兒童Gitelman 綜合征的SLC12A3 基因復(fù)雜雜合突變

高春林，馬上茹，夏正坤，高遠(yuǎn)賦，樊忠民，徐 敏，魏 偉，周 昱，莫桂玲

0 引 言

兒童Gitelman 綜合征(gitelman syndrome，GS)是由定位于16 號染色體長臂(16q13)編碼腎遠(yuǎn)曲小管鈉-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(Na-Cl cotransporter，NCCT)的SLC12A3 基因突變所致的綜合征，屬常染色體隱性遺傳性疾病。其臨床表現(xiàn)為低血鉀、低血鎂、堿中毒及繼發(fā)性高腎素高醛固酮血癥，患兒可出現(xiàn)乏力、便秘、頭暈、肌肉痛、生長延遲等低血鉀癥狀［1］，腎活檢可表現(xiàn)為腎小球球旁器增生或正常。因低血鉀的持續(xù)存在，在合并嘔吐、腹瀉等突發(fā)情況時，可致Q-T 間期延長，嚴(yán)重時可出現(xiàn)心律失常、橫紋肌溶解、暈厥、猝死等危險情況，具有潛在的危險性。目前發(fā)病率為1/40 000［2］，據(jù)來自印度的資料，該病居致兒童死亡病因的第4 位［3－4］，是少見但可能嚴(yán)重威脅兒童健康的疾病之一。本文對2 例兒童GS 進行了研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 全面收集2013 年1 月至2014 年5月在南京軍區(qū)總醫(yī)院兒科住院的2 例低血鉀患兒臨床資料。其中男性1 例，13 歲;女性1 例，8 歲;均為漢族，生長發(fā)育均在正常范圍，無特異癥狀。男性患兒因需行扁桃體切除術(shù)，術(shù)前常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)低血鉀(2.8 mmol/L);女性患兒因患支氣管肺炎門診檢查時發(fā)現(xiàn)低血鉀(2.4 mmol/L)。為明確診斷對患兒行DNA 測定，本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，經(jīng)患兒家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 DNA 測序(一代測序法)

1.2.1 提取基因組DNA 抽取受檢者的外周血3 mL，采 用 QIAamp 外 周 血 DNA 提 取 試 劑 盒(QIAamp，德國)，按其操作說明書提取基因組DNA。

1.2.2 獲取SLC12A3基因序列 從美國國家生物技術(shù)信息中心(the national center for biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫獲取人類SLC12A3 基因DNA 序列(網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=SLC12A3)。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，

PCR) 利用Primer Premier 5 軟件(網(wǎng)址http://www.bbioo.com/download/58-166-1.html)自行設(shè)計能夠擴增SLC12A 基因外顯子編碼區(qū)及剪切位點的引物，并由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

PCR 條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;65 ℃退火1 min;72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，25 ℃保存。PCR 產(chǎn)物測序:采用Big Dye Terminatorv3.1 循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems，美國)，按其操作說明書進行測序。

1.2.4 測序結(jié)果分析 測序結(jié)果用Mutation Surveyor V4.0.5(demo)軟件(美國Softgenetics 公司)分析，所得序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=SLC12A3)中的SLC12A3 基因序列NG_009386.1 進行比對。堿基變異參考人類基因組變異研究學(xué)會(human genome variation society，HGVS)制定的序列變異命名(www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/)的命名法則，以GenBank cDNA 序列NM_000339.2 的翻譯起始密碼子ATG 中的A 為+1 位核苷酸進行命名。

1.2.5 多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)檢測 MLPA 檢測試劑盒“SALSA MLPA P136 Gitelman syndrome probemix”購自荷蘭MRC-Holland，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 MLPA 檢測結(jié)果分析 使用Coffalyser v9.4軟件進行結(jié)果分析，評定標(biāo)準(zhǔn)為缺失外顯子的信號全部消失，Ratio 為0;重復(fù)區(qū)表現(xiàn)出信號成倍增加，Ratio 約為2.00;雜合缺失相應(yīng)的外顯子缺失信號將降低35%～55%，Ratio 為0.45 ～0.65;而雜合重復(fù)突變時相應(yīng)的信號將升高30%～55%，Ratio 為1.30 ～1.55。

表1 SLC12A3 基因各外顯子的引物序列Table 1 The Primer of SLC12A3 used in the study

2 結(jié) 果

2.1 男性患兒的SLC12A3 基因檢測結(jié)果 應(yīng)用一代測序方法檢測到SLC12A3 基因的1 個雜合突變:c.1964G ＞A，p.(Arg655His);1964 位堿基G 突變?yōu)锳，同時檢測到多個并不致病的多態(tài)性位點(rs10927887，純合;rs200268763，純合等)，應(yīng)用MLPA方法檢測到SLC12A3 基因8 號外顯子的雜合缺失突變。SLC12A3 基因突變引起的GS 通常以常染色體隱性的方式遺傳;從基因檢測結(jié)果看來，受檢者攜帶2 個雜合致病突變，符合BS/GS 患者的基因特征。經(jīng)分析，c.1964G ＞A，p.(Arg655His)位點為已知突變，而8 號外顯子缺失突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變，同時具有兩者突變可致發(fā)病。見圖1。

圖1 男性患兒的SLC12A3 基因測序及SLC12A3 基因MLPA 結(jié)果Figure 1 SLC12A3 sequenced and MLPA results of the boy

2.2 女性患兒的SLC12A3 基因檢測結(jié)果 應(yīng)用一代測序方法檢測到SLC12A3 基因的2 個雜合突變:c.2543A ＞T，p.(Asp848Val)和c.976delG，p.(Val326fs)突變;2543 位堿基G 突變?yōu)锳，導(dǎo)致848 位門冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸，976 位堿基G 缺失，使氨基酸326 位纈氨酸后發(fā)生移碼突變。其中c.2543A ＞T 突變未見文獻報道，應(yīng)用MLPA 方法未檢測到SLC12A3 基因外顯子的缺失突變。SLC12A3 基因突變引起的GS 通常以常染色體隱性的方式遺傳;從基因檢測結(jié)果看來，受檢者攜帶2 個雜合致病突變，符合BS/GS 患者的基因特征。見圖2。

圖2 女性患兒的SLC12A3 基因測序及SLC12A3 基因MLPA 結(jié)果Figure 2 SLC12A3 sequenced and MLPA results of the girl

3 討 論

自1966 年Gitelman 首次報道3 例22 ～47 歲的女性患者并以GS 命名以來［5］，世界各地每年均有數(shù)量不等的病例被診斷，盡管如此，兒童GS 的報道仍少見，兒科醫(yī)師對此病認(rèn)識不足，因而容易出現(xiàn)漏診和誤診。

3.1 GS 與SLC12A3 基因突變 已知SLC12A3 基因定位于16q13，共含有26 個外顯子，1030 個氨基酸，其二級結(jié)構(gòu)包括跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)氨基端和羧基端、細(xì)胞外疏水的環(huán)狀區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)即為負(fù)責(zé)鈉-氯共轉(zhuǎn)運的載體蛋白NCCT，定位于遠(yuǎn)曲小管，該基因的異常突變即可致病。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)超過250 種該基因的突變，某些突變可能導(dǎo)致NCCT 結(jié)構(gòu)和/或功能異常［6］。Balavoine 等［7］分析了15 例GS 患者，其中9 例為純合子突變，6 例為復(fù)合雜合子突變，并且突變位點個數(shù)表現(xiàn)嚴(yán)重度呈正相關(guān)。但相關(guān)兒童GS 的報道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)2 例患者為復(fù)合雜合突變，其中c.1964G ＞A，p.(Arg655His)和c.2543A ＞T，p.(Asp848Val)突變位點均位于NCCT的細(xì)胞內(nèi)羧基端，使其從尿液重吸收鈉氯的功能受損，976 位堿基G 缺失，使氨基酸序列326 位纈氨酸后發(fā)生移碼突變，蛋白質(zhì)翻譯異常，此為已知突變，可使NCCT 蛋白結(jié)構(gòu)異常。此外發(fā)現(xiàn)8 號外顯子的缺失突變可能導(dǎo)致NCCT 異常，目前尚無法預(yù)測，但該外顯子應(yīng)具有不可或缺的功能，其缺失或誤義突變可能使得蛋白質(zhì)翻譯過程發(fā)生移碼或提前終止從而喪失相應(yīng)的功能。

3.2 基因檢測是確診的手段 本研究對2 例患兒進行了基因檢測發(fā)現(xiàn)，男性患兒存在SLC12A3 基因位點的雜合突變，c.1964G ＞A，p.(Arg655His)，該位點為已知突變;女性患兒存在2 個位點的基因突變，其中c.2543A ＞T，p.(Asp848Val)的突變尚未見報道，并通過美國國立衛(wèi)生中心的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫排除該位點變異為單核苷酸多態(tài)性。由于GS 為常染色體隱性遺傳，僅有1 個位點突變無法解釋患者發(fā)病，本研究進一步行大片段缺失或重復(fù)突變的MLPA 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)男性患兒同時表現(xiàn)SLC12A3 基因8 號外顯子的雜合缺失突變;至此，根據(jù)患兒基因測序結(jié)果，明確診斷為復(fù)雜雜合突變所致的GS。既往研究顯示:①復(fù)雜雜合突變是導(dǎo)致的GS 的重要突變模式，如Vargas-Poussou 等［8］對448例GS 進行研究發(fā)現(xiàn)，70%患者存在2 個位點突變，對具有1 個點突變的患者進行MPLA 檢測后發(fā)現(xiàn)，其中47%的患者存在單個或多個外顯子的大片段缺失或重復(fù)突變(即復(fù)雜雜合突變)，與本研究的結(jié)果一致;②SLC12A3 基因的突變包含多種模式，無義突變、誤義突變、剪切位點突變及缺失，如突變位點位于啟動子區(qū)或剪切位點異常，異常的終止密碼子等使翻譯或蛋白加工或者折疊過程異常，NCCT 蛋白的完全缺失;甚至影響其嵌入胞漿膜進而缺乏正常的功能［6，9］。③8 號外顯子的缺失突變尚未見報道，既往研究發(fā)現(xiàn)8 號外顯子存在誤義突變或移碼突變等，甚至剪接缺失，但無大片段缺失的報道。因此MPLA 結(jié)合一代基因測序技術(shù)使得GS 的診斷更為精確和直接，并可與BS 相鑒別。本研究通過一代測序技術(shù)聯(lián)合MPLA 檢測，便于臨床及時發(fā)現(xiàn)少見的突變，為診斷疾病提供有力的工具，有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)師制定合理有效的治療方案;2 例患兒確診后給予積極補鉀補鎂治療，并定期復(fù)查，維持血鉀在正常范圍。

3.3 GS 與BS 的鑒別診斷 典型的GS 表現(xiàn)除低血鉀、代謝性堿中毒、RAS 激活、血壓正常或偏低外，低尿鈣、低血鎂為其特點。因SLC12A3 基因異常導(dǎo)致NCCT 無法正確的轉(zhuǎn)運鈉，髓袢升支粗段和集合管則通過Na+/K+、H+/K+和Na+/H+代償吸收鈉，泌H+、泌K+增加，使得GS 患者只表現(xiàn)輕微的失鹽，但低血鉀明顯，低血鎂的機制目前認(rèn)為是由于遠(yuǎn)曲小管鈉依賴的鎂離子重吸收降低導(dǎo)致［10］;髓袢升支粗段代償吸收鈉增加使得正電荷電位明顯增加，進而促進繼發(fā)性的鈣重吸收，低尿鈣出現(xiàn)，這也是與BS 相區(qū)別的重要特點。在臨床實踐中應(yīng)注重系統(tǒng)的血液及尿液檢查，以利排除診斷或確診。但也有研究發(fā)現(xiàn)，低鎂血癥不是診斷GS 的必要條件，部分患者血鎂可正常，但低鎂似與癥狀輕重相關(guān)［11］。

BS 典型的腎病理表現(xiàn)為腎小球球旁細(xì)胞器肥大，男性患兒未看到腎小球球旁復(fù)合體;女性患兒可看到個別球旁器肥大，電鏡下足細(xì)胞無特殊改變?？梢奊S 也可表現(xiàn)為球旁細(xì)胞器肥大，提示該表現(xiàn)不具有鑒別GS 與BS 的特殊診斷價值。因而在具備基因診斷條件的情況下可酌情暫緩腎活檢術(shù)。

綜上所述，兒童GS 的臨床表現(xiàn)及遺傳學(xué)表現(xiàn)差異較大，需要兒科醫(yī)師提高認(rèn)識，掌握典型的臨床表現(xiàn)，并積極進行基因診斷和遺傳咨詢。

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