反義miR-224在結腸癌組織中的表達及其對癌細胞增殖的影響

胡剛 湛匯

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·論 著·(胃腸道腫瘤專題)

反義miR-224在結腸癌組織中的表達及其對癌細胞增殖的影響

胡剛 湛匯

目的 探討微小RNA(miRNA)miR-224在結腸癌組織中的表達，以及對體外癌細胞增殖和凋亡的影響。方法 收集2011年2月至2014年3月行手術治療的134例結腸癌和癌旁組織標本，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)檢測標本中miR-224表達情況；對人結腸癌細胞SW480進行miR-224反義寡核苷酸轉染并培養(yǎng)，利用克隆形成實驗和流式細胞儀檢測miR-224反義寡核苷酸對SW480細胞增殖和凋亡的影響，利用Real-time PCR和Western blot法對不同轉染組細胞中Bcl-2表達情況進行檢測。結果 miR-224在結腸癌組織中相對表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)；反義miR-224組人結腸癌SW480細胞克隆形成率顯著低于對照組，而細胞凋亡指數(shù)則高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；反義miR-224組細胞Bcl-2相對表達量和蛋白相對表達量均低于對照組(P<0.05)。結論 miR-224在結腸癌組織中呈高表達，減少miR-224表達可抑制結腸癌細胞增殖，并加速細胞凋亡，有可能成為結腸癌早期發(fā)現(xiàn)及基因治療的新靶位。

結腸癌；微小RNA-224；反義寡核苷酸技術；表達；細胞增殖

結腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近年來該病發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，韓雪等[1]研究顯示，上海市楊浦區(qū)常住居民結腸癌的粗發(fā)病率和粗死亡率分別從2002的25.52/10萬和15.41/10萬，上升到2012年的31.76/10萬和26.17/10萬。該病早期不具有典型的臨床癥狀，常會導致漏診或誤診，一旦發(fā)現(xiàn)已進展為中晚期，增加了治療難度，因此，如何從分子或基因水平尋找敏感指標以早期發(fā)現(xiàn)和診斷已成為研究重點。微小RNA(miRNA)是廣泛存在于細胞內(nèi)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在腫瘤發(fā)生、進展過程中發(fā)揮重要作用，而近年來的研究報道亦指出[2-4]，miR-155、miR-21、miR-17等微小RNA在結腸癌發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用。有研究顯示[5]，miR-224在胃癌、肝癌等惡性腫瘤中過表達，與腫瘤轉移及侵襲力密切相關。本研究對結腸癌組織中miR-224表達情況進行分析，并利用反義寡核苷酸技術通過抑制miR-224在結腸癌中的表達，探討其對細胞增殖及凋亡的影響。

材料與方法

一、一般資料

收集2011年2月至2014年3月在我院擇期行手術治療的134例結腸癌和癌旁組織標本，所有病人術前均未進行放化療治療，均經(jīng)病理學確診，其中，男性73例，女性61例，年齡(43.5±7.4)歲。

二、方法

1.實驗細胞及主要試劑和設備 人結腸癌細胞株SW480購自上海瑞齊生物科技，TRIzol試劑盒購自美國Sigma公司，胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基均購自武漢博士德生物，脂質(zhì)體LipfectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，反義miR-224寡核苷酸購自上海藍基生物科技，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司，TaqMan pri-miRNA試劑盒購自美國ABI公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)儀購自美國Stratagene公司，Epics Altra型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，總蛋白提取試劑盒購自上海純優(yōu)生物科技，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體購自上海信裕生物科技。

2.Real-time PCR檢測標本中miR-224表達 利用TRIzol試劑盒對結腸癌及癌旁組織中RNA進行提取，利用紫外分光光度計對其濃度進行測定。將提取的總RNA置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｈ? μg總RNA作為反應模板，取3 μl逆轉錄酶進行混合，稀釋至20 μl作為反應體系，依次進行16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min反應，結束后，對cDNA進行收集，按照1∶150稀釋后，取稀釋液1 μl與TaqMan引物2 μl進行混合，稀釋至20 μl作為反應體系，依次進行95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、59 ℃ 60 s，40個循環(huán)反應，以U6 snRNA作為參照，采用Ct值對miRNA相對表達進行精確計算。

3.反義miR-224寡核苷酸序列設計 根據(jù)MiRBase數(shù)據(jù)庫中提供的基因序列獲得人miR-224序列，并在miR-224序列的基礎上，設計完成反義miR-224寡核苷酸相應序列：順義鏈5’-AGUCACUAGUGGUUCCGUUUA-3’，反義鏈5’-TAAACGGAACCACTAGTGACT-3’，并進行同源序列排除，同時設計對照序列，順義鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUT-3’，反義鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAT-3’，均由上海藍基生物科技完成。

4.細胞培養(yǎng)及轉染 將人結腸癌細胞株SW480接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃、5% CO2條件下。參照LipfectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行轉染，反義miR-224寡核苷酸終濃度分別選取50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L和200 nmol/L，篩選出100 nmol/L為最佳干擾濃度，轉染后培養(yǎng)時間最終確定為48 h。重復進行實驗3次。

5.克隆形成實驗測定轉染細胞增殖情況 取結腸癌SW480細胞轉染后對數(shù)生長期細胞，利用3%胰蛋白酶進行消化后，將細胞接種在6孔培養(yǎng)板上，每孔600～700個細胞，于37℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)14～21周，對細胞生長情況進行觀察。當培養(yǎng)皿中觀察到克隆細胞團時，停止培養(yǎng)。將上清液移除，利用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行漂洗2次。用甲醇進行固定20 min，將固定液去除后用吉姆薩染液染色30 min，利用重蒸水進行清洗。干燥后于顯微鏡下計數(shù)>50個細胞克隆數(shù)，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，重復進行3次實驗。

6.流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 將結腸癌SW480細胞接種在6孔板上，轉染反義miR-224寡核苷酸后48 h，將細胞收集并制備成單細胞懸液，利用PBS進行漂洗2次后，進行3 000 r/min離心5 min，棄上清液，利用凋亡檢測試劑盒和流式細胞儀對細胞早期凋亡進行檢測，重復進行實驗3次。

7.Real-time PCR對細胞中Bcl-2 mRNA表達情況檢測 將不同轉染組培養(yǎng)的細胞分別加入細胞裂解液中，提取總RNA并逆轉錄cDNA，Bcl-2引物：上游5’-AACTGGGGGAGGATTGTGGC-3’，下游5’-GATCCAGGTGTGCAGGTGCC-3’，內(nèi)參照采用GAPDH，Real-time PCR檢測細胞中Bcl-2 mRNA表達。

8.Western blot法對細胞中Bcl-2蛋白表達情況檢測 將不同轉染組培養(yǎng)的細胞分別進行收集，利用總蛋白提取試劑盒進行總蛋白提取，經(jīng)SDS-PAGE后進行轉膜，將膜放置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中進行封閉120 min，溫度設置37 ℃。將鼠抗人Bcl-2單克隆抗體按1∶500稀釋后加入，4 ℃條件下過夜孵育。用TBST緩沖液進行洗膜后，將1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG加入，于37℃條件下進行孵育120 min，用BST緩沖液進行洗膜，以β-actin為內(nèi)參，利用電化學發(fā)光法對蛋白條帶進行分析。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、miR-224基因表達與臨床特點相關性

Real-time PCR結果顯示，miR-224基因在結腸癌組織中相對表達水平顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；發(fā)生淋巴轉移的相對表達量顯著高于未發(fā)生轉移，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見表1。

表1 miR-224在結腸癌及癌旁組織中表達情況±s)

二、miR-224表達對人結腸癌SW480細胞增殖及凋亡的影響

反義miR-224組人結腸癌SW480細胞克隆形成率為6.37±1.24，顯著低于對照組的29.74±7.65，而細胞凋亡指數(shù)(17.05±1.62)則高于對照組(4.27±1.15)，差異均具有統(tǒng)計學意義(t值為35.232和71.757，均P<0.05)，詳見圖1和圖2。

三、miR-224表達對細胞內(nèi)Bcl-2表達的影響

反義miR-224組細胞Bcl-2 mRNA相對表達量(1.97±0.54)和蛋白相對表達量(0.27±0.06)均低于對照組(5.03±1.04和0.91±0.11)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖3和圖4。

圖1 人結腸癌SW480細胞增殖(A)及凋亡(B)情況

圖2 轉染后人結腸癌SW480細胞生長變化情況

圖3 人結腸癌SW480細胞中Bcl?2mRNA相對表達量

圖4 人結腸癌SW480細胞內(nèi)Bcl?2表達情況

討 論

miRNA是長度22nt左右的單鏈小RNA分子，在細胞增殖、凋亡及組織發(fā)育方面發(fā)揮重要調(diào)控作用[6]。有研究指出[7]，miRNA異常表達與多個系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生及進展有關。miRNA通過調(diào)控與腫瘤形成相關的基因和傳導通路而對腫瘤發(fā)生及進展產(chǎn)生作用，因此，可能成為腫瘤診斷及判斷預后的新標志物。鑒于miRNA對靶基因的表達調(diào)控可發(fā)生在轉錄后，這為早期發(fā)現(xiàn)及診斷腫瘤提供了可能，臨床應用前景廣闊[8]。

結腸癌已位居我國腫瘤發(fā)病譜第四位[9]。隨著基礎研究的不斷深入，miRNA在腫瘤調(diào)控中的生物學作用逐漸被人們所熟知，鑒于其在多個系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生及進展中呈異常表達，因此，篩選在腫瘤發(fā)生過程中出現(xiàn)異常表達的miRNA，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及確診提供了可能。有研究表明[10]，在肝癌細胞中miR-224呈過表達，并與病人預后密切相關。Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-224與乳腺癌細胞的侵襲和轉移密切相關。Rokavec等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-224與食管癌發(fā)生及進展密切相關，可以作為食管癌基因治療的靶點。本研究首先在檢測中發(fā)現(xiàn)，miR-224在結腸癌組織中表達上調(diào)，結合以往研究提示miR-224在結腸癌發(fā)生進展過程中可能發(fā)揮重要作用，反義寡核苷酸技術是通過構建或人工合成的反義表達載體表達的寡核苷酸片段，能夠起到干預基因正常解旋、復制、轉錄、加工、轉運等各環(huán)節(jié)，為進一步研究miR-224在結腸癌細胞中的作用，本研究中通過反義寡核苷酸技術降低了結腸癌細胞SW480中miR-224的表達，同時，利用克隆形成實驗檢測轉染細胞增殖情況，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，從而就miRNA在調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡過程中的生物學性能進行系統(tǒng)的研究[13]，相比于單純就腫瘤細胞中miRNA表達情況的研究，本研究比較系統(tǒng)、直觀，說服力更強，選取的指標更能夠為其生物學性能提供可靠的實驗室證據(jù)。本研究顯示，miR-224基因在結腸癌組織中相對表達水平顯著高于癌旁組織，發(fā)生淋巴轉移的相對表達量顯著高于未發(fā)生轉移，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明miR-224與結腸癌發(fā)生密切相關，并可能與腫瘤發(fā)生淋巴結轉移密切相關，在結腸癌病理過程中發(fā)揮重要作用。結果顯示，反義miR-224組人結腸癌SW480細胞克隆形成率顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明miR-224在結腸癌細胞成長過程中發(fā)揮重要作用。同時，本研究采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況顯示，反義miR-224組人結腸癌SW480細胞凋亡指數(shù)高于對照組(P<0.05)，表明miR-224與結腸癌細胞凋亡密切相關。目前，已有的研究已充分證實Bcl-2與細胞凋亡密切相關[14]，Bcl-2是Bcl-2家族最有代表性的凋亡抑制因子，主要存在于核膜、線粒體外膜和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，表達產(chǎn)物能夠有效降低各種刺激所引發(fā)的細胞凋亡。本研究為探討miR-224在結腸癌細胞中發(fā)揮作用是否與其他蛋白有關，同時，參考有關文獻報道[15]，對不同轉染組細胞Bcl-2表達情況進行了檢測。本研究結果顯示，反義miR-224組細胞Bcl-2 mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均低于對照組(P<0.05)，提示反義miR-224通過抑制結腸癌細胞中Bcl-2表達而加速細胞凋亡發(fā)生，進一步實現(xiàn)對腫瘤細胞增殖過程的調(diào)控作用，下一步，我們將對miR-224與Bcl-2相關性及可能的作用機制進一步進行探討。

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Expression of antisense miR-224 in colon cancer and its effect on cancer cell proliferation

HuGang,ZhanHui.

DepartmentofGeneralSurgery,HuangshiCentralHospital,Huangshi435000,China

Correspondingauthor:ZhanHui,Email: 240690712@qq.com

Objective To explore the expression of miR-224 in colon cancer and examine its effect on the proliferation and apoptosis of cancer cell.Methods A total of 134 cases of colon cancer and adjacent tissue specimens were collected from Feb. 2011 to Mar. 2014. And the expression of miR-224 was detected by real-time polymerase chain reaction (PCR). Human colon cancer cell SW480 was transfected by miR-224 antisense oligonucleotide and cultured. The effects of miR-224 antisense oligonucleotide on cellular proliferation and apoptosis were detected by colony formation assay and flow cytometry. And the expressions of Bcl-2 in differentially transfected cells were detected by real-time PCR and Western blot.Results The relative expression of miR-224 was significantly higher in colon cancer tissue than that in adjacent tissues. And the difference was statistically significant (P<0.05). The colony formation rate of SW480 human colon cancer cell in antisense miR-224 group was significantly lower than that in control group while the apoptotic index was higher. And the differences were statistically significant (P<0.05). The relative expressions of Bcl-2 mRNA and protein were lower in antisense miR-224 group than those in control group. And the differences were all statistically significant (P<0.05).Conclusions There is an over-expression of miR-224 in colon cancer. And its down-regulation may effectively inhibit the proliferation and accelerate the apoptosis of colon cancer cell. It will probably become a new target for early detection and gene therapy of colon cancer.

Colon cancer; miR-224; Antisense oligonucleotide; Expression; Cell proliferation

435000 湖北黃石，黃石市中心醫(yī)院普外一科

湛匯，Email:240690712@qq.com

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.01.012

2014-11-06)