攜帶SLC基因的Birc5－siRNA質粒載體的構建及鑒定＊

舒 榕，王 強，朱慧芬，孫媛麗，賀 琪， 萬京華

1湖北省中山醫(yī)院麻醉科，武漢 430033

2武漢科技大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物與免疫學系，武漢 430065

3華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院免疫學系，武漢 430030

實驗研究

攜帶SLC基因的Birc5－siRNA質粒載體的構建及鑒定＊

舒 榕1，王 強2△，朱慧芬3，孫媛麗3，賀 琪3， 萬京華2

1湖北省中山醫(yī)院麻醉科，武漢 430033

2武漢科技大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物與免疫學系，武漢 430065

3華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院免疫學系，武漢 430030

目的 構建攜帶SLC基因的Birc5－siRNA質粒載體，為腫瘤靶向治療研究提供基礎。方法 使用Ambion公司siRNATarget Finder設計的Birc5mRNA干擾序列，將Birc5－siRNA插入載體PEGFP6－1后轉化大腸埃希菌擴增培養(yǎng)，提取質粒；將SLC插入質粒pGenesil－8后轉化細菌擴增培養(yǎng)，提取質粒；挑取酶切鑒定正確的質粒轉化菌液測序鑒定；采用分子克隆技術構建特異性沉默Birc5且攜帶SLC基因的質粒，命名為pgsiRNA－Birc5＋SLC。結果 質粒Birc5能被EcoRⅠ酶切出1條約400bp的DNA條帶，說明Birc5－siRNA已插入質粒載體PEGFP6－1；pGenesil－8－SLC能被BglⅡ＋XbaⅠ酶切出1條約430bp的DNA條帶，說明SLC插入正確；酶切鑒定正確的質粒轉化菌液Birc5－siRNA和SLC測序結果顯示均為插入正確的克隆質粒；經(jīng)酶切鑒定分析顯示pgsiRNA－Birc5＋SLC符合酶切鑒定結果，表明攜帶SLC基因的Birc5－siRNA質粒載體構建成功。結論 成功構建了攜帶SLC基因的Birc5－siRNA質粒，為進一步研究靶向沉默腫瘤Birc5基因并趨化淋巴細胞抗腫瘤研究提供了工具和基礎。

次級淋巴組織趨化因子； Birc5； siRNA； 腫瘤

Birc5選擇性高表達于多種腫瘤，與腫瘤的耐藥、高復發(fā)率和患者的低存活率相關聯(lián)，沉默其表達可作為誘導腫瘤細胞凋亡的策略，然而通過沉默Birc5的表達誘導腫瘤細胞凋亡并未取得滿意的效果［13］。次級淋巴組織趨化因子（secondary lymphoid－tissue chemokine，SLC）為重要的CC族趨化因子成員，在生理狀況下，SLC在T細胞向淋巴結遷移和定位中發(fā)揮重要作用，并可通過促進腫瘤細胞免疫，或者抑制血管的生成而間接抑制腫瘤的生長［45］?；诖?，本研究構建了攜帶SLC基因的Birc5－siRNA質粒載體，為靶向沉默腫瘤Birc5基因并趨化淋巴細胞增強抗腫瘤免疫研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.coli DH5α菌株由華中科技大學同濟醫(yī)學院免疫學系保存；線性化質粒PEGFP6－1、PEGFP6－3載體和質粒pGenesil－8載體購自Genesil公司、Wizard?基因組DNA純化試劑盒、質粒提取、純化試劑盒購自Qiagen公司；所用酶類BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、EcoRⅠ、SalⅠ、BglⅡ、MluⅠ、XbaⅠ、Ex Taq聚合酶、PstⅠ購自TaKaRa公司；Birc5引物、SLC引物和β－actin引物均購自上海英駿生物技術有限公司。常用試劑中電泳及分離試劑均為分析純試劑配制。

1.2 siRNA序列的設計與合成

目的基因:SLC和Birc5。使用Ambion Target finder軟件設計針對Birc5的siRNA序列。利用BLAST搜索選擇針對人類Birc5mRNA（GenBank accession no.NM＿001168.1）外顯子3（5′－AGCATTCGTCCGGTTGCGCTT－3′）的21核苷酸系列，構建針對Birc5的干擾質粒，命名為pgsiRNA－Bir。構建能特異性沉默Birc5且攜帶SLC基因的質粒，命名為pgsiRNA－Birc5＋SLC。

引物結構:BamHⅠ＋Sense＋Loop＋Antisense＋終止信號＋EcoRⅠ／SalⅠ＋HindⅢ

1.3 載體的構建

流程見圖1。

圖1 載體構建流程圖Fig.1 The flow chart of vector construction

1.3.1 Birc5－siRNA載體的構建 退火單鏈目的基因片段Birc5－siRNA與線性化質粒載體PEGFP6－1連接。取5μL過夜連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含Kanar抗性（終濃度30μg／mL）的LB平板上選擇培養(yǎng)。用試劑盒小量提取質粒，用EcoRⅠ做酶切鑒定，挑取酶切鑒定正確的質粒轉化菌液Birc5－siRNA測序，命名為PEGFP6－1－Birc5。

1.3.2 SLC載體的構建 分別以SLC－f、SLC－r為上下游引物，以質粒SLC－RFP為模板，體外PCR擴增基因SLC片段。1%Agarose凝膠電泳回收約430bp基因SLC PCR產(chǎn)物。BglⅡ＋EcoRⅠ雙酶切pGenesil－8、SLC，分別回收載體大片段和SLC目的基因片段，通過連接酶連接。取5μL過夜連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5α，分別涂布于含Kanar抗性（終濃度30μg／mL）的LB平板上選擇培養(yǎng)。用試劑盒小量提取質粒，并分別用BglⅡ＋EcoRⅠ做酶切鑒定。挑取酶切鑒定正確的質粒轉化菌液pGenesil－8－SLC測序，命名為pGenesil－8－SLC。

1.3.3 Birc5－siRNA＋SLC載體的構建 MluⅠ和XbaⅠ雙酶切質粒pGenesil－8－SLC、Birc5－siRNA，分別回收大片段和小片段。1%Agarose凝膠電泳分別回收質粒pGenesil－8－SLC MluⅠ和XbaⅠ大片段、質粒Birc5－siRNA MluⅠ和XbaⅠ小片段，通過連接酶連接質粒Birc5－siRNA回收小片段與pGenesil－8－SLC回收大片段。取5μL過夜連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5α，分別涂布于含Kanar抗性（終濃度30μg／mL）的LB平板上選擇培養(yǎng)。用試劑盒小量提取質粒，并分別用EcoRⅠ和MluⅠ和XbaⅠ做酶切鑒定，命名為pgsiRNA－Birc5＋SLC。大規(guī)模提取質粒pgsiRNABirc5＋SLC，儲存在4℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結果

2.1 Birc5－siRNA載體的構建與鑒定

Birc5－siRNA目的基因插入載體PEGFP6－1，經(jīng)轉化細菌、擴增培養(yǎng)、提取質粒與酶切鑒定（圖2）。質粒PEGFP6－1的多克隆位點（MCS）如下:

－MluⅠ－HindⅢ－ShRNA－BamHⅠ－U6Promoter－EcoRⅠ－SalⅠ－XbaⅠ－PstⅠ－

圖2 EcoRⅠ酶切質粒PEGFP6－1－Birc5后1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 1%Agarose gel electrophoretogram of the PEGFP6－1－Birc5 digested by EcoRⅠ

因為質粒載體PEGFP6－1只含有1個EcoRⅠ的酶切位點，而Birc5的ShRNA序列我們設計了1個EcoRⅠ的酶切位點，故質粒Birc5－siRNA－1和Birc5－siRNA－3均能被EcoRⅠ酶切出1條約400bp的DNA條帶，說明目的基因片段Birc5－siRNA已經(jīng)插入到質粒載體PEGFP6－1。

挑取酶切鑒定正確的質粒轉化菌液Birc5－siRNA送公司測序，測序結果見圖3。經(jīng)測序分析:均為插入正確的克隆質粒，而且質量均符合設計要求。

圖3 Birc5－siRNA質粒轉化菌液測序結果Fig.3 The sequencing results of the plasmid Birc5－siRNA

2.2 SLC載體的構建與鑒定

目的基因SLC插入質粒pGenesil－8，經(jīng)轉化細菌、擴增培養(yǎng)、提取質粒與酶切鑒定。質粒pGenesil－8的多克隆位點（MCS）如下:

－CMV Promoter－NheⅠ－BglⅡ－XhoⅠ－EcoRⅠ－PstⅠ－IRES－EGFP－SV40polyA－MluⅠ－ShRNAU6Promoter－XbaⅠ－

基因SLC插入在質粒pGenesil－8的BglⅡ和EcoRⅠ之間，如若插入正確，就能被BglⅡ＋XbaⅠ酶切出1條約430bp的DNA條帶；經(jīng)酶切鑒定分析:pGenesil－8－SLC－2和pGenesil－8－SLC－3均符合酶切鑒定結果（圖4）。

挑取酶切鑒定正確的質粒轉化菌液pGenesil－8－SLC送公司測序，測序結果見圖5。經(jīng)測序分析:均為插入正確的克隆質粒，而且質量均符合設計要求。

圖4 BglⅡ和EcoRⅠ酶切質粒pGenesil－8－SLC后1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 1%Agarose gel electrophoretogram of the pGenesil－8－SLC digested by BglⅡand EcoRⅠ

圖5 pGenesil－8－SLC質粒轉化菌液測序結果Fig.5 The sequencing results of the plasmid pGenesil－8－SLC

2.3 pgsiRNA－Birc5＋SLC載體的構建與鑒定

MluⅠ和XbaⅠ雙酶切質粒pGenesil－8－SLC、Birc5－siRNA，連接質粒Birc5－siRNA回收小片段與pGenesil－8－SLC回收大片段，抗性培養(yǎng)篩選，小提質粒并分別用EcoRⅠ和MluⅠ＋XbaⅠ做酶切鑒定。質粒pGenesil－8的多克隆位點（MCS）如下:

－CMV Promoter－NheⅠ－BglⅡ－XhoⅠ－EcoRⅠ－PstⅠ－IRES－EGFP－SV40polyA－MluⅠ－ShRNAU6Promoter－XbaⅠ－

片段Birc5插入在質粒pGenesil－8的MluⅠ和XbaⅠ之間，如若插入正確，就能被EcoRⅠ酶切出1條約1 600bp的DNA條帶；經(jīng)酶切鑒定分析: pGenesil－8－Birc5和pGenesil－8－SLC－Birc5均符合酶切鑒定結果（圖6）。

圖6 EcoRⅠ酶切質粒pgsiRNA－Birc5＋SLC后1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.6 1%Agarose gel electrophoretogram of the plasmid pgsiRNA－Birc5＋SLC digested by EcoRⅠ

3 討論

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是近年來發(fā)現(xiàn)的一凋亡調(diào)控蛋白家族，在許多物種中廣泛存在，包括病毒、真核生物、哺乳動物等。Birc5是由142個氨基酸組成的胞質蛋白，分子量為16.5kD，是IAP家族中分子量最小的一個成員，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞分裂的重要功能。1997年Birc5由耶魯大學的Altieri等［6］，用效應細胞蛋白酶受體1（effector cell protease receptor 1，EPR－1）cDNA在人類基因組庫的雜交篩選中首次分離出來，自從被發(fā)現(xiàn)以來，Birc5就逐漸成為生物靶向治療的重要分子，對其在惡性腫瘤治療中的應用研究也日趨深入。

本課題組前期研究工作證明，以Birc5作為抗腫瘤的靶點，采用反義寡聚核苷酸、核酶、Birc5突變體、干擾RNA等策略具有沉默其表達與誘導腫瘤細胞凋亡的效應，但其效應有待增強。本課題采用RNA干擾技術，利用針對Birc5編碼基因的siRNA重組質粒，即pgsiRNA－Bir，導入肝癌細胞株HepG2中，結果顯示siRNA能抑制腫瘤細胞Birc5的表達，誘導腫瘤細胞的凋亡。此外，我們發(fā)現(xiàn)Birc5在臨床肝細胞癌組織（與癌旁組織相比）、肝癌細胞系HepG2（與正常肝細胞L02相比）中均高表達［7］，這提示Birc5是肝癌細胞存活、抵抗凋亡的重要因子。

SLC是唯一的具有抗血管形成作用的CC類趨化因子，它可以抑制血管生成進而抑制腫瘤生長。注入SLC后，VEGF、PGE2、TGF－β這些促進血管生成因子的量均明顯下降，INF－γ升高，繼而引起抑制血管生成的MIG和IP－10的升高，最終起到抑制腫瘤血管生成的作用。SLC亦可通過誘導樹突狀細胞（DC）及淋巴細胞抑制腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)肺癌小鼠注射轉染有SLC的DC比僅注射DC的小鼠根治率要高，向SLC缺乏的plt小鼠經(jīng)皮注射SLC，能使T細胞有效地向淋巴結遷移［8］。DC從腫瘤部位遷移向引流淋巴結的過程中，區(qū)域淋巴內(nèi)SLCmRNA增高，說明在誘導DC及淋巴細胞的抗瘤免疫反應中SLC起到重要作用［5，9］。

基于此，我們設計與構建了攜帶SLC基因的Birc5－siRNA質粒載體，為進一步探討靶向沉默腫瘤Birc5基因并趨化淋巴細胞增強抗腫瘤免疫研究提供了基礎。

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（2014－09－18 收稿）

Construction and Identification of Birc5－siRNA Vector Carrying SLC Gene

Shu Rong1，Wang Qiang2△，Zhu Huifen3et al
1Department of Anesthesiology，Hubei Zhongshan Hospital，Wuhan 430033，China
2Department of Pathogenic Biology and Immunology，School of Basic Medical Science，Medical College of Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430065，China
3
Department of Immunology，School of Basic Medical Science，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To construct the Birc5－siRNA vector carrying SLC in order to provide a basis for the research on tumor biological targeted therapy.Methods Interfering sequences of Birc5were designed by using Ambion Target Finder.The Birc5－siRNA was inserted into PEGFP6－1，and then transformed and cultured with E.coli.Afterwards，the plasmid was extracted and identified.SLC was inserted into pGenesil－8，which was transformed，cultured with E.coli，followed by the extraction and identification of the plasmid.The bacterial transformation solution was selected after identification with enzyme digestion.The plasmid that silenced Birc5and carried SLC was constructed by molecular cloning technology and named pgsiRNABirc5＋SLC.Results The plasmid Birc5was cleaved by EcoRⅠ，resulting in a 400bp DNA strip，indicating that Birc5－siRNA was inserted into PEGFP6－1.Plasmid pGenesil－8－SLC was cleaved by BglⅡ＋XbaⅠto form a 430bp DNA strip，which suggested that SLC was inserted into pGenesil－8.The sequences of the recombinant plasmid were proved to be completely correct.Restriction enzyme analysis showed the Birc5－siRNA plasmid carrying SLC was successfully constructed.Conclusion The Birc5－siRNA plasmid carrying SLC was successfully constructed，which provides a tool and basis for further study of tumor targeted therapy aimed at SLC and Birc5.

secondary lymphoid－tissue chemokine； Birc5； siRNA； tumor

Q872

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.014

＊湖北省教育廳科學研究計劃重點項目（No.D20131103）

舒 榕，女，1977年生，醫(yī)學碩士，副主任醫(yī)師，E－mail:1154586369＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:251204399＠qq.com