胃泌素釋放肽前體雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法的建立及其應(yīng)用

楚振宇，周小林，薛振偉，崔梅萍，藺蘇琴，李瑞華

0 引 言

小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)惡性程度在所有肺癌類型中最高［1］，然而其對(duì)放化療敏感，如早期發(fā)現(xiàn)，采用綜合治療后5年生存率可達(dá)30%以上，因此SCLC的早期診斷和治療尤為重要。胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin releasing peptide，PGRP)作為神經(jīng)內(nèi)分泌性細(xì)胞來(lái)源的腫瘤如小細(xì)胞肺癌腫瘤標(biāo)志物已得到廣泛認(rèn)可［2－4］，其敏感性和特異性均高于血清神經(jīng)元特異烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)［5］，特別是對(duì)于局限期 SCLC的診斷具明顯優(yōu)勢(shì)［6－7］。在病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)估、預(yù)后等方面亦有較高準(zhǔn)確性［8－9］，在臨床上有廣泛的應(yīng)用前景［10－11］。本研究通過(guò)人工合成 PGRP抗原決定簇對(duì)本實(shí)驗(yàn)室自行研制的單克隆抗體進(jìn)行篩選;采用改良過(guò)碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記，從而建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)，并將此方法應(yīng)用于癌癥患者PGRP濃度的檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 PGRP抗原(本實(shí)驗(yàn)室自行研制);抗原決定簇PGRP(31－98)序列中N端到C端的3個(gè)抗原肽段—GSLKQQLREYIR(肽段1)、NLLGLIEAK(肽段2)和KENRNHQPPQ PKALG(肽段3)，委托賽百盛公司合成;單克隆抗體19株(本實(shí)驗(yàn)室采用雜交瘤技術(shù)自行研制的鼠單克隆抗體);多克隆抗體(本實(shí)驗(yàn)室自行研制的兔多克隆抗體);辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(H+L)與辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(ZSGB-BIO公司生產(chǎn));HRP為AMRESCO公司生產(chǎn);癌癥患者血樣共67份(由太原腫瘤醫(yī)院提供)，血樣以離心半徑6 cm、3000r/min離心15min后收集上層血清;BioTek酶標(biāo)儀(型號(hào)ELx800);Thermo Scientific微量分光光度計(jì)(型號(hào)NANODROP 2000);ELISA試劑盒(PGRP檢測(cè)試劑盒為IBL公司生產(chǎn));本實(shí)驗(yàn)所選用化學(xué)試劑規(guī)格皆為分析純。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA法篩選單克隆抗體 以3條肽段與全肽段PGRP(31－98)作為抗原，分別溶于0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽包被液中，包被聚苯乙烯板孔，包被濃度為 150 ng/100 μL，每孔包被 100 μL，4 ℃冰箱培育24 h;用含有0.05%吐溫－20的等滲鹽水的洗液洗板4次后對(duì)包被后的板條進(jìn)行封閉，封閉液使用含有1%BSA的PBS溶液(0.01 mol/L pH7.4)150 μL，4℃冰箱培育24 h;移除封閉液后自然晾干板條;在封閉后的板孔中分別加19種不同細(xì)胞株的單克隆抗體，2 孔/株，50 μL/孔，37 ℃恒溫箱培育 45 min;移除單克隆抗體，洗液洗板4次后，加HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體50μL/孔，37℃恒溫箱培育30min;移除二抗并重復(fù)洗板4次，每孔各添加底物A、B液50 μL，37℃恒溫箱培育15 min;4 mol/L濃硫酸終止反應(yīng)后顯色，酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A值)，記錄讀數(shù);重復(fù)4次，計(jì)算算術(shù)平均值。

1.2.2 單克隆抗體HRP標(biāo)記 采用改良過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記HRP(1mg)至所需單克隆抗體(2mg)，低pH條件下NaIO4氧化HRP表面糖分子成醛基，與Ig的氨基相結(jié)合形成斯夫氏堿，后利用NaBH4還原結(jié)合物形成穩(wěn)定的酶標(biāo)抗體。使用微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)標(biāo)記后單克隆抗體A403、A280，重復(fù)檢測(cè)3次，記錄結(jié)果并計(jì)算標(biāo)記后HRP量、IgG量及標(biāo)記率，單位為mg/mL。公式如下:

HRP 酶量 =A403×0.4

IgG 量 =(A280－A403×0.3)×0.62

1.2.3 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)PGRP 包被抗體:選用E12株單克隆抗體包被聚苯乙烯板條，包被及封閉條件同ELISA篩選單克隆抗體實(shí)驗(yàn);抗原:選用本實(shí)驗(yàn)室自行研制PGRP抗原，配制成不同梯度濃度，抗原稀釋液使用 0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液。酶標(biāo)抗體選用兔抗鼠多克隆抗體作為一抗，HRP酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體作為二抗，HRP標(biāo)記DD2、ED1鼠源單克隆抗體。利用方陣滴定法得到包被抗體與標(biāo)記抗體的配比濃度A值，繪制工作濃度曲線，取斜率最大并且讀數(shù)接近1.0處的抗體濃度作為各株抗體最適工作濃度。實(shí)驗(yàn)步驟:首先在包被E12株單克隆抗體的板條中加不同濃度的PGRP抗原，使得每列板孔中抗原濃度相同并呈梯度降低，抗原抗體穩(wěn)定結(jié)合后使用酶標(biāo)記抗體檢測(cè)并顯色、記錄讀數(shù)，具體實(shí)驗(yàn)條件控制同間接法篩選單克隆抗體實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，計(jì)算算術(shù)平均值。

1.2.4 血清檢測(cè) 以E12為包被單克隆抗體、ED1作為標(biāo)記抗體，以本實(shí)驗(yàn)室自制抗原作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，同時(shí)對(duì)67份癌癥患者血清進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 單克隆抗體篩選結(jié)果 E12單克隆抗體只與肽段3結(jié)合，明顯高于全序列肽段;FB4單克隆抗體與3條肽段都可以結(jié)合，但與肽段2的結(jié)合力高于其他肽段;ED1單克隆抗體只與肽段2結(jié)合，但結(jié)合力明顯低于全序列肽段。

2*B3、ED2、EC6 3株單克隆抗體分別與3條肽段均可結(jié)合，結(jié)合力相近;DD2及其他12株單克隆抗體僅與全肽段結(jié)合，而不與所選的3條肽段結(jié)合。見(jiàn)表1。

2.2 夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果 E12單克隆抗體包被與3種不同酶標(biāo)抗體檢測(cè)PGRP抗原濃度曲線中ED1斜率最高，結(jié)合效果最好，兔多克隆抗體斜率最低。見(jiàn)表2，圖1。

表1 人工合成3條肽段與全序列肽段篩選單克隆抗體ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 ELISA experiment results of screening monoclonal antibodies with three peptides and complete sequence peptide

表2 E12單克隆抗體與不同酶標(biāo)抗體夾心檢測(cè)PGRP抗原濃度結(jié)果Table 2 Results of PGRP antibody density by sandwich detection of E12 mAb and different enzyme-labeled antibodies

圖1 E12單克隆抗體包被與不同酶標(biāo)抗體夾心檢測(cè)抗原濃度曲線圖Figure 1 Curve chart of PGRP antibody density by sandwich detection of d E12 mAb coating and different enzyme-labeled antibodies

2.3 癌癥患者血清檢測(cè)結(jié)果 本方法的檢測(cè)范圍為33～1.7×104pg/mL;IBL公司試劑盒檢測(cè)檢測(cè)范圍為16～800 pg/mL。在靈敏度方面，抗原濃度在33～200 pg/mL范圍內(nèi)時(shí)，IBL試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率最高，而本方法的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線趨于平滑，曲線斜率近似一致，并未明顯增高或降低?？乖瓭舛仍?0～800 pg/mL范圍內(nèi)時(shí)，IBL試劑盒檢測(cè)A值均高于本方法，此范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率高于本方法。見(jiàn)圖2。利用E12單克隆抗體包被，酶標(biāo)ED1單克隆抗體建立的雙單克隆抗體夾心ELISA檢測(cè)癌癥患者血清PGRP濃度，界定濃度值設(shè)為46pg/mL，陽(yáng)性有4例，陰性值63例;使用市售PGRP試劑盒對(duì)同一批次癌癥患者血清檢測(cè)，其中陽(yáng)性8例，陰性59例。本方法和IBL試劑盒檢測(cè)靈敏度均為100%，特異度分別為98.4%和92.2%。

圖2 不同方法檢測(cè)癌癥患者血清標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度曲線Figure 2 Curve chart of standard antibody density in patients'serum by different detection methods

3 討 論

PGRP抗原在人體內(nèi)有3種同型異構(gòu)體，其抗原表面有多個(gè)抗原決定簇，每個(gè)抗原決定簇由幾個(gè)到十幾個(gè)氨基酸或碳水基團(tuán)組成，每一株單克隆抗體僅結(jié)合其中一個(gè)抗原決定簇。由于抗原決定簇的性質(zhì)大部分由蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定，因此人工合成抗原共有序列肽段的部分氨基酸序列可得到PGRP抗原決定簇，借此篩選出結(jié)合不同位點(diǎn)的單克隆抗體，應(yīng)用此方法建立單克隆抗體夾心ELISA實(shí)驗(yàn)。

我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FB4株單克隆抗體與肽段1和肽段3均可以結(jié)合，說(shuō)明其不是真正意義的單克隆抗體，考慮下一步工作復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行克隆化處理;E12株單克隆抗體僅與肽段3結(jié)合，ED1株單克隆抗體僅與肽段2結(jié)合，確立這2株單克隆抗體作為一組體系并進(jìn)行ELISA方法的建立;DD2及其他12株單克隆抗體與合成的3條肽段都不存在結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明其結(jié)合的抗原位點(diǎn)在全肽段其他序列中，所以選取DD2株單克隆抗體搭配E12作為另一組體系進(jìn)行研究;以E12株單克隆抗體作為包被抗體，分別與DD2、ED1株辣根酶標(biāo)記的單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)PGRP抗原。為了與雙單克隆抗體體系比較，利用兔多克隆抗體作為一抗、酶標(biāo)羊抗兔IgG作為二抗搭配E12株單克隆抗體，建立單克隆抗體、多克隆抗體雙抗體夾心ELISA共同檢測(cè)抗原。

在利用3種夾心抗體檢測(cè)自制PGRP標(biāo)準(zhǔn)抗原實(shí)驗(yàn)中，3條標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線線性關(guān)系良好;在半對(duì)數(shù)曲線斜率方面，E12株單克隆抗體曲線斜率最高，多克隆抗體組斜率最低;多克隆抗體組陰性對(duì)照值較高，考慮是因?yàn)槎嗫寺】贵w相對(duì)分子質(zhì)量大、空間結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜、與抗原結(jié)合的基團(tuán)較多等因素有關(guān);利用方陣法確定的抗體工作濃度，ED1株單克隆抗體效價(jià)最高。

本方法的檢出限要高于商品化試劑盒，雖然對(duì)陽(yáng)性檢出結(jié)果無(wú)明顯影響，但是在低濃度水平范圍的檢測(cè)還不能達(dá)到理想水平;另外，從2種方法的標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度曲線可以看出，在抗原濃度在低濃度水平范圍內(nèi)時(shí)(＜100 pg/mL)，試劑盒的曲線斜率要高于本方法的斜率，也就是說(shuō)，在此范圍內(nèi)本方法對(duì)于單位抗原濃度變化較試劑盒來(lái)說(shuō)不夠靈敏。

我們的實(shí)驗(yàn)避免2種單克隆抗體交叉同一抗原決定簇而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，對(duì)作為一抗的單克隆抗體利用改良過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，建立雙抗體夾心ELISA，并應(yīng)用于患者血清樣品的檢測(cè)。此方法優(yōu)點(diǎn)如下:2種單克隆抗體特異結(jié)合同一抗原的不同位點(diǎn)可避免假陰性結(jié)果出現(xiàn);避免了2種單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同一抗原決定簇，所以酶標(biāo)抗體的酶聯(lián)信號(hào)釋放程度非常;因?yàn)槲词褂枚?，相較于成型的PGRP抗原檢測(cè)ELISA方法更為簡(jiǎn)潔有效，并可減少非特異反應(yīng)發(fā)生的概率。

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