黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝損傷中蛋白質(zhì)氧化及硝化的影響＊

高平章，陳金珍，李安娜，蘇玉梅，高夏芳，張 旻，謝曉蘭

泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建泉州 362000

黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝損傷中蛋白質(zhì)氧化及硝化的影響＊

高平章，陳金珍，李安娜，蘇玉梅，高夏芳，張 旻，謝曉蘭△

泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建泉州 362000

目的 研究黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，AAP）誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法 采用腹腔注射AAP誘發(fā)小鼠肝損傷模型，檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性和肝勻漿中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）活性；蘇木精－伊紅（HE）染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)改變；免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)肝中羰基化蛋白（DNP）及硝化蛋白（3－NT）的表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，黃芩苷組血清ALT、AST活性明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；肝勻漿SOD和GSH活性較模型組明顯升高（均P＜0.05）；光鏡下顯示黃芩苷組肝臟病理?yè)p傷有所減輕，高劑量組（100mg／kg）與聯(lián)苯雙酯組效果相同；Western blot結(jié)果顯示，隨著黃芩苷劑量的增加，小鼠肝組織中分子量分別為100、45、34kD的蛋白質(zhì)羰基化水平降低；分子量分別為60、37、25kD的3種蛋白質(zhì)硝化程度下降。 結(jié)論 黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制肝臟蛋白質(zhì)氧化和硝化有關(guān)。

黃芩苷； 對(duì)乙酰氨基酚； 肝損傷； 蛋白質(zhì)氧化； 蛋白質(zhì)硝化

對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，AAP）是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥物，在正常治療劑量下服用比較安全，但過(guò)量使用會(huì)造成人和動(dòng)物嚴(yán)重的肝損傷［1］。研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是AAP誘導(dǎo)肝損傷作用機(jī)制之一［23］。ROS和RNS可以使肝中蛋白質(zhì)等生物大分子受到損傷而喪失功能，羰基化蛋白質(zhì)含量和硝基化蛋白質(zhì)含量高低可以作為判斷肝損傷程度的生物標(biāo)志物［45］。

近年來(lái)，天然產(chǎn)物作為抗氧化劑預(yù)防AAP誘導(dǎo)肝損傷已引起國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注［68］。黃芩苷（baicalin）作為中藥黃芩的主要抗氧化活性成分［9］，對(duì)化學(xué)性肝損傷、免疫性肝損傷以及AAP等藥源性肝損傷均具有明顯的保護(hù)作用［1012］，然而其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。迄今為止，黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷中蛋白質(zhì)氧化和硝化的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。鑒于以上原因，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立AAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，觀察黃芩苷對(duì)小鼠血清和肝組織中的生化指標(biāo)、肝臟組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)、肝組織中蛋白質(zhì)氧化和硝化的影響，探討黃芩苷對(duì)AAP所致肝損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為防治AAP等藥源性肝損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

健康昆明種雄性小鼠，體重18～22g，動(dòng)物等級(jí)為SPF級(jí)，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXF（鄂）2008－0005。黃芩苷（南京澤朗醫(yī)藥有限公司，純度＞98%），對(duì)乙酰氨基酚、兔多克隆抗3－NT抗體（美國(guó)Sigma公司），聯(lián)苯雙酯滴丸（浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠），羧甲基纖維素鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、NC膜（美國(guó)Millipore公司），ECL發(fā)光試劑（美國(guó)Thermo公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），2，4－二硝基苯肼（DNPH）等其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器:UV752紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司），TGL－16G型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），DYCP－40C型半干式碳板轉(zhuǎn)印槽、DYY－7C型電泳儀（北京市六一儀器廠），DMIL LED型倒置熒光顯微成像系統(tǒng)（徠卡微系統(tǒng)股份有限公司），LAS－3000化學(xué)發(fā)光及影像分析儀（美國(guó)BioRad公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

依據(jù)文獻(xiàn)方法［12］，取60只小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)等分成6組:正常對(duì)照組（NC）0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；模型組（MC）0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃；聯(lián)合雙酯組聯(lián)苯雙酯滴丸100 mg／kg灌胃，黃芩苷高、中、低劑量組分別以100、50、25mg／kg黃芩苷灌胃。每天給藥1次，連續(xù)10 d。末次給藥后禁食24h，可自由飲水。除正常對(duì)照組外，其余5組均腹腔注射400mg／kg對(duì)乙酰氨基酚制作藥源性肝損傷模型。8h后，眼靜脈取血后斷頸處死，并迅速取肝組織凍于－80℃冰箱保存，待測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 生化指標(biāo)測(cè)定

眼靜脈取血后，離心制備血清。小鼠處死后取出肝臟，用肝臟右葉制備10%肝勻漿。血清ALT、AST活性及肝臟中SOD和GSH活性按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定。

1.4 組織病理學(xué)觀察

切取小鼠肝臟左葉，用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)氧化

取各組小鼠的肝勻漿50μL，加入150μL 10 mmol／L DNPH，混勻，室溫?fù)u床上反應(yīng)30min，再加入200μL中和液（2mol／L三羥甲基氨基甲烷，30%丙三醇），混勻后，取100μL反應(yīng)后的樣品液，加25μL 5倍上樣緩沖液，在冰浴上反應(yīng)15min。各組取含10μg蛋白的樣品經(jīng)10%SDS－PAGE分離，采用半干法轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。用PBS－T洗膜后，兔多克隆DNP一抗（1∶4 000）4℃孵育過(guò)夜。用PBS－T洗膜后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，再用PBS－T洗膜后ECL法顯色。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)硝化

各組取含50μg蛋白肝勻漿進(jìn)行10%SDSPAGE分離，半干法轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，兔多克隆3－硝基酪氨酸一抗（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜。用PBS－T洗膜后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶4 000）室溫孵育1h，再用PBS－T洗膜后，ECL法顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性的影響

由表1可知，APP模型組與正常對(duì)照組比較，血清中ALT、AST均明顯增高（均P＜0.05），說(shuō)明小鼠肝損傷造模成功。與模型組比較，聯(lián)合雙酯組與黃芩苷各劑量組的ALT、AST均下降（P＜0.05或P＜0.01）。與聯(lián)合雙酯組比較，黃芩苷高劑量組的ALT有一定程度下降，但AST水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明黃芩苷對(duì)血清ALT、AST的影響與聯(lián)苯雙酯作用效果相當(dāng)。

表1 黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中ALT和AST的影響，n＝6）Table1 Effects of baicalin on the activities of serum ALT and AST in APP－induced liver injury in mice（，n＝6）

表1 黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清中ALT和AST的影響，n＝6）Table1 Effects of baicalin on the activities of serum ALT and AST in APP－induced liver injury in mice（，n＝6）

在造模時(shí)，模型組死亡4只小鼠，回收6個(gè)樣本，故取n＝6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（后同）。與正常對(duì)照組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

?

2.2 黃芩苷對(duì)小鼠肝組織中SOD、GSH含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝勻漿中SOD活性和GSH水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），這說(shuō)明對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷與氧化損傷有關(guān)。聯(lián)苯雙酯和黃芩苷明顯升高小鼠肝勻漿中GSH水平和SOD活性（P＜0.05），表明黃芩苷具有減少肝臟氧化損傷作用（表2）。

表2 黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中SOD和GSH的影響（，n＝6）Table2 Effects of baicalin on SOD and GSH in APP－induced liver injury in mice，n＝6）

表2 黃芩苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中SOD和GSH的影響（，n＝6）Table2 Effects of baicalin on SOD and GSH in APP－induced liver injury in mice，n＝6）

與正常對(duì)照組比較，＃P＜0.05＃＃P＜0.01；與模型組比較，＊P＜0.05

?

2.3 黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

光鏡下可見正常對(duì)照組小鼠肝臟無(wú)明顯病理改變，肝細(xì)胞排列尚整齊，細(xì)胞分界清晰，核圓，位于細(xì)胞中間，胞質(zhì)豐富，呈嗜堿性（圖1A）。模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞腫脹明顯，呈點(diǎn)、片狀壞死，胞質(zhì)可見脂肪空泡，小葉中央靜脈周圍和匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）。聯(lián)苯雙酯組，中央靜脈周圍和匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，大部分細(xì)胞分界清晰，部分可見脂肪空泡（圖1C）。隨著黃芩苷劑量的增大，肝細(xì)胞腫脹程度減弱，點(diǎn)、片狀壞死減少，胞質(zhì)可見脂肪空泡減少，細(xì)胞分界清晰度增強(qiáng)。尤其黃芩苷高劑量組（100mg／kg）對(duì)肝損傷抑制程度與聯(lián)苯雙酯的作用效果相當(dāng)（圖1D～F）。

圖1 黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響（蘇木精－伊紅染色，×200）Fig.1 Effects of baicalin on hepatic histopathological changes in AAP－induced liver injury in mice（HE staining，×200）

2.4 黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟組織中蛋白質(zhì)氧化的影響

ROS能通過(guò)各種氧化機(jī)制將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成羰基衍生物，后者是反映蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感指標(biāo)之一。因而通過(guò)測(cè)定羰基含量可判斷蛋白質(zhì)是否被氧化損傷及其損傷程度。羰基含量的測(cè)定可以通過(guò)其與DNPH反應(yīng)生成苯腙化合物（DNP），然后采用抗DNP抗體檢測(cè)。在上樣蛋白一致的情況下，與模型組比較，聯(lián)苯雙酯可以明顯抑制肝損傷中蛋白氧化。而黃芩苷隨著劑量的增大，AAP肝損傷中3種蛋白（分子量約為100、45、34kD）羰基含量也明顯減少，但黃芩苷高劑量組抑制效果略差于聯(lián)苯雙酯組（圖2）。因此，有必要進(jìn)一步加大黃芩苷劑量，來(lái)觀察其對(duì)蛋白質(zhì)氧化的影響。

圖2 黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟組織中蛋白氧化的影響Fig.2 Effects of baicalin on protein oxidation in AAP－induced liver injury in mice

2.5 黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟組織中蛋白質(zhì)硝化的影響

蛋白質(zhì)硝化是指蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基被RNS硝化形成3－硝基酪氨酸（3－nitrotyrosine，3－NT），也是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物之一。黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷肝臟組織中蛋白質(zhì)硝化的影響如圖3所示。模型組中主要有3種蛋白質(zhì)（分子量約為60、37、25kD）發(fā)生硝基化，聯(lián)苯雙酯組抑制效果明顯。由圖3A可見，黃芩苷中劑量組（50mg／kg），蛋白質(zhì)硝化出現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，但是從圖3B考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示該組上樣蛋白也偏高。因此，從總體趨勢(shì)上看，黃芩苷隨著劑量的增大，AAP肝損傷中蛋白硝化受到明顯的抑制。

圖3 黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中蛋白硝化的影響Fig.3 Effects of baicalin on protein nitration in AAP－induced liver injury in mice

3 討論

目前認(rèn)為AAP肝損傷機(jī)制是在長(zhǎng)期或過(guò)量服用后，其代謝產(chǎn)物N－乙酰－對(duì)苯醌亞氨（NAPQI）耗竭完肝細(xì)胞中的GSH后，繼而與線粒體和脂質(zhì)膜中蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，破壞線粒體功能而產(chǎn)生超氧陰離子（）、過(guò)氧化氫（H2O2）等ROS。此外，在AAP中毒時(shí)，肝組織中誘導(dǎo)型NO合酶（iNOS）活性增強(qiáng)［13］，一氧化氮（NO）的合成增加［14］。脂溶性的NO進(jìn)入到線粒體內(nèi)與反應(yīng)生成氧化性更強(qiáng)的過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO－），這種活性氮氧化合物進(jìn)而引起脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化和硝基化，加速破壞線粒體功能，最終引起肝細(xì)胞壞死［2，5，15］。由此可見，氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化介導(dǎo)的線粒體生物大分子氧化損傷在AAP肝損傷的發(fā)生和（或）發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。

自從中藥五味子中成功開發(fā)保肝藥聯(lián)苯雙酯后，在天然產(chǎn)物有效成分中篩選護(hù)肝藥物已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)［1617］。黃芩作為我國(guó)中醫(yī)臨床常用大宗藥材品種之一，其有效成分黃芩苷具有較強(qiáng)的保肝作用。已有報(bào)道［12，18］，黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷具有一定防治作用，能顯著增加肝組織中SOD活性及GSH水平，降低肝中丙二醛（MDA）水平，抑制細(xì)胞色素P4502E1酶活性，進(jìn)一步提高組織的抗氧化能力。這可能與黃芩苷保護(hù)和穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，降低肝細(xì)胞膜通透性，減少肝內(nèi)GSH消耗，減少自由基的損害、抑制肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷能明顯降低AAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清ALT、AST活性，減輕小鼠肝損傷組織病理改變，升高肝組織中抗氧化酶SOD和GSH活性，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的逐漸增大，黃芩苷可以抑制肝臟中3種蛋白質(zhì)（分子量約為100、45、34kD）發(fā)生氧化，但是具體發(fā)生氧化的蛋白質(zhì)種類以及氧化修飾后蛋白質(zhì)功能的改變還有待利用生物質(zhì)譜和生物信息學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

蛋白質(zhì)硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后的選擇性修飾。已證實(shí)，AAP誘導(dǎo)肝損傷與肝中的蛋白質(zhì)硝化后失活密切相關(guān)［1920］。黃芩苷可以抑制體外hemin催化亞硝酸鹽和過(guò)氧化氫介導(dǎo)的肝損傷中、鐵超載肝損傷中以及酒精性肝損傷中的蛋白質(zhì)硝化［2123］。但是，黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)肝損傷中蛋白質(zhì)硝化的影響也未見有文獻(xiàn)報(bào)道。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予灌胃100mg／kg高劑量黃芩苷組，小鼠肝臟中分子量為25、37、60kD大小的3種蛋白質(zhì)硝化受到顯著抑制。Abdelmegeeda等［24］研究證實(shí)，AAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷中P450 2E1酶活性升高，導(dǎo)致分子量為25kD的SOD1發(fā)生硝化而失活。此外，Agarwal課題組的研究也發(fā)現(xiàn)，在AAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷中也是25、37、60kD 3種蛋白質(zhì)發(fā)生硝基化，其中25kD的是錳超氧化物歧化酶（MnSOD）［20，25］。由此我們可以推測(cè)，抑制SOD硝化，提高肝組織的抗氧化能力是黃芩苷護(hù)肝作用的機(jī)制之一。

綜上所述，黃芩苷對(duì)AAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與清除ROS和RNS、抑制氧化應(yīng)激、降低肝中蛋白質(zhì)氧化和抑制蛋白質(zhì)硝化有關(guān)。

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（2014－07－16 收稿）

Effects of Baicalin on Protein Oxidation and Nitration in Acetaminophen－induced Liver Injury in Mice

Gao Pingzhang，Chen Jinzhen，Li Anna et al
College of Chemistry and Life Science，Quanzhou Normal University，Quanzhou 362000，China

Objective To investigate the protective effect of baicalin on acetaminophen－induced liver injury of mice and the possible mechanisms.Methods Mouse models of liver injury were obtained by intraperitoneal injection with acetaminophen.Activities of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）in the serum and the levels of glutathione（GSH）and superoxide dismutase（SOD）in liver homogenates were assayed with related reagent kits.Histopathological changes were observed by using hematoxylin and eosin（HE）staining.Protein carbonyl levels and protein nitration levels in the liver tissues were detected by Western blot.Results The activities of ALT and AST in baicalin treatment group were markedly lower than those in model group（P＜0.05and P＜0.01，respectively）.Treatment with baicalin significantly increased SOD and GSH activities in liver homogenates compared with model group（P＜0.05）.Light microscopy showed that the pathological changes of the liver were alleviated in baicalin treatment group and the effect of high－dose（100mg／kg）baicalin was similar to that of bifendate.Western blot results showed that baicalin had a good inhibitory effect on protein oxidation and nitration in acetaminophen－induced liver injury.With the dose of baicalin increasing，the protein carbonyl levels of three protein（100，45and 34kD，respectively）and protein nitration levels of three protein（60，37and 25kD，respectively）were decreased.Conclusion Baicalin has protective effects on acetaminophen－induced liver injury.The mechanism may be partially due to the inhibition of protein oxidation and nitration in the liver.

baicalin； acetaminophen； liver injury； protein oxidation； protein nitration

R657.3

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.012

＊國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30670481；31302190）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.201410399008）；福建省教育廳科技項(xiàng)目（No.JA13266）；泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011Z24）

高平章，男，1980年生，醫(yī)學(xué)博士，講師，E－mail:gaopingzhang＠126.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:xxl＿qztc＠sohu.com