冰片對血腦屏障P-糖蛋白功能的影響

俞 浩，周國梁，毛斌斌

(安徽科技學院 食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

冰片對血腦屏障P-糖蛋白功能的影響

俞 浩，周國梁，毛斌斌

(安徽科技學院 食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

觀察冰片對血腦屏障(BBB)P-糖蛋白功能的影響。取NIH小鼠，隨機分為冰片高、中、低劑量組，維拉帕米組和溶劑對照組。灌胃給藥，每日2次，共7次。末次給藥后，分別從尾靜脈和腦室注射羅丹明123(Rho-123)。注射Rho-123后取血漿和腦組織，熒光分光光度法測定血漿及腦組織中Rho-123含量。結果表明：尾靜脈注射Rho-123后，冰片對小鼠血漿Rho-123含量無明顯影響；5，10，20和30 min冰片高、中劑量組小鼠腦組織Rho-123濃度均顯著高于溶劑對照組(P<0.01)。腦室注射Rho-123后5，10，20和30 min，冰片高劑量組小鼠血漿Rho-123濃度均顯著低于溶劑對照組(P<0.05)；20，30 min冰片中劑量組小鼠血漿Rho-123濃度亦顯著低于溶劑對照組(P<0.05)；1，5，10和20 min冰片高劑量組小鼠腦組織Rho-123濃度顯著高于溶劑對照組(P<0.01或P<0.05)；5，10 min冰片中劑量組小鼠腦組織Rho-123濃度亦顯著高于溶劑對照組(P<0.05)。說明冰片能抑制BBB P-gp功能。

冰片；血腦屏障；P-糖蛋白；羅丹明123

P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是能量依賴性藥物轉運外排泵，其能降低細胞內不同化學結構和不同作用機制底物的濃度，使細胞對多種化合物產生耐藥。研究表明，P-gp在腫瘤細胞和許多正常組織中均有高水平表達，其能將進入組織細胞內的底物排出細胞，導致細胞產生耐藥[1-3]。冰片是一小分子化合物，結構明確，毒性較低。冰片不僅本身極易透過血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)，還能促進伊文思藍、泛影葡胺、慶大霉素等透過BBB[4-5]。對冰片開放BBB的機制研究發(fā)現，其能升高腦微血管內皮細胞內Ca2+濃度和一氧化氮合酶(iNOS)活性，減少腦微血管內皮細胞細胞間粘附分子的表達，開放BBB內皮細胞間緊密連接，增加腦毛細血管內皮細胞吞飲囊泡數量[6-7]。本實驗擬在前期研究的基礎上，采用尾靜脈-腦室注射P-gp底物羅丹明123(Rho-123)，觀察冰片對P-gp的作用，進一步探討冰片開放BBB的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性NIH小鼠，體重28±2 g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2005A011。

1.2 藥品與試劑

冰片，購于廣州市藥材公司，為機制冰片，批號：20040904；Rho-123，Sigma公司；鹽酸維拉帕米片，江蘇四環(huán)生物股份有限公司，批號：0503071；甲醇(色譜純)，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心。

1.3 儀器設備

LXJ-IIB低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；AEL-160型電子分析天平，日本島津公司；Forma低溫冰箱，Thermo公司；RC5C高速低溫離心機，美國杜邦公司；LS-55熒光分光光度計，Perkin-Elmer公司。

1.4 Rho-123供試液的配制

取Rho-123 1mg，用100μL的DMSO充分溶解，配制成濃度為10 mg/mL的Rho-123貯備液。取適量Rho-123貯備液，用生理鹽水分別稀釋至0.015 mg/mL(尾靜脈注射用)和0.2 mg/mL(腦室注射用)。

1.5 動物分組與給藥

取NIH小鼠，隨機分為冰片高、中、低劑量組(200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg，根據大鼠劑量按體表面積換算)，維拉帕米組(40 mg/kg，根據人等效劑量按體表面積換算)和溶劑對照組。各組均每日給藥2次，共7次，溶劑對照組給等體積的粟米油，容量均為20 mL/kg。末次給藥前小鼠禁食不禁水12 h，末次給藥后即刻，分別從尾靜脈(0.3mg/kg)和腦室(注射點為腦中線前鹵左側2 mm，深3 mm)注射Rho-123(0.3 mg/kg)。

1.6 樣品采集與處理

分別于注射Rho-123后1，5，10，20，30 min摘眼球取血，肝素抗凝，離心分離血漿，-70 ℃冰箱保存待測。斷頭取腦，剝去軟腦膜及腦表面血管，生理鹽水洗凈，濾紙吸盡水分，切取右半側腦組織，錫箔包裹，-70 ℃冰箱保存待測。

取血漿0.1 mL，加0.1mL生理鹽水和0.8 mL甲醇，渦旋10 s，15000 rpm/min離心10 min，取上清500 μL注入微量比色杯測定。

取腦組織，稱重，加入0.5 mL生理鹽水勻漿，15000 rpm/min離心10 min，取上清0.1 mL，加0.1 mL生理鹽水和0.8 mL甲醇，渦旋10 s，再15000 rpm/min離心10 min，取上清500 μL注入微量比色杯測定。

1.7 檢測方法

1.7.1 Rho-123標準溶液的配制 精密稱取Rho-123 1 mg，用100 μL的DMSO充分溶解，配制成濃度為10 mg/mL的Rho-123貯備液。取貯備液用生理鹽水配制成1，5，10，50，100 ng/mL系列濃度的Rho-123標準溶液。

1.7.2 血漿中Rho-123含量測定標準曲線的制備 取1，5，10，50，100 ng/mL系列濃度的Rho-123標準溶液0.1 mL于5支試管中，各加入0.1 mL空白血漿和0.8 mL甲醇，渦旋混勻，15000 rpm/min離心10 min，取上清于激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長520 nm處(狹縫寬度均為5 nm)測定熒光強度，以熒光強度對濃度進行線性回歸，得血漿Rho-123標準曲線方程為：Y = 5.476X-0.077，r = 0.9998，線性范圍為1～100 ng/mL。

1.7.3 腦組織中Rho-123含量測定標準曲線的制備 取1，5，10，50，100 ng/mL系列濃度的Rho-123標準溶液0.1 mL于5支試管中，各加入0.1 mL空白腦勻液和0.8 mL甲醇，渦旋混勻，15000 rpm/min離心10 min，取上清于激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長520 nm處(狹縫寬度均為5 nm)測定熒光強度，以熒光強度對濃度進行線性回歸，得腦組織Rho-123標準曲線方程為：Y = 6.544 X+9.918，r = 0.9997，線性范圍為1～100 ng/mL。

1.8 數據統計與處理

2 結果

2.1 冰片對小鼠尾靜脈注射Rho-123 血漿藥物濃度的影響

由表1，尾靜脈注射Rho-123后各時間點冰片各劑量組小鼠血漿Rho-123濃度均未見明顯改變，與溶劑對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。

組別Rho-123(ng/mL)1min5min10min20min30min溶劑對照組122.45±32.4761.11±25.8259.04±8.9343.09±10.0735.03±4.31維拉帕米組117.25±34.3866.98±15.4661.27±8.5945.28±7.7935.69±12.46冰片高劑量組105.32±22.7970.94±14.8856.27±7.9739.50±8.6830.99±10.43冰片中劑量組116.61±19.9162.49±6.1458.64±15.5539.77±14.3632.86±16.18冰片低劑量組122.05±25.2768.81±7.2957.08±23.2338.89±2.0633.64±2.59

2.2 冰片對小鼠尾靜脈注射Rho-123腦組織藥物濃度的影響

由表2可知，尾靜脈注射Rho-123后5，10，20和30 min，冰片高、中劑量組小鼠腦組織Rho-123含量均顯著升高，與溶劑對照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)，作用與維拉帕米相當。說明冰片能促進Rho-123透過BBB。

組別Rho-123(ng/g)1min5min10min20min30min溶劑對照組27.76±9.5032.89±17.1433.99±14.6727.44±11.5630.37±5.30維拉帕米組42.36±14.3357.34±12.64**63.22±14.13**51.24±10.21**50.33±12.01**冰片高劑量組39.03±13.5152.43±9.71**58.13±12.44**46.99±7.74**48.47±8.00**冰片中劑量組38.25±15.7151.15±8.97**53.66±14.45**42.87±8.42**41.42±9.06**冰片低劑量組28.10±10.4040.87±7.3241.54±11.5639.80±7.0436.70±4.14

注：與溶劑對照組比較*P<0.05，**P<0.01

2.3 冰片對小鼠腦室注射Rho-123 血漿藥物濃度的影響

由表3可知，腦室注射Rho-123后5，10，20和30 min，冰片高劑量組小鼠血漿Rho-123濃度顯著低于溶劑對照組(P<0.05)，其作用與維拉帕米相當；20，30 min，冰片中劑量組小鼠血漿Rho-123濃度亦顯著低于溶劑對照組(P<0.05)，其作用與維拉帕米相當。說明冰片能抑制Rho-123從腦組織外排。

組別Rho-123(ng/mL)1min5min10min20min30min溶劑對照組27.02±16.1643.45±16.5648.73±20.5228.68±9.0024.68±6.47維拉帕米組22.34±12.2323.77±9.68*28.64±10.29*20.23±4.67*17.64±5.69*冰片高劑量組23.72±14.5324.21±7.28*29.83±12.93*20.43±3.75*18.23±3.58*冰片中劑量組26.39±16.0835.14±19.8037.01±25.9321.68±5.95*19.68±4.02*冰片低劑量組24.74±9.8439.88±25.1438.53±16.3427.24±9.0122.24±6.36

注：與溶劑對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.4 冰片對小鼠腦室注射Rho-123 腦組織藥物濃度的影響

由表4可知，腦室注射Rho-123后1，5，10及20 min，冰片高劑量組小鼠腦組織Rho-123濃度顯著高于溶劑對照組(P<0.01或P<0.05)；5，10 min，冰片中劑量組小鼠腦組織Rho-123濃度亦顯著高于溶劑對照組(P<0.05)；其中5，10 min，冰片高劑量的作用與維拉帕米相當。說明冰片能抑制Rho-123從腦組織外排。

組別Rho-123(ng/g)1min5min10min20min30min溶劑對照組110.17±37.6470.89±7.5963.15±17.2340.75±13.6930.44±19.72維拉帕米組139.93±9.46*100.04±6.42**95.89±9.46**64.98±10.33**39.45±15.23冰片高劑量組146.55±12.45*97.86±5.50**93.31±5.81**56.82±15.82*38.15±9.44冰片中劑量組131.87±38.3985.55±15.48*81.57±16.97*43.48±5.9437.70±5.81冰片低劑量組125.53±48.0679.09±10.9866.46±17.6054.93±21.9944.53±24.25

注：與溶劑對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

冰片是一味傳統中藥，臨床較少單獨應用，常作為“佐使藥”，以增加其他藥物的治療效果，即中醫(yī)所謂的“獨行則勢弱，佐使則有功”[8]。現代藥理研究表明，冰片能促進許多藥物透過機體的生物屏障，如BBB、血眼屏障、胃腸屏障、皮膚屏障、鼻腔黏膜等[9-12]。研究表明，冰片能促進EB和利福平透過血眼屏障，保護缺血再灌注引起的視網膜損傷，其機制與抑制ICAM-1在視網膜內的聚集有關[10]。對其開放BBB的機制研究發(fā)現，冰片能升高BCECs內Ca2+濃度和iNOS活性，減少BCECs ICAM-1的表達，升高大鼠下丘腦組胺和5-羥色胺的含量，開放BBB內皮細胞間緊密連接，增加吞飲囊泡數量，抑制P-gp功能，但對P-gp的表達量無明顯影響[7,13]。Rho-123為P-gp底物，是常用的評價P-gp抑制劑活性的探針藥物[14-15]。

本實驗研究結果表明，尾靜脈注射Rho-123后，冰片對小鼠血漿Rho-123濃度無明顯影響，但能顯著升高小鼠腦組織Rho-123濃度，作用與維拉帕米相當。腦室注射Rho-123后，冰片高、中劑量組小鼠血漿Rho-123濃度顯著低于溶劑對照組，腦組織Rho-123濃度顯著高于溶劑對照組，其中高劑量組作用與維拉帕米相當，說明冰片能促進Rho-123透過BBB，抑制Rho-123從腦組織的外排，提示冰片能夠抑制BBB P-gp功能，也為冰片“佐使有功”的理論提供了實驗依據。

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( 責任編輯:竇鵬)

Effect of Borneol on the Function of P-glycoprotein in Blood Brain Barrier

YU Hao,ZHOU Guo-liang,MAO Bin-bin

(College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100,China)

To observe the effect of borneol on the function of P-glycoprotein in blood brain barrier(BBB).NIH mice were randomly divided into three borneol groups(high,middle and low dose groups),verapamil group and millet oil group,and

respectively borneol, verapamil or millet oil by intragastric administration for 7 times，twice each day.Subsequently intravenous injection(IV)or cerebral ventricle injection(ICV) rhodamine 123(Rho-123) respectively,the concentrations of Rho-123 in plasma and brain tissue were measured by fluorometric detection.After IV administration with Rho-123 the plasma rhodamine 123 concentrations of three borneol groups had no significant change compared with millet oil group,at 5,10,20,30 min the cerebral Rho-123 concentrations of borneol high and middle dose groups were increased significantly compared with millet oil group.At 5,10,20,30 min after ICV administration with Rho-123 the plasma administration with Rho-123 concentrations of borneol high dose group were decreased significantly. At 20,30 min the plasma Rho-123 concentrations of borneol middle dose group were also decreased significantly compared with millet oil group.At 1,5,10,20 min the cerebral Rho-123 concentrations of borneol high dose group were increased significantly. At 5,10 min the cerebral Rho-123 concentrations of borneol middle dose group were also increased significantly compared with millet oil group.The results show that borneol could inhibit P-gp function of BBB.

Borneol;Blood brain barrier;P-glycoprotein;Rhodamine 123

2014-11-26

安徽高校省級自然科學研究重點項目(KJ2014A051)；安徽科技學院—江蘇華生安頤生物科技有限公司合作項目。

俞浩(1975-)，男，安徽省定遠縣人，博士，副教授，主要從事中藥藥理學和保健食品學研究。

R285.5

A

1673-8772(2015)02-0034-05