冰片衍生物對(duì)血腦屏障通透性影響的研究

陳傳兵， 劉昌輝， 伍海濤， 張榮， 趙威， 李偉榮， 楊蕾， 宓穗卿， 王寧生

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405）

血腦屏障是多樣而復(fù)雜的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，它允許血液循環(huán)中腦組織所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)，有效地阻擋有害物質(zhì)的侵入，又能將代謝產(chǎn)物排出，并根據(jù)腦內(nèi)成分的各種需要作出反應(yīng)，從而維持腦環(huán)境的恒定，保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能。但血腦屏障同時(shí)也阻礙了藥物進(jìn)入大腦，導(dǎo)致藥物難以透過(guò)血腦屏障達(dá)到腦內(nèi)有效治療濃度，從而給腦部疾病如腦腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、藥物成癮性等疾病的治療造成困難。冰片是一種常用中藥，具有廣泛的藥理作用，如：鎮(zhèn)痛抗炎[1]、抗菌[2]、抗血栓[3]等，最突出的是促進(jìn)藥物透過(guò)血腦屏障的作用[4-5]。在長(zhǎng)期的臨床用藥中，冰片自身存在的弱點(diǎn)逐漸顯露出來(lái)，如藥效作用不強(qiáng)、刺激性大、揮發(fā)性強(qiáng)[6]，并存在一定毒副作用等[7]特點(diǎn)，這些成為了影響冰片臨床應(yīng)用的主要因素。為了降低冰片毒副作用，增強(qiáng)藥效，課題組前期對(duì)冰片進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了多個(gè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的冰片衍生物[8-9]，并研究了冰片衍生物的鎮(zhèn)痛作用[10]和對(duì)驚厥模型小鼠氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響[11]。本研究通過(guò)比較10種冰片衍生物與冰片在小鼠體內(nèi)透血腦屏障效果，篩選藥效作用較強(qiáng)、不易揮發(fā)，毒副作用較低的冰片衍生物，為開(kāi)發(fā)新一代透血腦屏障藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，這對(duì)于拓展冰片的應(yīng)用范圍，對(duì)腦靶向給藥系統(tǒng)的研究和腦部疾病的治療具有較大的參考價(jià)值?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（18±5）g，由廣東省衛(wèi)生廳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCKK粵2008-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d（溫度20～25℃，濕度60%～70%）后，用于實(shí)驗(yàn)。給藥前小鼠禁食過(guò)夜，自由飲水。

1.2藥物與試劑2-氯苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、3-硝基苯甲酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯、對(duì)氯苯甲酸冰片酯、苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯（冰片衍生物均為本課題組自制，純度大于98%）；5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），吐溫-80，右旋冰片（含量97.5%，江西吉安林科天然冰片廠生產(chǎn)，使用前研粉，過(guò)100目篩備用）。醫(yī)用酒精，生理鹽水、丙酮、伊文思藍(lán)（購(gòu)自廣州東巨化學(xué)試劑公司，均為分析純）。

1.3儀器AUM2200電子分析天平（日本Shimadzu公司）；KDC-220HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；EnSpire多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）。

1.4藥液配制精密稱取0.4 g伊文思藍(lán)轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶中，加生理鹽水定容至刻度線即得0.4%溶液（w/v）；丙酮和生理鹽水混勻（7∶3）（v∶v）即得用于勻漿的混合液。各精密稱取2-氯苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、3-硝基苯甲酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯、4-氯苯甲酸冰片酯0.5 g，研磨后各加5%CMC-Na助溶配成懸浮液（50 mg/mL）；各精密稱取0.5 g苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯，研磨后加5%吐溫-80助溶配成溶液（50 mg/mL）；精密稱取0.5 g右旋冰片2份，一份研磨后加10 mL 5%CMC-Na助溶配成濃度為50 mg/mL的懸浮液，另一份研磨后加入10 mL 5%吐溫-80助溶配成濃度為50 mg/mL的溶液。

1.5伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制用空白小鼠腦漿配制伊文思藍(lán)倍釋系列濃度溶液0、1、2、5、10、20、50μg/g，用酶標(biāo)儀于630 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6分組與給藥方法根據(jù)藥物的溶解性，采用2種溶劑作對(duì)照，即CMC-Na組和吐溫-80組。其中：CMC-Na組包括5%CMC-Na溶劑組、右旋冰片（陽(yáng)性對(duì)照）組、2-氯苯甲酸冰片酯組、4-氯苯甲甲酸冰片酯組、3-硝基苯甲酸冰片酯組、4-硝基苯甲酸冰片酯組、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯、1-萘乙酸冰片酯組，每組16只，雌雄各半；吐溫-80組包括吐溫-80溶劑組、右旋冰片組（陽(yáng)性對(duì)照）、苯甲酸冰片酯組、3-甲基苯甲酸冰片酯組、4-甲基苯甲酸冰片酯組、三氯乙酸冰片酯組，每組16只，雌雄各半。

1.7透血腦屏障作用實(shí)驗(yàn)小鼠按體質(zhì)量（0.02 mL/g）灌服給藥60 min后，于尾靜脈注射0.4%伊文思藍(lán)溶液（10 mL/kg），2 min后斷頭取腦，腦組織用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱質(zhì)量，按1∶8（w∶v）加入丙酮-生理鹽水（7∶3）（v∶v）勻漿，勻漿液于70℃孵育0.5 h，以3 000 r/min離心15 min，取200μL上清液，用酶標(biāo)儀于630 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其光密度。

1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1伊文思藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。酶標(biāo)儀法：y=0.010 5x+0.050 3，R2=0.999 6。結(jié)果表明線性關(guān)系良好，符合生物樣品測(cè)定要求。

2.2酶標(biāo)儀法測(cè)定冰片衍生物開(kāi)放血腦屏障作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果用CMC-Na作助溶劑的冰片衍生物中，2-氯苯甲酸冰片酯組血腦屏障通透性效果顯著優(yōu)于右旋冰片組（陽(yáng)性對(duì)照），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；4-硝基苯甲酸冰片酯和1-萘乙酸冰片酯組效果與右旋冰片組相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而4-硝基苯甲酸冰片酯組、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯組、1-萘乙酸冰片酯的效果顯著低于右旋冰片組。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線（酶標(biāo)儀法）Figure 1 Evens blue standard curve（enzyme-labeled instrument method）

表1 用CMC-Na作助溶劑的冰片衍生物對(duì)小鼠血腦屏障通透性的影響Table 1 Effect of borneolderivatives dissolved in CMC-Na on blood-brain-barrier permeability in mice （x±s）

用吐溫-80作助溶劑的冰片衍生物中，各藥物組與右旋冰片組（陽(yáng)性對(duì)照）相比，效果相當(dāng)，無(wú)顯著性差異（P>0.05），具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 用吐溫-80作助溶劑的冰片衍生物對(duì)小鼠血腦屏障通透性的影響Table 2 Effect of borneolderivatives dissolved in Tween-80 on blood-brain-barrier permeability in mice （x±s）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在10種冰片衍生物中，只有2-氯苯甲酸冰片酯的血腦屏障通透性優(yōu)于右旋冰片；苯甲酸冰片酯、3-甲基苯甲酸冰片酯、4-甲基苯甲酸冰片酯、三氯乙酸冰片酯、4-硝基苯甲酸冰片酯和萘乙酸冰片酯效果與右旋冰片相當(dāng)；3-硝基苯甲酸冰片酯、3，5-二硝基苯甲酸冰片酯和4-氯苯甲酸冰片酯效果低于右旋冰片。2-氯苯甲酸冰片酯的血腦屏障通透性顯著優(yōu)于右旋冰片，因此，其有望開(kāi)發(fā)成為新一代透血腦屏障的藥物。