大葉楊組培快繁體系的建立

彭言劼　李明勇　趙亞津　龐旭鳳　宋春草　熊瑞婷　杜克兵

摘 要： 以大葉楊幼嫩的帶腋芽莖段為試材，建立以腋芽誘導(dǎo)途徑為基礎(chǔ)的植株組培快繁體系。結(jié)果表明：大葉楊腋芽誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為MS+NAA0.1 mg/L+6BA0.1 mg/L，接種30 d，腋芽萌發(fā)率可達(dá)100%；最適宜增殖培養(yǎng)基為MS+NAA0.1 mg/L+6BA2.0 mg/L，培養(yǎng)30 d，增殖系數(shù)可達(dá)4.0，幼苗生長(zhǎng)健壯；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L，培養(yǎng)30 d，平均生根達(dá)4條，平均根長(zhǎng)為4.7 cm。

關(guān)鍵詞： 大葉楊；組織培養(yǎng)；腋芽誘導(dǎo)；快繁體系

中圖分類號(hào)：S722.3+7；Q813.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-3020（2015）02-0013-04

大葉楊Populus lasiocarpa 屬于楊柳科Salicacae楊屬大葉楊派Leucoides的一種植物，是楊屬植物中最古老最原始的樹種之一，為中國(guó)特有的鄉(xiāng)土樹種，原產(chǎn)于華中地區(qū)，僅在湖北、陜西、四川、貴州和云南省有野生種分布，國(guó)外無野生種群分布[1-2]。大葉楊適宜海拔600～2 800 m的山地，具有較高的生態(tài)價(jià)值，其高山地區(qū)的適生性是山地楊樹育種的優(yōu)良基因資源。但是，迄今大葉楊仍處于野生狀態(tài)，未得到有效保護(hù)與利用。因此，開展大葉楊種質(zhì)資源的保存與利用研究具有重要意義。

已有研究顯示，大葉楊扦插成活率極低，不同生根劑處理的枝插成活率均為零，根插成活率亦低于15%。嫁接成活率相對(duì)較高，但對(duì)砧木要求特殊，目前僅發(fā)現(xiàn)山地楊與其具有較高的親和性[3]。這些都對(duì)大葉楊種質(zhì)資源的保存造成一定困難。組織培養(yǎng)是快速高效繁殖、保存種質(zhì)資源的重要方法。然而，目前大葉楊尚無這方面的報(bào)道。本研究以湖北省大葉楊優(yōu)良單株為試材，開展組織培養(yǎng)研究，建立高效組培快繁體系，以期為我國(guó)大葉楊優(yōu)良種質(zhì)資源的保存和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從湖北省宜昌市樟村坪林場(chǎng)，東經(jīng)111°4′～111°13′，北緯31°11′～31°18′，平均海拔1 100 m選擇大葉楊優(yōu)良單株，截取健壯的休眠枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室水培催芽。

1.2 無菌材料的獲得

將帶腋芽的莖段置于飽和的洗衣粉溶液中浸泡10 min，取出洗凈后用流水沖洗1.5 h，并用蒸餾水潤(rùn)洗3遍，再于超凈工作臺(tái)中消毒。消毒方法為：先用70%的酒精浸泡30 s，隨后用無菌蒸餾水沖洗2遍，再用0.1%升汞溶液浸泡5 min（期間不斷晃動(dòng)），接著用無菌蒸餾水沖洗6次，所獲得的材料即為無菌的外植體。將帶腋芽的莖段切成長(zhǎng)1.5 cm左右的小段（帶1個(gè)腋芽），接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.3 腋芽誘導(dǎo)

基本培養(yǎng)基選擇楊樹組織培養(yǎng)中最常用的MS培養(yǎng)基（pH=5.8）[4]，選用6BA 4個(gè)濃度水平（0.1，0.5，1.0，2.0 mg/L）和NAA 2個(gè)濃度水平（0.1，0.5 mg/L），以及不含任何激素的MS培養(yǎng)基，共設(shè)計(jì)9種處理（表1），每處理4次重復(fù)，每重復(fù)接種4個(gè)外植體。在對(duì)黑楊派楊樹組培的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然BA與NAA的比值高有利于芽的誘導(dǎo)，但無NAA的培養(yǎng)基誘芽效果不及含有少量NAA的培養(yǎng)基[5]，故本試驗(yàn)中均不設(shè)單一激素處理。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，溫度（25±2）℃，光照時(shí)間16 h/d。接種10 d后統(tǒng)計(jì)污染率與褐化率，30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。其中，污染率（%）=污染的莖段數(shù)/接種的總莖段數(shù)×100%；褐化率（%）=褐化的莖段數(shù)/接種的總莖段數(shù)×100%；腋芽萌發(fā)率（%）=腋芽萌發(fā)的莖段數(shù)/接種的莖段數(shù)×100%。

1.4 增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)萌發(fā)的腋芽切下，接種于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。以MS作為基本培養(yǎng)基，選用6BA 3個(gè)濃度水平（0.5，1.0，2.0 mg/L）和NAA 3個(gè)濃度水平（0.05，0.1，0.25 mg/L），共9個(gè)處理（表2），采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每處理5次重復(fù)，每重復(fù)接種3～4個(gè)腋芽，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)及生長(zhǎng)情況。其中，增殖系數(shù)=30 d有效芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.5 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)后高約2.0 cm的幼苗切下，接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。采用1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，激素選用NAA 2個(gè)濃度水平（0.1，0.2 mg/L）和IBA 3個(gè)濃度水平（0.1，0.2，0.4 mg/L），共6種處理（表3），每處理3次重復(fù)，每重復(fù)接種4棵苗。30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)量及根長(zhǎng)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)采用Excel2003軟件進(jìn)行處理，用SAS9.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)大葉楊腋芽誘導(dǎo)的影響

接種10 d后，腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段污染率為3.81%，褐化率為3.47%。外植體接種后，約7 d腋芽明顯膨大，12 d后腋芽開始萌發(fā)，部分外植體基部膨大形成黃綠色愈傷組織（圖1A）。30 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，外植體腋芽萌發(fā)率最低的培養(yǎng)基為IC1，僅為31.3%。6種培養(yǎng)基（IC2～I(xiàn)C4、IC6、IC8、IC9）的腋芽誘導(dǎo)率達(dá)到了75%以上，且相互之間差異不顯著（P>0.05）。其中，IC2的腋芽萌發(fā)率最高，達(dá)到100%，且莖段生長(zhǎng)正常，葉片鮮綠（表1，圖1A）。方差分析顯示，6BA及其與NAA的交互作用對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01），而NAA的影響不顯著（P>0.05）。隨著6BA濃度的升高，萌發(fā)的腋芽莖段幾乎不伸長(zhǎng)，呈叢生狀。綜合萌發(fā)率與腋芽生長(zhǎng)性狀，選擇IC2（NAA 0.1 mg/L + 6BA 0.1 mg/L）為大葉楊腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

2.2 增殖培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)過程中，幼苗在葉柄處產(chǎn)生腋芽，同時(shí)在基部切口處分化出不定芽（圖1B），或者基部膨大形成愈傷組織，再?gòu)挠鷤M織分化不定芽（圖1C）。9種培養(yǎng)基對(duì)增殖效果的影響極顯著（P<0.01）。方差分析顯示，NAA、6BA對(duì)增殖效果的影響皆達(dá)到極顯著水平（P<0.01），兩者的的交互作用對(duì)增殖效果的影響也達(dá)到顯著水平（P<0.05）。在NAA濃度不變的情況下，隨著6BA濃度的增加，增殖系數(shù)呈上升趨勢(shì)。6BA/NAA濃度的比值在20以上的3種培養(yǎng)基（PM2，PM3，PM6）的增殖系數(shù)顯著高于其他組合（P<0.05）。兩者的比值達(dá)到40時(shí)（PM3），導(dǎo)致幼芽長(zhǎng)勢(shì)弱，節(jié)間生長(zhǎng)不明顯，芽成簇狀芽。9種培養(yǎng)基中，PM6的增殖系數(shù)最高，達(dá)到4.0，且芽苗生長(zhǎng)健壯（圖1C），故認(rèn)為PM6（NAA 0.1 mg/L + 6BA2.0 mg/L）為大葉楊的最適增殖培養(yǎng)基。

2.3 生根培養(yǎng)

培養(yǎng)7 d后，幼苗逐漸從基部生出不定根，30 d時(shí)6種培養(yǎng)基中，幼苗生根率皆為100%（表3）（圖1D）。當(dāng)IBA濃度相同時(shí)，0.1mg/L的NAA（R1，R3，R5）對(duì)生根的促進(jìn)作用顯著大于0.2 mg/L的NAA（P<0.05）。生根效果最好的是R3和R5，兩者間差異不顯著（P>0.05）。R5的生根條數(shù)最多（4.7根），平均根長(zhǎng)也最長(zhǎng)（5.27 cm）（表3），但基部膨大形成愈傷組織，煉苗時(shí)易造成根系折斷。R3的生根條數(shù)為4條，平均長(zhǎng)度為4.7 cm（表3），且根系分支發(fā)達(dá)（圖1D），幼苗生長(zhǎng)健壯。因此，選擇R3（NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L）培養(yǎng)基為大葉楊最適生根培養(yǎng)基。

3 討論

利用組織培養(yǎng)進(jìn)行種質(zhì)資源離體保存，不僅能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的無性系，而且有占據(jù)空間小，節(jié)約土地資源和降低保存成本等優(yōu)勢(shì)[6]。目前，已有許多物種利用組培進(jìn)行種質(zhì)資源離體保存的報(bào)道，例如葡萄[7]、柑桔[8]等，也有大量楊樹組織培養(yǎng)快繁的報(bào)道，如箭桿楊[6]、鉆天楊[9]、山新楊[10]等。本研究以大葉楊腋芽誘導(dǎo)途徑建立了較高效的組培快繁體系，實(shí)現(xiàn)了大葉楊利用組培方法進(jìn)行種質(zhì)資源的離體保存。

NAA已被報(bào)道普遍使用于楊樹及其他植物的組織培養(yǎng)中，對(duì)培養(yǎng)結(jié)果影響顯著，而大葉楊腋芽誘導(dǎo)的方差分析結(jié)果表明，NAA對(duì)誘芽效果的影響不顯著（p>0.05），試分析原因可能是本研究中NAA濃度取值范圍太小，NAA的誘芽效果在此范圍內(nèi)差異不顯著，亦可能是大葉楊對(duì)NAA不敏感。后者與全永壽等[3]用不同生根劑處理大葉楊枝條進(jìn)行扦插無成活的情況相符。

除了激素的種類和濃度對(duì)植物產(chǎn)生的影響外，激素間的不同配比對(duì)組培效果的影響也很重要。于志水等[5]在黑楊派楊樹的組培體系研究中發(fā)現(xiàn)，6BA和NAA的比值對(duì)芽誘導(dǎo)具有調(diào)控作用，比值越大越有利于芽誘導(dǎo)。本研究增殖培養(yǎng)中觀察到的相似的情況。高比值（20以上）的組合對(duì)芽的誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用，在比值相同，激素濃度不同時(shí)也有相似的效果（PM2與PM6）（表2）。但是，過高濃度的6BA（PM3）會(huì)造成芽苗長(zhǎng)勢(shì)弱，基部葉片大，節(jié)間生長(zhǎng)不明顯，形成簇狀芽。這種叢生芽不僅在繼代操作中不易切割開，而且在后來的培養(yǎng)中易畸形或玻璃化[11，12]。

生根是組織培養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，生根是否成功可以決定能否得到一棵完整的植株。而大葉楊扦插繁殖幾乎不能成活，原因可能是不易生根。本研究采用了兩個(gè)促進(jìn)生根的措施解決了這個(gè)問題，一是使用無機(jī)元素減半的1/2MS作為基本培養(yǎng)基促進(jìn)側(cè)根的發(fā)育[13]；二是采用IBA與NAA兩種促進(jìn)生根的激素組合。付成華[14]在對(duì)常綠楊生根培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，過高濃度的IBA會(huì)使根系纖細(xì)，毛狀根少，基部產(chǎn)生膨大的愈傷。本研究中在IBA濃度達(dá)到0.4 mg/L（R5）時(shí)，植株基部膨大，根系細(xì)，分支少，而在0.2 mg/L的IBA（R3）中生長(zhǎng)的植株根系粗壯，分支發(fā)達(dá)（圖1D）。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]洪濤，麻左力，陳敬詩(shī).大葉楊花部形態(tài)及其在楊屬的分類位置[J].Acta Botanica Sinica， 1987，29（3）：236241.

[2]朱彤，李文鈿.大葉楊胚囊及胚珠的形成和發(fā)育[J].武漢植物學(xué)研究，1989，7（1）：1322.

[3]全永壽，楊年友，李玲，等.鄂西大葉楊快速繁育技術(shù)研究[J].湖北林業(yè)科技，2008，（5）：3233.

[4]Wang Huimei，Liu Hongmei，Wang Wenjie，et al. Effects of Thidiazuron， basal medium and light quality on adventitious shoot regeneration from in vitro cultured stem of Populus alba×P.berolinensis. [J].Journal of Forestry Research，2008， 19（3）， 257259

[5]于志水，金紅，苘勝軍，等.黑楊派楊樹組培再生系統(tǒng)的研究[J].遼寧林業(yè)科技，2002，（6）：1113.

[6]陶延珍，李楓，李毅.箭桿楊組織培養(yǎng)再生體系的建立[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，36（3）：203207.

[7]張利平，曹孜義，李唯.多效唑在葡萄試管種質(zhì)常溫保存中的應(yīng)用[J].園藝學(xué)報(bào)，1994，21（4）：389391.

[8]王大元，李建知，彭素蘭，等.用組織培養(yǎng)方法保存柑桔種質(zhì)的初步研究[J].園藝學(xué)報(bào)，1979，6（2）：9597.

[9]祖元?jiǎng)?，劉紅梅，王慧梅，等.鉆天楊的組織培養(yǎng)與植株再生[J].植物生理學(xué)通訊，2007，43（3）：522522.

[10]張冰玉，蘇曉華，鄭書星.山新楊葉片高頻率植株再生體系建立及其遺傳穩(wěn)定性[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：6873.

[11]李昆.I-63楊和I-69楊組織培養(yǎng)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[12]浦艷吉，李國(guó)懷，姚延興，等.李莖尖離體培養(yǎng)與植株再生[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（2）：214217.

[13]祁春芳，鄭智禮.白楊派楊樹組培技術(shù)研究.山西林業(yè)科技[J]，2000，（4）：2123.

[14]付成華.黑楊派楊樹再生體系建立的研究[D].武漢：華中農(nóng)大學(xué)，2005.

（責(zé)任編輯：鄭京津）