-like retrotransposons; Reverse transcriptase; Heterogeneity

轉(zhuǎn)座子是指基因組中能從一條染色體跳躍到另外一條染色體上或從同一條染色體的某個(gè)位點(diǎn)跳躍到另外一個(gè)位點(diǎn)的可移動(dòng)DNA序列[1]。逆轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子是轉(zhuǎn)座子的兩組類型，其中，逆轉(zhuǎn)座子根據(jù)5′和3′端是否含有約100～5 000 bp大小的長末端重復(fù)序列劃分為LTR逆轉(zhuǎn)座子和非LTR逆轉(zhuǎn)座子，LTR逆轉(zhuǎn)座子根據(jù)其編碼區(qū)基因排列次序的不同分為Ty1-copia和Ty3-gypsy[2-4]。根據(jù)LTR逆轉(zhuǎn)座子序列中逆轉(zhuǎn)錄酶基因的保守區(qū)，可以通過簡并PCR技術(shù)擴(kuò)增克隆出逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列[5，6]。LTR逆轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)多態(tài)性、高拷貝數(shù)、高度異質(zhì)性等特點(diǎn)使其非常適合用來開發(fā)分子標(biāo)記，目前，基于LTR逆轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)間擴(kuò)增多態(tài)性（IRAP）、逆轉(zhuǎn)座子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性（REMAP）和序列特異擴(kuò)增多態(tài)性（S-SAP）[7，8]。

近年來逐漸興起對花生轉(zhuǎn)座子的研究。相比LTR逆轉(zhuǎn)座子，MITEs轉(zhuǎn)座子在花生上最早也最廣泛地被研究，其研究主要集中在利用AhMITE1s轉(zhuǎn)座子檢測栽培種花生的DNA多態(tài)性和鑒定雜交F1代雜種的真實(shí)性上[9-23]。另外，也有研究結(jié)果表明MITEs轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記揭示出栽培種花生的DNA多態(tài)性比SSR分子標(biāo)記和其它類型分子標(biāo)記高[12，13]。

有關(guān)花生LTR逆轉(zhuǎn)座子的研究報(bào)道較少。在國外，Nielen 等[24，25]先后克隆出花生Ty3-gypsy類全長逆轉(zhuǎn)座子的FIDEL和Ty1-copia類全長逆轉(zhuǎn)座子的Matita，對其拷貝數(shù)、染色體分布和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析并探討了在花生基因組進(jìn)化和多樣性形成過程中扮演的角色。在國內(nèi)，只有熊發(fā)前等[26]系統(tǒng)對花生LTR逆轉(zhuǎn)座子和MITE轉(zhuǎn)座子的分離及其分子標(biāo)記開發(fā)利用的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，尚未見對花生屬LTR逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列進(jìn)行克隆的報(bào)道，也未見克隆四倍體野生種Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列的報(bào)道。

本研究擬克隆四倍體野生種花生A. monticola的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，并對序列特征及多樣性進(jìn)行分析，調(diào)查該類逆轉(zhuǎn)錄酶的序列組成和變異模式及其與其它物種植物之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步研究其轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性、功能及調(diào)控提供序列基礎(chǔ)，也為基于LTR逆轉(zhuǎn)座子的花生屬分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用試驗(yàn)材料為四倍體野生種花生A. monticola（PI468199）。種子進(jìn)行田間播種育苗，隨機(jī)摘取10株健康植株的頂端芯葉，立即放入冰袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 通過使用建立的改良CTAB法[27]提取四倍體野生種花生基因組DNA，DNA純度和濃度分別通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)（NanoDrop）檢測，最后將DNA工作液濃度統(tǒng)一調(diào)至50 ng/μL，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄酶基因的PCR擴(kuò)增 采用Kumar等[1]設(shè)計(jì)的簡并引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物，RTp1：5′-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3′;下游引物，RTp2：5′-ARCATRTCRTCNACRTA-3′，其中，N=A/T/C/G，Y=C/T，R=A/G。PCR擴(kuò)增體系和程序參照文獻(xiàn)[27]。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物中加入4 μL上樣緩沖液并充分混勻，取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，緩沖液為1×TAE，經(jīng)EB（溴化乙錠）染色后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照并保存。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶基因片段的回收、克隆及測序 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對目的條帶進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐青霉素、半乳糖苷酶和底物X-gal并通過藍(lán)白斑篩選，在平板上37℃培養(yǎng)12 ～ 16 h，挑取單克隆白斑于800 μL的LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L氨芐青霉素）中培養(yǎng)4 ～ 6 h，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將初步鑒定為陽性克隆的菌液送至測序公司進(jìn)行一代測序[27]。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列分析 運(yùn)用NCBI中的blastn和blastx對逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列進(jìn)行同源性檢索。綜合運(yùn)用BioEdit和DNAMAN軟件對逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列進(jìn)行分析。利用Jalview軟件生成序列圖和在線工具Weblogo（http：//weblogo.threeplusone.com/）獲得序列的Logo圖。利用在線程序Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.ukphyre2/html/）預(yù)測逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用RasMol軟件統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)。利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件預(yù)測逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的保守基序。運(yùn)用MEGA 6.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列的PCR擴(kuò)增及測序

利用根據(jù)Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)的簡并引物，對四倍體野生種花生A. monticola的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的目的條帶大小約為260 bp（圖1），表明Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子存在于四倍體野生種花生A. monticola中。

對目的條帶進(jìn)行回收、克隆和測序，共獲得46條序列。利用DNAMAN軟件等去除46條序列中的重復(fù)序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行同源性分析去除非目標(biāo)序列，最后共獲得32條非重復(fù)的逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，將每條序列按照AmRT1-X的形式進(jìn)行命名，并提交到GenBank（登錄號：MK775559 ～ MK775590）。對32條逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行多重比對（圖2），為展示堿基在每個(gè)位置上的保守性，利用在線工具Weblogo生成Logo圖（圖3）。將32條序列遞交到NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，結(jié)果表明與數(shù)據(jù)庫中其它物種植物Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列具有同源性，說明已成功克隆到四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列。

2.2 四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列的相似性分析

利用BioEdit軟件對四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，序列長度在257～269 bp之間，其中，AmRT1-33序列最長，AmRT1-15、AmRT1-39和AmRT1-42序列最短，所有序列長度都小于Voytas等[5]報(bào)道的273 bp，均存在不同程度的缺失（4～16 bp），說明缺失突變是造成四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列長度變化的主要原因。32條序列的A、T、C、G數(shù)量變化范圍分別為67～97、70～94、31～56、44～68，A+T所占比例范圍為54.47%～68.77%，G+C所占比例范圍為31.23%～45.53%，A+T與G+C比例為1.20～2.20（表1）。

核苷酸序列間相似性范圍為46.4%～98.9%，其中AmRT1-10與AmRT1-23之間的相似性最高，為98.9%，AmRT1-4與AmRT1-1之間的相似性最低，為46.4%;氨基酸序列間的相似性范圍為6.3%～100%，與核苷酸序列間的相似性并不對應(yīng)（表2）。由此可知，利用同一對簡并引物從同一種質(zhì)中克隆出來的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列存在較大差異，在序列長度、堿基變化和序列相似性上存在多態(tài)性，呈現(xiàn)較高異質(zhì)性。

2.3 四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列的聚類分析

為了闡明四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列之間的親緣關(guān)系，利用MEGA 6.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果顯示，32條序列分為4個(gè)家族，其中，家族Ⅰ包含10條序列，家族Ⅱ包含6條序列，家族Ⅲ包含12條序列，家族Ⅳ包含4條序列，家族Ⅳ與其它3個(gè)家族遺傳距離最大，單獨(dú)聚為一類。家族Ⅰ和家族Ⅲ中的序列數(shù)分別占總序列數(shù)的31.25%和37.50%。家族內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄酶序列長度大部分較一致，差異主要表現(xiàn)為不同程度的點(diǎn)突變與堿基替換;各家族之間的差異較大，差異主要表現(xiàn)為不同程度的缺失突變?？傊骷易鍍?nèi)及家族間的差異主要表現(xiàn)為不同程度的點(diǎn)突變、堿基替換和缺失突變，它們很有可能是造成四倍體野生種花生Ty1-copia逆轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生較高異質(zhì)性及擁有多拷貝的重要原因。

2.4 四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因的氨基酸序列分析

翻譯成氨基酸后，選擇核苷酸聚類中各家族具有代表性的氨基酸序列進(jìn)行分析，利用在線程序Phyre2預(yù)測Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（圖5）與三級結(jié)構(gòu)（圖6）。結(jié)果顯示，所有序列中的蛋白結(jié)構(gòu)包含2個(gè)α-螺旋、4或5個(gè)β-折疊及5或6個(gè)轉(zhuǎn)角以及25 ～ 32氫鍵（表3）。在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)明顯的螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)不明顯的折疊結(jié)構(gòu)，說明螺旋結(jié)構(gòu)是該蛋白的大量結(jié)構(gòu)元件（藍(lán)色端為C端，紅色端為N端）。

利用MEGA 6.0軟件對32條逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列進(jìn)行分析。從圖7中可以看出，32條序列中有12條發(fā)生了1 ～ 9個(gè)終止密碼子突變，其中，AmRT1-5的終止密碼子突變最多，分別在第9、21、33、50、55、62、74、75、76個(gè)氨基酸處;AmRT1-1序列有8個(gè)終止密碼子突變，分別在第16、21、31、51、56、58、74、75個(gè)氨基酸處;AmRT1-3序列有5個(gè)終止密碼子突變，分別在第21、22、32、39、85個(gè)氨基酸處;AmRT1-11在第21、51、58、74、77個(gè)氨基酸處;AmRT1-4有4個(gè)終止密碼子突變，分別在第54、58、80、81個(gè)氨基酸處;AmRT1-33在第18、65個(gè)氨基酸處發(fā)生了2次終止密碼子突變;有6條序列發(fā)生了1次終止密碼子突變，分別是AmRT1-16（第85個(gè)氨基酸）、AmRT1-26（第41個(gè)氨基酸）、AmRT1-29（第46個(gè)氨基酸）、AmRT1-41（第85個(gè)氨基酸）、AmRT1-42（第44個(gè)氨基酸）、AmRT1-43（第64個(gè)氨基酸）。AmRT1-5連續(xù)發(fā)生了3個(gè)終止密碼子突變，AmRT1-1、AmRT1-3和AmRT1-4連續(xù)發(fā)生了2個(gè)終止密碼子突變。終止密碼子突變導(dǎo)致了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子失去轉(zhuǎn)錄活性，推測終止密碼子突變是四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生多拷貝和較高異質(zhì)性的重要原因。

2.5 四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因蛋白保守基序分析

利用在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/）預(yù)測四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的保守基序，結(jié)果（圖8）顯示32條序列共存在8種保守基序，其中包含motif 1的序列有28條，占所有序列數(shù)的87.50%;含有motif 2 的序列有30條，占所有序列數(shù)的93.75%;含motif 3的序列有24條，占所有序列數(shù)的75.00%;同時(shí)包含motif 1、motif 2和motif 3的序列有24條，占所有序列的75.00%;同時(shí)包含motif 5和motif 7的序列只有3條，分別是AmRT1-1、AmRT1-5和AmRT1-11;包含motif 6的序列僅有3條，分別是AmRT1-16、AmRT1-41和AmRT1-43;AmRT1-3和AmRT1-5擁有1個(gè)共同的保守基序即motif 8：5′-XRRACMA-3′;AmRT1-3序列只含有一個(gè)保守基序motif 8。

2.6 四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

將四倍體野生種花生與其它物種植物（表4）的逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列進(jìn)行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析四倍體野生種花生與其它物種植物Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列間的進(jìn)化關(guān)系。根據(jù)進(jìn)化樹（圖9）可將所有逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列分成6類，AmRT1-4單獨(dú)歸為一類;Ⅰ類分別包含15條四倍體野生種花生和15條其它物種植物的逆轉(zhuǎn)錄酶序列，說明四倍體野生種花生的15條逆轉(zhuǎn)錄酶序列與葡萄（Vitis vinifera， CAN72446.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana， S71291）、馬鈴薯（Solanum tuberosum， CAA13065.1）、野茶樹（Camellia sinensis， CAJ09751.1）、辣椒（Capsicum annuum， AFS89513.1）、甜菜（Beta vulgaris， T14589）、煙草（Nicotania tabacum， AAA03507.1）、番茄（Lycopersicon esculentum， AF072638.1）、綠豆（Vigna radiata， AAT90494.1）以及歐洲云杉（Picea abies， O49918）等之間具有較高相似性，親緣關(guān)系較近;Ⅲ類中有3條四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列與鐵皮石斛（Dendrobium officinale， AIL54325.1）和草莓（Fragaria × ananassa， ACZ81628.1）之間具有較高相似性，親緣關(guān)系較近;Ⅴ類和Ⅵ類中分別

含來自四倍體野生種花生的1條和4條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，這兩類序列與其它四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

本研究首次對四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終擴(kuò)增出約260 bp大小的目的條帶?；厥?、克隆和測序目的片段，獲得46條序列，經(jīng)去除非逆轉(zhuǎn)錄酶序列和重復(fù)序列后得到32條真實(shí)的逆轉(zhuǎn)錄酶序列。以上說明該類逆轉(zhuǎn)座子存在于四倍體野生種花生基因組中，也證實(shí)了采用簡并引物從四倍體野生種花生基因組中擴(kuò)增和克隆Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的策略是行之有效的[1]。

32條逆轉(zhuǎn)錄酶序列的長度變化范圍為257～269 bp，所有序列長度都小于Voytas等[5]報(bào)道的273 bp，說明缺失突變是造成四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列長度變化的主要原因。A+T所占比例在54.47%～68.77%之間，A+T與G+C比例為1.20～2.20，高A+T堿基含量導(dǎo)致較高異質(zhì)性。核苷酸序列間相似性范圍為46.4%～98.9%，呈現(xiàn)較高的異質(zhì)性;相比核苷酸序列，氨基酸序列呈現(xiàn)出更高的異質(zhì)性。絕大部分序列的保守基序一致，但各序列間的保守基序也存在一定差異。32條序列中有12條序列發(fā)生終止密碼子突變，最多的一條序列出現(xiàn)9個(gè)終止密碼子，終止密碼子使得基因功能喪失或改變，推測終止密

碼子突變可能是造成逆轉(zhuǎn)座子較高異質(zhì)性的重要原因。逆轉(zhuǎn)座子的異質(zhì)性產(chǎn)生原因包括以下5點(diǎn)：（1）在轉(zhuǎn)座過程中，逆轉(zhuǎn)座子易發(fā)生突變。逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座和增殖是以DNA到RNA再到DNA的形式進(jìn)行，期間需要逆轉(zhuǎn)錄酶的輔助，但在增殖過程中逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏高保真性和錯(cuò)讀校對功能[28]，跟DNA聚合酶相比，逆轉(zhuǎn)錄酶的堿基錯(cuò)配率高10 000倍以上[29]，造成突變幾率急劇上升，從而導(dǎo)致突變在增殖過程中不斷積累;（2）堿基自然突變和同源重組?；蚪M在整個(gè)進(jìn)化過程中，逆轉(zhuǎn)座子會頻繁地發(fā)生自然突變，或與其自身及其它物種的基因組發(fā)生同源重組，從而導(dǎo)致胞嘧啶的甲基化和胸腺嘧啶含量的增高，提高了DNA可塑性，使得DNA序列變異的幾率增加[30];（3）寄主的防御機(jī)制導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生變異以適應(yīng)寄主[31，32];（4）逆轉(zhuǎn)座子的垂直傳遞。垂直傳遞是指所有逆轉(zhuǎn)座子都整合分布于染色體中，隨著世代的更替，從親代遺傳給子代，隨之上述發(fā)生的這些突變也被傳遞到下一代，世代間不斷積累[33，34]。（5）逆轉(zhuǎn)座子的水平轉(zhuǎn)移。水平轉(zhuǎn)移也能導(dǎo)致產(chǎn)生異質(zhì)性[35]，水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象曾在水稻和狗尾草屬植物之間發(fā)生過[36]。

對32條四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列進(jìn)行聚類分析，遺傳進(jìn)化樹顯示，32條序列分成4個(gè)家族。家族Ⅰ和家族Ⅲ是構(gòu)成四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的主要成分，表明該物種的逆轉(zhuǎn)錄酶序列具有較高保守性。不同家族包含拷貝數(shù)成員的不同，反映了不同家族之間轉(zhuǎn)座機(jī)制的不同，其存在的歷史地位以及對四倍體野生種花生基因組進(jìn)化的作用也可能不同。各家族內(nèi)部成員數(shù)量越多，序列間相似性越高，其轉(zhuǎn)座發(fā)生時(shí)間也可能越近，存在有轉(zhuǎn)錄活性的逆轉(zhuǎn)座子的可能性也越大[37]，從而推測具有轉(zhuǎn)錄活性的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子很可能存在于家族Ⅰ和家族Ⅲ中。

四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶各家族序列的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)整體構(gòu)型基本類似，但在螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)、折疊結(jié)構(gòu)數(shù)、轉(zhuǎn)角數(shù)和氫鍵數(shù)上存在細(xì)微差別，推測這些不同會影響Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄活性、轉(zhuǎn)座效率以及LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)。

四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的保守基序預(yù)測顯示，motif 1、motif 2和motif 3在所有序列中的比例較大，表明這三種保守基序是四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸的主要基序，也表明四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列具有較高保守性。各序列之間的保守基序也存在一定差異，這在一定程度上體現(xiàn)了四倍體野生種花生Ty1-copia逆轉(zhuǎn)座子的多態(tài)性及較高異質(zhì)性。AmRT1-1、AmRT1-3、AmRT1-5和AmRT1-11的保守基序跟其它序列差異較大，其中AmRT1-1、AmRT1-5和AmRT1-11在核苷酸聚類分析中歸屬家族Ⅲ，在氨基酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中歸屬家族Ⅵ。

從構(gòu)建的四倍體野生種花生和其它物種植物的Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中可以看出，Ⅰ類和Ⅱ類分別包含15條和9條四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列，分別占總序列數(shù)的46.88%和28.13%，表明四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列具有較高保守性。Ⅰ類中的15條四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列與葡萄、擬南芥等具有較高相似性，親緣關(guān)系較近;Ⅲ類中的3條四倍體野生種花生逆轉(zhuǎn)錄酶序列與鐵皮石斛和草莓之間具有較高相似性，親緣關(guān)系較近;以上暗示它們可能具有共同的起源，也可能是四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化過程中與這些物種植物發(fā)生過橫向傳遞。Ⅴ類和Ⅵ類中分別包含四倍體野生種花生的1條和4條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，與其它四倍體野生種花生Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說明這兩類序列在起源和進(jìn)化上較為古老，特異性較強(qiáng)，極有可能為四倍體野生種花生所特有，也反映了該兩類序列在四倍體野生種花生進(jìn)化過程中有著不同的歷史地位。

本研究從四倍體野生種花生中成功分離出Ty1-copia類逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列，為下一步分離其全長序列、研究其轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性和功能提供序列基礎(chǔ)，對花生屬基于LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記開發(fā)及花生分子育種具有重要意義。

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收稿日期：2019-09-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660428，31960409，31401415，31240059）;廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018GXNSFDA281027）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（桂農(nóng)科2017JZ13，桂農(nóng)科2015JZ98，桂農(nóng)科2018YT12）

作者簡介：陽太億（1995—），男，廣西桂林人，本科生，研究方向：花生遺傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：528515743@qq.com

劉俊仙（1982—），女，河南駐馬店人，碩士，副研究員，研究方向：植物生物技術(shù)與分子生物學(xué)。E-mail：liujunxian868@163.com

*同為第一作者。

通訊作者：唐榮華（1965—），男，廣西桂林人，博士，研究員，研究方向：花生高產(chǎn)高效栽培。E-mail：tronghua@163.com

熊發(fā)前（1983—），男，安徽蕪湖人，博士，副研究員，研究方向：花生遺傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：xfq2002@126.com