高效液相色譜法測(cè)定益腎丸中特女貞苷的含量

崔恩忠，唐安福，劉文雅，盛 華，湯 淏，王曙東

0 引 言

益腎丸為我院全軍腎臟病研究所研制，臨床應(yīng)用多年，療效確切［1－3］。處方由黨參、白術(shù)、柴胡、熟地、當(dāng)歸、黃芪和女貞子等十二味中藥組成，具有益氣健脾之功，主要清除蛋白尿，用于臨床有蛋白尿的各種腎小球腎炎的輔助治療，尤其適用于急性腎炎恢復(fù)期。該制劑成分復(fù)雜，原標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)當(dāng)歸、黃芪和女貞子進(jìn)行薄層色譜鑒別，無藥效成分含量測(cè)定等檢查項(xiàng)目。為提高制劑質(zhì)量，更好地發(fā)揮臨床療效，本實(shí)驗(yàn)將女貞子定性鑒別改為定量分析，通過高效液相色譜法測(cè)定特女貞苷的含量。

1 材 料

Waters1525高效液相色譜儀、2487型紫外檢測(cè)器(美國Waters公司);XS105型十萬分之一電子天平(梅特勒爾-托利多公司)。

特女貞苷對(duì)照品(111926-201203)購自中國食品藥品檢定研究院;中藥飲片:黨參、白術(shù)、柴胡、熟地、當(dāng)歸、黃芪、金櫻子、白茅根、山藥、升麻、砂仁購自南京醫(yī)藥股份有限公司。益腎丸為南京軍區(qū)總醫(yī)院制劑科生產(chǎn)(規(guī)格:60克/瓶，其中每丸含生藥約0.87 g，批號(hào)為 130109、130217、130416、130618、130822、130911、140515、140528)。甲醇:色譜純(美國天地);硅膠G薄層板(青島海洋化工廠，50×100 mm);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 高效液相色譜儀Waters 1525(雙 泵)，2487紫 外 檢 測(cè) 器;色 譜 柱:Agilent TC-C18(2)柱(4.6 ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-純化水梯度洗脫，0～15 min:甲醇:25%→38%，15～30 min:甲醇:38%，第30～32 min:甲醇:38%→25%;檢測(cè)波長為224nm;柱溫:25℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10μL。

2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取特女貞苷對(duì)照品6.15 mg，置于25 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。稀釋對(duì)照品貯備液，可得 15.375 μg/mL，30.75 μg/mL，61.5 μg/mL，123.0 μg/mL，246.0 μg/mL 等一系列對(duì)照品濃度。

供試品溶液的制備:取益腎丸粉末約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液的制備:按處方比例稱取除女貞子以外的其余藥材，按本品制備工藝及供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

圖1 特女貞苷方法專屬性考察Figure1 Specificity test of specnuezhenide

2.3 方法專屬性的考察 精密吸取上述特女貞苷對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照品各10 μL，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果:供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處，有同一色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處則無峰出現(xiàn)，表明其對(duì)樣品測(cè)定無干擾。見圖1。

2.4 特女貞苷線性關(guān)系的考察 分別精密吸取特女貞苷儲(chǔ)備液2.0 mL至10.0 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，按"2.1"項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程:Y=11987X－2215.6，r=0.9999(n=5)。結(jié)果表明，特女貞苷的濃度在15.375～24.600 μg/mL 時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取"2.2"項(xiàng)下的特女貞苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，特女貞苷峰面積的RSD為0.44%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)下的樣品，按"2.2"項(xiàng)下樣品溶液的制備方法進(jìn)行測(cè)定，常溫下于0、1、2、4、8h分別進(jìn)樣，記錄特女貞苷峰面積，RSD為0.95%。2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)為130822)的樣品5份，按"2.2"項(xiàng)下樣品溶液的制備方法進(jìn)行測(cè)定，其峰面積的RSD為2.65%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品1.25 g(批號(hào)為130822)，共 9份，分別置于100 mL平底燒瓶瓶中;精密稱取特女貞苷對(duì)照品6.06 mg，置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取特女貞苷對(duì)照品儲(chǔ)備液3、5和7 mL，按"2.2"項(xiàng)下樣品制備方法即得。精密吸取上述供試液各10 μL注入色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。平均回收率為99.60%，RSD為1.59%。見表1。

2.9 樣品含量的測(cè)定 取8批益腎丸，分別粉碎后，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行含量測(cè)定。見表2。

表1 特女貞苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table1 Results of sample recovery rate test of specnuezhenide

表2 特女貞苷含量測(cè)定結(jié)果Table2 Results of specnuezhenide content test

參考8批樣品中特女貞苷的含量測(cè)定結(jié)果，確定本品特女貞苷含量≥0.3 mg/g為合格。

3 討 論

參照《中國藥典》2010版一部女貞子中特女貞苷的含量測(cè)定方法及部分參考文獻(xiàn)［3－11］，進(jìn)行選擇試用:甲醇-水(40∶60)雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰比例懸殊大;甲醇-水(36∶64)分離效果差;流動(dòng)相甲醇-水梯度洗脫1(0～15 min，甲醇:25%～37%;15～20 min，甲醇:37%～40%;20～35 min，甲醇:40%;第35～40 min，甲醇:40%～25%)，目標(biāo)峰基線不平;流動(dòng)相甲醇-水梯度洗脫2(0～15 min，甲醇:25%～38%;15～30 min，甲醇:38%;30～32 min，甲醇:38%～25%)，洗脫出峰時(shí)間，分離度等條件都較好，故選擇其為最佳流動(dòng)相。益腎丸中白茅根、女貞子為水提濃縮后入藥，為考察提取效率、保證提取物質(zhì)量的均一性，同時(shí)參考《藥典》規(guī)定，最終從8批樣品的測(cè)定結(jié)果中可以看出，特女貞苷的含量基本上穩(wěn)定在0.3～0.5 mg/g，說明提取工藝及飲片質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，可以做為制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選擇方中女貞子所含特女貞苷進(jìn)行含量測(cè)定。

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