全外顯子組測序：兒童疾病診斷新思路

馬丁艾遙 馬丁艾路 王慧君 周文浩

?

·綜述·

全外顯子組測序：兒童疾病診斷新思路

馬丁艾遙1,4馬丁艾路3,4王慧君2周文浩2

縱觀人類遺傳學的發(fā)展，不斷有新興技術被運用于疾病病因的研究中。從各種流行病學研究設計到如今廣泛采用的以假說為導向的候選基因法[1]，從以家庭為基礎的遺傳連鎖研究[2～4]到全基因組關聯(lián)研究(GWAS)[5～8]，雖然這些方法均能在不同程度上反映疾病的遺傳易感性，但仍不可避免地存在許多限制[9～13]。而人類基因組圖譜的完成和新一代高通量測序技術的出現(xiàn)，為疾病病因的研究提供了全新的思路[14]。外顯子組序列僅占全基因組序列的1%，但大多數(shù)與疾病相關的變異位于外顯子區(qū)[15～17]，基因組定向捕獲工具的出現(xiàn)使外顯子組測序成為可能。近5年在PubMed上發(fā)表的外顯子組研究相關文章已達2 000余篇，對數(shù)百種疾病展開了深入研究，臨床診斷的文章也開始報道，可見利用全基因組外顯子測序(WES)尋找人類疾病的致病基因，是近年發(fā)展起來的研究疾病致病機制的重要方法之一。

1 WES應用于臨床診斷的基本策略

WES是利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。大致分為3個步驟：①將人類基因組中所有已知的編碼蛋白質的基因序列進行富集，即對全基因組外顯子進行捕獲、擴增;富集后，待測序序列總量大幅降低，但基因信息總量卻下降不多。②應用新一代測序技術對富集保留的DNA序列進行高覆蓋深度的測序，高質量、高通量地獲取所有基因的編碼蛋白質區(qū)域的堿基突變信息。③通過生物信息學分析及驗證，找到致病基因[18]。WES相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、剪接插入缺失(Indel) 等具有較大的優(yōu)勢。

以單基因疾病研究方案為例，首先需要按照疾病表型對家系成員進行嚴格篩查，明確其患病情況。再找出該疾病已有的研究背景和相關致病基因報道，通過傳統(tǒng)PCR測序方法對已知的疾病基因相關變異進行驗證和初篩；確認所研究的樣本中未發(fā)現(xiàn)相關的基因變異，挑選一個或數(shù)個相同疾病家系的核心成員進行WES。每個家系中的患病個體選取3～5個樣本，正常個體選取1～2名作為對照進行研究。按照疾病模型(常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳等)及樣品的家系信息對測序得到的結果進行分析，縮小候選變異的范圍，經(jīng)過多種注釋、篩選后過濾對功能無影響的變異及公共數(shù)據(jù)庫中的常見變異，再使用傳統(tǒng)PCR測序進行樣本擴大化驗證及相關的功能研究，最終確定疾病相關變異。

若為散發(fā)樣本，由于樣本間沒有血緣關系，遺傳背景相差較大，測序得到的結果也較難分析。使用散發(fā)樣本進行WES時需要更大的樣本量(>30例)，方能得到更為準確和有價值的結果。對大量患病個體的測序數(shù)據(jù)進行多樣本分析，從而確定候選疾病相關變異，再用傳統(tǒng)PCR測序在其他的相同疾病患病個體和正常人群中做進一步驗證。

2 WES是疾病診斷的利器

2009 年8 月，Ng等[19]通過WES從4 例Freeman-Sheldon綜合征(FSS)患者的DNA 中準確找出了致病基因MYH3，首次證明了WES在確定罕見疾病致病基因上的應用價值。僅1個月后，Choi等[20]運用WES在先天性氯丟失腹瀉患者中發(fā)現(xiàn)了新的致病基因突變位點SLC26A3，其研究更重要的意義在于糾正了先前臨床的錯誤診斷，凸顯出WES在發(fā)現(xiàn)新的致病基因和臨床診斷上的準確性。WES正式進入臨床則是在2011年，Worthey等[21]對1例難治性炎癥性腸病的15月齡男性患兒行WES，在X連鎖凋亡抑制基因中鑒定出一個錯義突變，并提示臍帶血移植治療策略的可能性。這項研究開創(chuàng)了WES臨床診斷的先河，也為個體化醫(yī)學的發(fā)展奠定了基礎。

近年來，越來越多的研究者將目光投向WES的臨床實踐。尤其在罕見性遺傳病的研究中顯露頭角，罕見病多系單基因病。根據(jù)OMIM數(shù)據(jù)庫(更新至2014年12月31日)，目前世界上報道的已知和懷疑的孟德爾遺傳病22 724種，其中確認為孟德爾遺傳病且致病分子基礎已知的有4 310種，確認為孟德爾遺傳病但分子基礎未知的1 678種，不確定是否為孟德爾遺傳病1 849種。單基因病的早期診斷、預防和治療，依賴于致病基因的發(fā)現(xiàn)、突變譜的鑒定及其功能研究。傳統(tǒng)的單基因病致病基因定位方法有候選基因法、定位克隆、全基因組掃描連鎖分析、物理圖譜、關聯(lián)分析和全基因組測序(WGS)等技術。然而，這些技術仍然存在難以克服的“瓶頸”，例如疾病遺傳異質性和遺傳模式的限制，患病親屬人數(shù)有限或家系資料不完整，患者為散發(fā)性(從頭突變)等。因此，至今依然不能完全確定疾病的易感基因。

近年來，越來越多的臨床大樣本研究表明，WES開始在單基因疾病診斷中顯現(xiàn)其獨特的價值。Yang等[22]對3 386例患者行WES，830例可明確診斷，診斷率約為25%，進一步驗證了該研究團隊1年前發(fā)表的250例初步報告[23]的診斷率。受試對象大多是兒童，臨床表現(xiàn)以神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主，如發(fā)育遲緩和智力障礙。其中92例(4.6%)患者可采取有效臨床干預措施。Yang等[22]認為，由于WES對外顯子區(qū)覆蓋不完全和對變異的解釋不足等局限性，25%的分子診斷率可能是低歸因的結果。Lee等[24]對814例患者行3人家系WES(雙親與患兒)和先證者測序，其中520例(64%)是兒童，其診斷率為26%(213/814)，而在3人家系測序組診斷率高達31%(127/410)，明顯高于先證者測序組22%(74/338)的分子診斷率。3人家系WES診斷率高主要是由于對從頭突變和雜合子突變的檢測能力提高所致。

文獻[22,24]為WES臨床分子診斷提供了有力證據(jù)。但其結果與以12名健康成年人為受試對象探究WGS應用價值的研究不同[25]。原因可能是：①WGS不僅能檢測蛋白編碼區(qū)的基因突變，而且還能檢測到非編碼區(qū)的突變。②文獻[22，24，25]驗前概率不同：在人群中一個健康個體罹患一種罕見遺傳疾病的可能性非常低，而臨床試驗研究本底人群是患者，每例患者所表現(xiàn)的臨床癥狀很可能就符合一種罕見遺傳疾病[26]?？傮w而言，已報道的WES有害突變檢出率在25%[27]～50%[28]。Atwal等[29]向北美47個臨床遺傳學檢測中心發(fā)起含8個問題條目的電子問卷調查，得到35份有效WES結果報告，歸納出實際只有22.8%的WES診斷成功率；如果排除可用其他替代方法明確診斷的結果，診斷成功率僅為17.1%；其中，1例還錯誤地將良性突變診斷為致病性突變。因此，WES實際診斷成功率并不像某些臨床實驗室和醫(yī)學文獻中報道的那樣高，受試人群的病種分布對其有很大影響。Atwal等[29]估計，目前WES有害突變診斷率為15%～25%。

2.1 神經(jīng)發(fā)育異常表型者診斷陽性率高 WES對于神經(jīng)系統(tǒng)異常表型的診斷率普遍高于非神經(jīng)系統(tǒng)表型，顯示出其在智力障礙和發(fā)育遲緩等兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷中的不俗表現(xiàn)。以往研究顯示[30, 31]，31%(16/51)的非綜合征性智力障礙散發(fā)病例和13%(13/100)的嚴重智力障礙患者可通過新一代測序技術獲得特異性分子診斷。Yang等[23]得到25%的WES分子診斷率可能是建立在本底人群臨床表型分類不同的基礎上，因為250例受試對象中有200例是以智力障礙為臨床特征之一。WES對于具有性神經(jīng)表型的患者(如智力障礙和發(fā)育遲緩)，分子診斷率高達33%；對于具有特殊神經(jīng)表型的患者(如運動障礙)，WES分子診斷率也達31%。此外，Yang等[22]在更大患者人群中也發(fā)現(xiàn)，有特殊的神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)組的診斷率高達36.1%，神經(jīng)系統(tǒng)異常組的診斷率是27.2%，神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)異常組診斷率是24.6%，而非神經(jīng)系統(tǒng)異常組的診斷率僅為20.1%。在Lee等[24]的表型亞組分析中，發(fā)育遲緩的兒童3人家系WES診斷率甚至高達41%，相對于先證者測序9%的診斷率有顯著提高。但在心肌病、腫瘤傾向和性發(fā)育障礙的表型人群中，3人家系WES診斷率并沒有升高。原因可能是醫(yī)生更愿意將三人WES診斷留給具有復雜綜合征的患者，而給非綜合征患者選擇先證者測序。

WES對于急性和非急性神經(jīng)發(fā)育障礙均有較高敏感度，并且可以縮短患兒診斷時間，指導神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。Soden等[32]對100個家庭的119例患有神經(jīng)發(fā)育障礙[智力障礙、全面發(fā)育遲緩和孤獨癥譜系障礙(ASD)]的兒童及其父母進行WES或WGS，非急性發(fā)作表型神經(jīng)發(fā)育障礙患兒WES診斷率40%(34/85)，急性發(fā)作表型神經(jīng)發(fā)育障礙患兒WGS診斷率 73%(11/15)。Sarah等[32]推測采用WES可使診斷提前77個月，而采用WGS則能再提前10個月。測序分析完成后，近一半家庭的臨床診療決策發(fā)生變化，而有些患者甚至需要改變治療方式?？傮w花費也低于以往的個體單個基因測序?？梢灶A見，以基因組為基礎的診斷將直接影響患有神經(jīng)發(fā)育障礙兒童的醫(yī)療服務模式。

值得注意的是，鑒于目前對通過顯性抑制或激活機制起作用的致病突變的檢測能力有限，文獻[33]顯示在無關的3人家系測序組之間觀察到4個新基因(COL4A3BP，PPP2R1A，PPP2R5D和PCGF2)具有相同的從頭突變。如下2種假說可以解釋這一現(xiàn)象：①文獻[33]只是在成千上萬的不同功能獲得性突變中偶然得到了結果，僅觸及事實的表面; ②由于這些特殊變異賦予了種系積極的選擇優(yōu)勢，因此存在富集現(xiàn)象[37]。評估這些假設將需要更多數(shù)據(jù)的分析。

由此可見，神經(jīng)發(fā)育障礙表型的患者尤其適合進行WES臨床分子診斷，WES是發(fā)現(xiàn)及證實許多神經(jīng)發(fā)育疾病致病基因的一種高效方法。WES或WGS將有助于準確描述新發(fā)疾病，顯示已知疾病不典型或未完全表現(xiàn)出來的表型，并幫助識別共患病。

2.2 能夠發(fā)現(xiàn)單基因病的復雜表現(xiàn) 文獻[23]發(fā)現(xiàn)，有4例患者存在一種突變基因對應≥2種疾病狀態(tài)的現(xiàn)象。純合子突變引起常染色體隱性遺傳的分子機制也多有涉及：59例突變基因分別遺傳自父系和母系，5例源自單親二體，4例則是由雜合子點突變和大范圍拷貝數(shù)變異(CNVs)的缺失引起。值得注意的是，常染色體隱性遺傳模式在獲得診斷的患者中所占比例較大(34.3%)，這與文獻[30]報道不符，100例智力障礙患者WES分子診斷16例，僅有1例是常染色隱性遺傳(6.3%)。文獻[22]遺傳模式分析表明，23例患者(4.6%)是由2個基因缺陷引起的混合表型。文獻[33]在17例患兒中鑒定出2個不同基因，均與致病突變有關，從而導致復合臨床表型。由此可見，WES能夠發(fā)現(xiàn)單基因病的復雜表現(xiàn)，隨著其在臨床上的廣泛應用，具有疊加癥狀和混雜表型的患者的診斷將不再困難。

2.3 對嵌合體的診斷優(yōu)勢明顯 如果測序深度高且尋找變異的工具足夠敏感，單核苷酸鏈的單獨序列分析能夠準確檢測嵌合體[39～41]。嵌合體即患者體內僅有一小部分細胞攜帶突變基因，常是嚴重早發(fā)性疾病的潛在原因，如Cornelia de Lange綜合征(CDLS)[42]。CDLS是一種以特殊面容、智力障礙和發(fā)育遲緩為特點的多系統(tǒng)疾病。大多數(shù)典型CDLS患者在NIPBL有功能喪失性新生雜合突變且嵌合體比例較高。而聯(lián)合SMC1A、SMC3、HDAC8和RAD21的突變則引起不典型CDLS。Ansari等[43]分別對163、90和19例患者行已知基因編碼區(qū)的突變、基因重排和NIPBL上深度內含子變異檢測，另外對5例行WES，發(fā)現(xiàn)致病突變被確定在：NIPBL46(嵌合體3，28.2%)；SMC1A5(嵌合體1，3.1%)；SMC35(嵌合體1，3.1%)；HDAC86(嵌合體0，3.6%)；RAD211(嵌合體0，0.6%)。在ANKRD11上鑒定出3個從頭突變且與KBG綜合征表型重疊。為估計未發(fā)現(xiàn)的嵌合體例數(shù)，文獻[43]使用遞歸分區(qū)來識別NIPBL陽性亞組的不同特點。依據(jù)這些特點對突變陰性組過濾，至少有18%被劃為“NIPBL樣”變異。

Fitzgerald等[33]對1 009例患兒和1 013例對照做外顯子組為重點的陣列比較基因組雜交(外顯子組-aCGH)，1 006例行全基因組基因分型，識別缺失、重復、單親二體和嵌合體。從WES和外顯子組-aCGH的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，每例患兒平均有19 811個編碼或拼接的單核苷酸變異(SNVs)、491個編碼或indels和148個CNVs。從基因分型陣列的數(shù)據(jù)[44]分析，文獻[33]確定了5例患兒是嵌合的大型染色體重排。文獻[22]2 000例患者的遺傳模式分析表明，280例是常染色體顯性遺傳(53.1%)，在顯性突變中，有208個(87%)是從頭突變，其中有5個已證明是嵌合體。由此可見，WES可以檢測到低水平的嵌合體，并能更好地估計突變細胞的比例[45～48]。

Petersen等[49]為了明確體細胞突變是否在Crohn病(CD)的發(fā)病中起重要作用，對兩組同卵雙胞胎的腸和血液樣本進行WES和WGS，目的是在患病雙胞胎中鑒定出候選的新CD易感基因位點。研究表明，體細胞嵌合體似乎并沒有在CD同卵雙胞胎患者的不一致性中發(fā)揮重要作用。但這是首次對CD雙胞胎行WGS，因此為今后的研究提供了一個有價值的參考數(shù)據(jù)集和嵌合體檢測的框架。

2.4 可以發(fā)現(xiàn)新的致病基因 WES是一個及時更新疾病基因的合適平臺。3 386例大樣本研究中近30%的診斷基于過去3年內所確定的致病基因。在504例樣本中發(fā)現(xiàn)了708個候選致病突變，58%的變異未報道過，且除WES外，尚無其他可用的基因檢測技術來發(fā)現(xiàn)這些未知基因突變[22]。值得注意的是，大部分未診斷病例很可能是由于新致病基因未被發(fā)現(xiàn)所致，對疾病相關文獻和數(shù)據(jù)庫的定期監(jiān)測將有助于提高診斷率[50]。de Ligt等[30]研究發(fā)現(xiàn)了24個有關智力障礙的從頭突變候選基因，其中3個基因的致病作用已被證實; 每1個病例中，攜帶有同一基因突變的患者間觀察到顯著的表型重疊現(xiàn)象，所發(fā)現(xiàn)的DYNC1H1、GATAD2B和CTNNB1是引起智力障礙的新基因，WES可以作為診斷原因不明的嚴重智力障礙患者的有效方法; 針對他們所研究的病例，WES診斷率達到16%。隨著方法技術的改進以及更多智力障礙相關基因的鑒定，WES診斷率可能還會提高。此外，針對覆蓋率低的外顯子區(qū)，新的靶向捕獲試劑正在研發(fā)中，以彌補目前對已知疾病基因測序的不足。

WES對新致病基因的發(fā)現(xiàn)，為罕見復雜疾病和難診斷疾病的臨床處理提供了解決之道。由于多變的外顯率、非特異性臨床表型或病理學特征，阻礙了Ⅳ型膠原相關腎病的診斷。Lin等[58]對3個伴有原因不明的遺傳性腎病家庭行WES，分別鑒定出2個新的和已知的COL4A3/COL4A4/COL4A5致病突變[59～61]。WES為非典型腎病的診斷困境提供了解決之道，同時也使恰當?shù)募膊∽稍兒椭委熃ㄗh成為可能。FOXP3突變被認為是IPEX樣綜合征(immune，dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome)的主要病因，但大型隊列研究表明，有>50%的患者未檢測到FOXP3突變[62]，這為臨床提高IPEX樣綜合征的診斷準確性帶來了難題。Charbonnier等[63]試圖確定特發(fā)性IPEX樣綜合征患者除FOXP3突變以外的遺傳異常，對3個家系進行了WES，并行有針對性的靶基因測序和表型功能分析，結果顯示：LRBA基因缺陷是IPEX樣綜合征和Treg細胞缺乏癥的新的致病原因[64～66]。此外，在Yang等[23]的研究中，4例經(jīng)WES診斷為Noonan綜合征，其中3例臨床表現(xiàn)不典型；1例表現(xiàn)典型，但基因panel序列分析未發(fā)現(xiàn)致病基因，經(jīng)WES后發(fā)現(xiàn)基因CBL上存在有害突變，而此基因未被囊括入panel的新基因。WES不僅可鑒別出新的有害突變，擴充致病基因備選庫，而且還能診斷出更多臨床表現(xiàn)不典型的常見遺傳病，完善疾病表型譜。

基于WES技術的研究設計為鑒定遺傳性缺失(missing heritability)提供了新的研究策略[67～69]， WES的數(shù)據(jù)分析可能是一種具有高成本效益的方式，在探索罕見復雜疾病的功能變異和病因學研究中發(fā)揮重要作用[70]。

值得注意的是，WES發(fā)現(xiàn)的新致病突變有助于進一步劃分疾病分子亞型，指導臨床靶向治療。前列腺癌中常見的基因變異包括NKX3.1和PTEN的缺失，雄激素受體基因(AR)的重復，ETS家族轉錄因子基因和雄激素敏感的啟動子序列融合等。以往觀點認為頻發(fā)體細胞堿基對替換較小影響前列腺的腫瘤發(fā)生過程[71, 72]，但這種觀點尚未經(jīng)大型隊列研究證實。Barbieri等[73]對112對前列腺腫瘤/正常組織進行WES，在多個基因中鑒定出新的頻發(fā)突變，包括MED12和FOXA1。SPOP是突變最頻繁的基因[74, 75]，有6%～15%的腫瘤組織基因突變涉及SPOP底物結合部位的保守殘端[76]。SPOP突變的前列腺癌缺乏ETS重排，并表現(xiàn)出一種獨特的基因組改變模式。WES測序結果的SPOP突變可能定義一種新的前列腺癌分子亞型。今后，這一不斷擴充的遺傳構架會使腫瘤的致癌機制更加明確，有助于疾病建模和患者分層治療。對前列腺癌的基因組、表觀基因組和轉錄組的系統(tǒng)性綜合分析，能夠進一步闡明疾病生物學背后的遺傳變化，并針對異質性惡性腫瘤的遺傳傾向予靶向治療。

由此可見，WES對新致病基因的發(fā)現(xiàn)可能提供病因學研究的新思路。許多研究為不同人類疾病之間的相關性提供了證據(jù)，包括孟德爾遺傳病和復雜疾病[77～79]、復雜疾病之間的相關性[80]。因此，是否可以提出這樣的假設：引起類似臨床表型的基因，是能夠解釋疾病易感性的、有參考價值的候選基因。此外，對涉及這些已知基因的特定細胞通路或網(wǎng)絡進行綜合分析[81, 82]，判斷其在患者體內中是否發(fā)生結構和功能突變，可以為選擇候選基因中的優(yōu)先考慮基因提供線索。這種方法已在ASD[83]的研究中得到證實，相信在基于WES的研究中也會發(fā)揮作用。另外，組合多種預測工具并產(chǎn)生一致性評估得分的方法，已證實有更突出的結果[84, 85]。然而，這些不同的工具或評估得分常常來源或應用于評價特定的數(shù)據(jù)集，建立一個全面評估敏感度和特異度的無偏倚“金標準”數(shù)據(jù)集是必要的[57]。

如果WES研究設計能以適當?shù)姆绞奖粦?，將會發(fā)現(xiàn)更多復雜疾病的新易感基因罕見突變。高質量和高可信度的大型參考數(shù)據(jù)集將會提高WES研究設計的可行性。包括外顯子組芯片在內的其他技術的發(fā)展，也在努力為罕見突變的功能注釋提供更好的參考數(shù)據(jù)庫。隨著進一步的大規(guī)模合作，基于病例對照設計的WES研究可能會更加具有可行性。此外，檢測新易感基因罕見突變也需要統(tǒng)計學和生物信息學工具的進步。在闡明復雜性狀中罕見編碼突變的病因學作用后，將有必要使用WGS技術對非編碼突變的作用做進一步探討。合適的統(tǒng)計學和生物信息學分析工具正在積極研發(fā)中[86, 87]，這對于復雜疾病遺傳基礎的認識至關重要。而其他探索突變基因功能性和改進功能分析策略的研究，也會使對易感性突變的生物學意義有更深刻的了解[88]。其他數(shù)據(jù)類型，包括表觀遺傳變異、mRNA表達水平和體細胞遺傳變異等，對考慮優(yōu)先候選基因是有幫助的，可以為種系遺傳變異的疾病轉化發(fā)生過程提供進一步的深層次理解，為易感基因相關生物學意義提供合理性解釋[57]。

3 WES在兒科復雜疾病中的研究應用

復雜疾病是在眾多因素共同作用下發(fā)生的，如多個基因、一個基因的多個突變、環(huán)境作用及未知的隨機因素。自2005 年以來，對于復雜疾病的研究，主要采用基于基因芯片的GWAS，通過比較病例與對照間SNP 的頻率差異來尋找風險變異因素。然而，目前的GWAS 只涉及復雜疾病和性狀易感基因的很少一部分，解釋的遺傳度極大地低于預期值，并且極少數(shù)SNPs被明確具有與疾病機制相關聯(lián)的功能性作用。基于ASD或精神分裂癥的測序研究，證明了對人基因組功能區(qū)域進行深度重測序是尋找復雜疾病的潛在罕見致病突變的關鍵方法[89]。現(xiàn)從兒科疾病的角度出發(fā)，主要介紹WES在ASD和先天性心臟病(CHD)中的臨床研究現(xiàn)況。

3.1 ASD ASD是一種高度遺傳的神經(jīng)發(fā)育紊亂，臨床表現(xiàn)以受損的社會互動和交流缺陷，受限制的重復行為為特征[90]。對有ASD患者的家族進行研究發(fā)現(xiàn)，兒童ASD同胞患病率為2%～8%，是一般人群發(fā)病率的50～200倍。雙生子研究則顯示，同卵雙生的同病一致率為60%，異卵雙生的同病一致率為0。這些證據(jù)證明遺傳因素是兒童ASD發(fā)病的重要原因。目前的研究對于候選基因的數(shù)目和界定仍不清楚，對存在1例以上ASD患者的家族進行的全基因組分析，估計該病至少是10個以上致病基因相互作用的結果。

隨著基因組學研究和測序技術的發(fā)展，基因組學已經(jīng)成為ASD近幾年主流的研究方向，每年均有新的ASD相關候選基因被報道。但由于ASD相關突變非常多樣，很難建立清晰的遺傳模式。大規(guī)模平行DNA測序發(fā)現(xiàn)了許多與ASD相關的罕見SNVs和微小indels變異。已證實WES對于檢測ASD中的從頭變異(DNVs)具有獨特價值[85,91～93]。WES相關研究已經(jīng)闡明了罕見遺傳性變異(IVs)的作用，如罕見基因缺失(遺傳性功能喪失的純合子，男性復合雜合子或X染色體變異)[94]、隱性純合子[95]、雙等位基因變異[96]和多家系變異共遺傳[97]。Chahrour等[95]對163個中東地區(qū)的ASD家庭進行WES，發(fā)現(xiàn)在基因AMT、PEX7、SYNE1、VPS13B、PAH和POMGNT1上都存在雙等位基因突變，此后他們又分析了612個美國ASD家庭的WES數(shù)據(jù)，得到了相同的發(fā)現(xiàn)[96]。這些基因大多與一些代謝或遺傳學綜合征有關，相關隱性突變影響比較輕微，使蛋白部分喪失功能。Lim等[94]對933例ASD患者的基因組和869例對照進行了WES，以檢測使基因功能完全喪失的隱性突變。文獻[94，95]研究相互補充，共同說明了隱性突變對ASD的重要性。最近，WGS也已鑒定出與非編碼DNA相關的罕見遺傳變異和影響基因剪接的變異[98,99]。由此可見，成百上千的罕見遺傳變異可以影響與ASD相關的多種生物學功能[100]，而以WES為代表的新一代測序技術或許可以成為解開ASD遺傳迷霧的突破口。

WES不僅在識別ASD相關致病突變方面作用突顯，而且以此為基礎推動了ASD發(fā)生機制的研究。Willsey等[101]指出了9個高可信度ASD風險基因的功能作用，然后發(fā)現(xiàn)所有基因都在胎兒發(fā)育的特定時間集中在大腦一個特定場所的一個單細胞類型。De Rubies等[102]和Iossifov等[103]共同合作的2項研究通過WES發(fā)現(xiàn)了100多個ASD相關基因突變，大多數(shù)都是從頭突變，其中60個基因突變有超過90%的概率引發(fā)ASD風險。上述研究表明，這些基因中的罕見突變可影響中樞神經(jīng)網(wǎng)絡。An等[104]利用“AXAS”基因網(wǎng)絡模型分析從澳大利亞ASD隊列中得到的WES數(shù)據(jù)，該模型描述了在ASD、X-連鎖智力障礙、注意缺陷多動障礙和精神分裂癥中所占比例過高的異質性DNA變異的功能模式。一種優(yōu)化的DNA變異篩選流程被用來確定功能缺失的DNA變異。該研究還發(fā)現(xiàn)，來自于父母表型更廣泛的可遺傳變異和從頭變異與ASD有顯著聯(lián)系。分析表明，假定罕見致病變異集中位于關鍵神經(jīng)生物學過程中的集群和比例大，并且在涉及神經(jīng)元發(fā)育、信號轉導和突觸發(fā)育等功能環(huán)節(jié)占比過高。這些研究結果同時證實，增加ASD風險的不是突變基因的規(guī)模，而是突變基因的位置。這些基因突變或許會導致ASD的風險增加5～20倍。Chang等[105]對數(shù)百名患者和近1 000個基因進行大型分析發(fā)現(xiàn)，ASD癥狀的多樣性可以追溯到患者基因突變的差異，包括特定基因突變和突變的嚴重程度，提示可以根據(jù)基因型與表型的關系利用患者的遺傳圖譜，開發(fā)精確的診斷和預后工具，甚至引導個性化治療。

3.2 CHD 是人類最常見的出生缺陷,在所有活產(chǎn)兒中發(fā)病率約為1%[106, 107]。大多數(shù)CHD是遺傳因素與環(huán)境相互作用的結果[108]。約30%的心臟畸形是綜合征性的疾病，如唐氏綜合征、22q11.2缺失綜合征和Holt-Oram綜合征[109, 110]；然而大多數(shù)CHD并不遵循孟德爾遺傳[111]。

過去10年常采用經(jīng)典連鎖分析或候選基因法探究CHD等家族性疾病的遺傳背景，而這些研究數(shù)據(jù)大多建立在模式生物(如基因敲除小鼠)的基礎上[112, 113]；染色體畸變(包括CNVs)則通過細胞遺傳學分析(如熒光原位雜交FISH等)鑒定[114, 115]；比較基因組雜交(aCGH)為篩選亞顯微水平染色體不平衡提供了更高的分辨率。利用aCGH的首次在CHD的研究表明，約17%的CHD患者具有潛在致病的罕見染色體畸變[116, 117]。全基因組SNP陣列已被用來確定散發(fā)CHD病例中的拷貝數(shù)變化[118～120]。為了找到與復雜疾病相關的SNPs，GWAS已在數(shù)百到數(shù)千人的大型隊列研究中展開[121]。相關技術方法也在其他研究中得到證實[122, 123]?？傊鲜黾夹g方法為探索CHD的遺傳學基礎展現(xiàn)了很好的前景。但仍然有很大比例的心臟畸形不能確定遺傳病因。

二代測序技術則是目前進一步闡明CHD遺傳背景的有效新方法。例如，Dorn等[124]針對CHD提出了一個高通量測序設計和分析路線圖，也適用于其他復雜疾病。WES、高分辨率熔煉分析和直接DNA測序的聯(lián)合應用確定了一個家族異質性CHD可能的致病突變基因[125]。應用WES可以識別出患有先天性心臟病的內臟異位患者SHROOM3上存在錯義突變[126]。NGS使大型隊列中的成千上萬個基因甚至整個基因組實現(xiàn)了同時分析。與微陣列不同，NGS不依賴于DNA雜交預選探針，這有利于在單堿基分辨率上鑒定新變異，這也預示著新疾病基因網(wǎng)絡的發(fā)現(xiàn)。不過，由于大量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，要鑒定真正的疾病相關基因是非常復雜的。大規(guī)模人口研究表明，可以在任何健康個體中觀察到大量潛在的致病變異[127～129]。NGS的運用還發(fā)現(xiàn)，一些致病突變在健康個體和個別情況下可以被耐受，盡管發(fā)生頻率極低。因此，新測序方法應用到類似CHD的復雜疾病分析時仍然具有挑戰(zhàn)性。

WES與其他技術的聯(lián)合應用可彌補其在檢測罕見CNVs上的不足，提高對CHD等復雜疾病的應用價值。Glessner等[125]對538例CHD患者和1 301名健康對照采用全基因組SNP微陣列和WES，研究新發(fā)CNVs在散發(fā)CHD發(fā)病中的致病作用；這2種互補的高分辨率技術從51 例CHD患者中鑒定出63個新發(fā)CNV，證明CHD患者罕見新發(fā)CNV出現(xiàn)頻率顯著增高：SNP陣列[P=7×10(-5)；比值比4.6]或WES[P=6×10(-4)；比值比3.5]；而除去16%曾被報告為致病性新發(fā)CNV位點后，CNV出現(xiàn)頻率仍保持較高水平(P=0.02后，比值比為2.7)；在15q11.2上的CYFIP1、NIPA1和NIPA2上還檢測到頻發(fā)新發(fā)CNV，在DUSP1、JUN、JUP、MED15、MED9、PTPRE、SREBF1、TOP2A和ZEB2上檢測到單個新發(fā)CNV，均與已知的CHD蛋白NKX2- 5和GATA4存在相互作用；還發(fā)現(xiàn)ETS1的11q24.2-25缺失引發(fā)Jacobsen綜合征，CTBP2是10q端粒缺失的致病基因。

房間隔缺損是CHD最常見的缺陷之一。過去研究表明，轉錄因子T-box 20突變(TBX20)是先天性房間隔缺損的病因之一。Liu等[126]采用WES聯(lián)合CHD相關基因過濾檢測1家3代的房間隔缺損患者，發(fā)現(xiàn)1種新型TBX20突變，c.526G> A(p.D176N)。生物信息學程序(SIFT，Polyphen2和MutationTaster)預測這種突變是有害的。此突變以前并沒有包括在SNP數(shù)據(jù)庫(dbSNP)或國家心臟、肺和血液研究所(NHLBI)WES計劃(ESP)的數(shù)據(jù)中。Liu等發(fā)現(xiàn)擴大了TBX20突變譜，證明了TBX20在心臟發(fā)育中起著重要作用，也為小家系CHD的遺傳研究提供了一個性價比較高的新分析策略。Greenway等[130]對1個常染色體顯性遺傳隔離繼發(fā)孔型房間隔缺損高發(fā)的家系進行WES，此前候選基因測序和連鎖分析均無結果。2例患者鑒定出44個罕見共同變異，包括在α-心肌肌動蛋白(ACTC1)中的非同義突變(c.532A> T，p.M178L，NM_005159.4)；而1 834名對照、千人基因組和ESP的均無此突變，p.M178L也是唯一1個從家系中分離得到的罕見基因突變。Greenway等[130]的研究為ACTC1突變在房間隔缺損中的致病作用提供了進一步的證據(jù)支持，而大規(guī)模平行WES也使檢測CHD新罕見變異成為可能，不再受到候選基因法的局限。當突變預測算法無效時，家族性疾病的研究可有助于從良性變異中區(qū)分罕見的致病突變，重視家族史研究也使對CHD的遺傳見解更加深入。

研究證明，SCN5A突變是遺傳性心律失常的潛在病因，但其與復雜重疊表型，特別是與CHD的聯(lián)系則很少報道。Tan等[131]聯(lián)合運用WES和生物信息學的策略，在1個多代家系中鑒定出常染色體顯性心臟傳導疾病(CCD)的致病基因，發(fā)現(xiàn)SCN5A上存在一種新的無義突變(Y1495X)，推測該突變產(chǎn)生截短的SCN5A蛋白從而導致鈉電流損失，明確了SCN5A相關性心律失常的機制。由此可見，WES是一種對罕見臨床表型做遺傳分析的非常有效的方法，為臨床表現(xiàn)陰性的家屬提供了準確的基因檢測信息。

利用高通量測序的大型CHD隊列研究有望更好地了解疾病潛在的復雜遺傳學基礎。兒童心臟基因組協(xié)會建立的CHD遺傳網(wǎng)絡，納入3 700例各種類型的CHD，旨在探討CHD患者遺傳因素、臨床特點和結局之間的關系。正在進行的研究包括對心臟組織樣品分別運用WGS和RNA測序以實現(xiàn)CNV的識別，候選基因的重排及體細胞突變和等位基因錯誤表達的檢索[131]。Zaidi等[132]對362例患者及其父母WES從頭突變在CHD患者組蛋白修飾基因中呈明顯富集現(xiàn)象，說明表觀遺傳調控在心臟發(fā)育中具有重要作用。威康信托基金會桑格研究所發(fā)起的解密發(fā)育障礙(DDD)研究(http://www.ddduk.org/)，從12 000例未確診的發(fā)育障礙兒童及其父母處收集臨床數(shù)據(jù)和DNA樣本，其中也包括CHD患者，使用高分辨率aCGH、SNP基因分型和WES來辨別不同疾病潛在的遺傳原因。UK10K項目(http://www.uk10k.org/)對125例CHD患者在其罕見疾病樣本組內進行WES。后2項研究仍在進行中，尚未公布CHD的相關研究結果。

WES能更好地理解各種綜合征和非綜合征性CHD的遺傳基礎[133]，但是這些研究能闡明機制的病例比例仍然很小。例如，罕見CNVs能解釋5%～20%篩選過的CHD，WES僅能解讀10%散發(fā)重癥CHD病例的從頭突變[132,134]。

Blue等[135]研究利用16個有明確CHD病史的家系所組成的隊列篩選出57個候選基因的靶向panel，將測序結果分別與15個健康對照、1000WGS計劃和全外顯子組測序計劃中的數(shù)據(jù)進行比較，31%(5/16)的家系鑒定出致病變異，又在這些致病突變的基礎上根據(jù)3個家系確定了一個可能的綜合征病因；此外，還在25%的家系中發(fā)現(xiàn)了意義不明的變異。有人認為，此研究獲得基因診斷的疾病，可能僅需臨床檢查就能明確，例如TFABP2突變(Char綜合征)，TBX5突變(Holt-Oram綜合征)和ELN突變(主動脈瓣上狹窄)。然而現(xiàn)實中，許多患者的臨床表型不明顯，呈現(xiàn)出外顯率下降、多變表型增多的趨勢，阻礙了快速便捷的表型識別[136]。而Blue等[135]的研究證明了使用分子診斷能更容易地解決這一臨床現(xiàn)實，當然還要考慮到NGS產(chǎn)生了前所未有的海量難題，而表型分型仍然是一個更費時的過程。

從其他對復雜疾病的研究中可以推斷，僅靠WES將不能完全確定單一表型特征的CHD的遺傳基礎，至少與目前WES普遍能檢測出致病變異的分析范例不符。例如，Martin等[137]應用WES到二葉主動脈瓣(BAV)及其他心血管畸形高發(fā)的17人家系中，評估了3種常用于WES和家系連鎖分析的變異選擇策略，仍未能確定BAV的遺傳變異基礎，說明假定致病變異改變編碼意義的WGS，可能不足以揭示BAV和其他復雜性狀。非編碼變異和寡基因遺傳可能是這些現(xiàn)象的原因，目前面臨的主要挑戰(zhàn)將是如何鑒別良性變異和致病突變，并研制出真正個性化的基因檢測工具。

從技術角度來看，WES已經(jīng)取代靶向基因panel，為編碼變異提供了一個無偏倚、全基因組范圍篩查的平臺。然而，其明顯優(yōu)勢依賴于耗費巨大的數(shù)據(jù)分析。另外，WES在覆蓋深度方面遜于靶向基因panel，因為NGS需要多個測序讀數(shù)重疊以提高可信度。因此，WES目前只建議作為當靶向基因panel等未能取得成果時的后續(xù)篩查。隨著這些技術的日益成熟，類似Blue等[122]研究的意義在于，在不同臨床場景下，為不同類型CHD的基因診斷奠定基礎。更多的研究者開始轉變立場，提出應加強兒科心臟病專家的職業(yè)培訓和繼續(xù)醫(yī)學教育，以適應新技術要求的知識基礎和操作能力。核心課程也必須迅速改變，以配合在基因組學領域的進展步伐。

4 WES在兒童腫瘤中的研究應用

4.1 揭示腫瘤發(fā)生機制 越來越多的研究者已認識到WES在兒童實體腫瘤發(fā)生機制研究中的潛在價值。神經(jīng)母細胞瘤是兒童最常見的實體腫瘤。為揭示神經(jīng)母細胞瘤的遺傳基礎，Sausen等[138]采用大規(guī)模并行測序的設計，分別進行了WGS(6例)、WES(16例)、全基因組重排分析(32例)和特定基因位點的靶向分析(40例)，鑒定出染色質重塑基因ARID1A和ARID1B突變(8/71，11%)，且這些變異均與早期治療失敗和存活率降低有關。根據(jù)腫瘤特異性的結構變異，Sausen等[138]設計了鑒定血清中重排DNA片段的新方法，為微小殘留病灶的檢測和監(jiān)控提供了個性化的生物學標志物。結果強調了染色質重塑失調在兒童腫瘤發(fā)生過程中的重要影響，并為神經(jīng)母細胞瘤的治療方案提供了新思路。

腎母細胞瘤是最常見的兒童腎癌。Rakheja等[139]對44例腎母細胞瘤患兒進行WES，發(fā)現(xiàn)體細胞microRNA(miRNA)加工酶DROSHA和DICER1存在錯義突變，并在MYCN、SMARCA4和ARID1A三個基因中發(fā)現(xiàn)新突變。DICER1 RNase IIIB突變優(yōu)先干擾pre-miRNA發(fā)夾結構5′-端的miRNA的加工過程，同時DROSHARNase IIIB突變從整體上通過顯性失活機制抑制miRNA的生物合成。而DROSHA和DICER1突變又共同干擾抑癌基因(TSG)miRNA的表達，包括let-7家族、MYCN、LIN28等重要調節(jié)因子和其他腎母細胞瘤的原癌基因。由此可見，體細胞miRNA生物合成元件的突變促使miRNA表達重編程，導致腫瘤發(fā)生。WES加快了這些新遺傳突變的發(fā)現(xiàn)速度，為腎母細胞瘤新亞型的劃分提供了病因學方面的遺傳依據(jù)，同時也為機制研究和臨床治療提供了新視角。

膠質瘤是兒童最常見的腦腫瘤。為了確定高級別膠質瘤(HGGs)其他的致病突變，F(xiàn)ontebasso等[140]對543例HGGs患者行WES，在15%的兒童HGGs中，H3K36 三甲基轉移酶(trimethyltransferase)SETD2存在突變，且該突變在全基因組范圍均顯著(FDR=0.029)。其他的隊列研究證實，在低級別膠質瘤中未檢測到SETD2突變。SETD2是人類唯一的H3K36 三甲基轉移酶，而SETD2突變腫瘤顯示出H3K36me3水平顯著降低(P<0.001)，表明該突變是功能損害性的。此外，喪失功能的SETD2突變多發(fā)生在年齡較大的兒童和青年人，且特定出現(xiàn)在大腦皮質的HGGs中，與H3.3 G34R/V和IDH突變的情況類似。Fontebasso等[140]研究提示，SETD2突變破壞了組蛋白H3K36位的編碼從而導致膠質瘤的發(fā)生，WES又從表觀遺傳學的角度為腫瘤發(fā)生機制提供了新思路。

4.2 作為分型依據(jù) 腫瘤的分型與其惡性程度有關，不同分型的腫瘤其治療方式又截然不同，預后也相差甚遠。

以往基于活檢結果將髓母細胞瘤患者分為標準風險和高風險兩類。Pugh等[141]根據(jù)基因表達譜和罕見CNVs將髓母細胞瘤分為4種分子亞型，每種亞型具有不同的生存率。他們同時對突變基因進行功能分析，結果表明是由于少數(shù)常見基因調控機制受到干擾而引起髓母細胞瘤的發(fā)生，這些干擾的形式在各個腫瘤中有所不同，從而進一步揭示了腫瘤異質性的原因。由此可見，不僅需要在基因組水平上對兒童腫瘤進行分層分型，更需要明確哪些基因突變會驅動哪種分子亞型，其機制又如何，從而實現(xiàn)基于分子分型的預后及靶向治療，提高診斷率和療效。

4.3 提示腫瘤預后 以兒童常見的室管膜瘤為例，目前的標準治療包括手術和放射，但化療效果不佳。Mack等[142]對47例后腦室管膜瘤患兒行WGS和WES，發(fā)現(xiàn)基因組突變率極低以及無顯著頻發(fā)體細胞SNVs。雖然缺乏頻發(fā)的SNVs和集中的罕見CNVs，但預后不良的后腦室管膜瘤表現(xiàn)出CpG島甲基化表型。CpG甲基化介導的轉錄沉默區(qū)僅僅集中在PRC2復合體的靶基因上，而已知PRC2通過H3K27的三甲基化(H3K27me3)抑制分化基因的表達。CpG島甲基化陽性表型的后腦室管膜瘤對靶向DNA或H3K27甲基化的體外和體內臨床藥物有敏感性。表觀遺傳修飾位點也許可以作為臨床化療的首要候選靶點。同時，這項研究也提示，某些惡性腫瘤可能呈現(xiàn)遺傳學改變不顯著，而表觀遺傳學變化明顯的特點，而腫瘤預后可能正是與表觀遺傳學的變化息息相關。

4.4 提供治療靶點 越來越多的研究和臨床試驗證實，WES對新致病突變的發(fā)現(xiàn)可以為基于全基因組分析技術的治療干預措施提供潛在的新靶點。

盡管目前轉移性或復發(fā)性兒童橫紋肌肉瘤的生存率有所提高，但患者預后情況仍然不容樂觀。橫紋肌肉瘤有2種基因表型：PAX3或PAX7融合基因型、缺乏融合基因型。Shern等[143]對147例患者進行了WGS、WES和轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，橫紋肌肉瘤的體細胞突變率總體比較低，尤其是在含有PAX3/7融合基因的腫瘤中。盡管突變率相對較低，但除了先前報道過的NRAS、KRAS、HRAS、FGFR4、PIK3CA和CTNNB1頻發(fā)突變外，還發(fā)現(xiàn)了新的FBXW7和BCOR頻發(fā)突變。此外，93%的病例檢測到受體酪氨酸激酶/RAS/PIK3CA軸突變，提示基因組學定向療法可能改善橫紋肌肉瘤患者的預后。

顱咽管瘤患者的臨床后遺癥主要來源于腫瘤浸潤或治療干預使視交叉、垂體柄和下丘腦區(qū)域損傷，目前仍缺乏有效的診斷和治療措施。Brastianos等[144]WES研究發(fā)現(xiàn)，CTNNB1突變幾乎存在于所有的成釉質細胞型顱咽管瘤中(11/12，92%)，而BRAF頻發(fā)突變存在于所有的乳頭狀顱咽管瘤(3/3，100%)。靶向基因分型結果與WES測序結果相吻合。CTNNB1和BRAF突變的鑒定為顱咽管瘤的分子治療提供了重要的靶向位點。

嬰兒肌纖維瘤病(IM)是兒童軟組織最常見的良性纖維瘤。Martignetti等[145]對9個不同家庭的32個全血樣本進行WES發(fā)現(xiàn)，PDGFRB[146]和NOTCH3是導致IM的2個關鍵突變基因?，F(xiàn)已有藥物(如伊馬替尼和舒尼替尼)可抑制PDGFRB和NOTCH3的表達。對PDGFRB和NOTCH3通路之間聯(lián)系的進一步研究可能會發(fā)現(xiàn)導致IM的其他突變，同時對理解腫瘤生長消退機制和尋找靶向治療位點具有重要意義。

兒童HGGs是一種破壞性極強的惡性腫瘤，診斷后2年存活率<20%，由于其發(fā)生機制仍不清楚，故缺乏有效的治療措施。Wu等[147]分析了127例HGGs患兒，包括彌漫性橋腦內膠質瘤(DIPGs)和非腦干HGGs(NBS-HGGs)。通過WGS、WES和轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)只有DIPGs(32%)的ACVR1基因檢測到頻發(fā)體細胞突變。此外，在47%的DIPGs和NBS-HGGs中，因結構變異而產(chǎn)生的融合基因也被檢測到，40%的嬰兒NBS-HGGs病例中神經(jīng)營養(yǎng)因子受體基因NTRK1、NTRK2和NTRK3頻發(fā)融合。值得注意的是，在68%、73%和59%的兒童HGGs中(包括DIPGs和NBS-HGGs)，分別發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶-RAS-PI3K信號通路、組蛋白修飾或染色質重塑過程、以及細胞周期調控通路上都存在靶向突變。某些特定或共同的細胞信號通路內基因位點的突變與兒童HGG有關，提示基于這些位點的靶向治療具有研究的價值。

骨肉瘤是兒童最常見的原發(fā)性骨腫瘤，但30年間其治療或生存率均無實質性進展。Perry等[148]對59例患兒進行WES、WGS和RNA測序，只有TP53基因在所有樣品中有顯著突變頻率。鑒于腫瘤異質性、基因組不穩(wěn)定性及大樣本獲取難度，該研究利用通路分析、shRNA篩選等方法發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細胞系對PI3K/mTOR通路的抑制劑敏感。僅僅找到基因突變位點是遠遠不夠的，還需要了解突變基因引起細胞內錯誤信號傳達的機制，并利用藥物測試和建立模式動物研究模型[149]，才能夠為兒童腫瘤的靶向治療提供更充分的遺傳研究基礎。

5 WES的應用局限性

Lee等[24]對WES在實際臨床研究中的局限性作了總結。①鑒于3人家系WES診斷的高額費用和在無癥狀父母中檢出陽性的可能性，臨床醫(yī)生可能不會選擇此種方法。②非隨機化分組使未觀察到的混雜因素可能影響診斷率。③WES并不能發(fā)現(xiàn)所有具有潛在因果關系的基因突變型，可能出現(xiàn)嚴重遺漏，如病理性重復擴增(見于脊髓小腦共濟失調)和大多數(shù)罕見CNVs。④WES也不能取樣所有的蛋白編碼堿基，平均序列覆蓋率有限。⑤3人家系WES診斷對表型數(shù)據(jù)和變異型兩者之間聯(lián)系的解釋分析能力上還有待進一步提高。

自美國醫(yī)學遺傳學會(ACMG)公布偶然發(fā)現(xiàn)的相關指南后，如何報告WES中預期外發(fā)現(xiàn)的問題便引起人們的極大關注[27, 150～153]。ACMG建議，當基于臨床目的對兒童或成人開展WGS或WES時，應當評估與24種遺傳疾病相關的56個基因[154]。然而WES往往不能產(chǎn)生高質量的結果而錯過特定基因中的變異。為此，研究人員調查了56個ACMG基因中突變的假陰性率[153]。對44個外顯子組數(shù)據(jù)集進行了回顧性分析，這些數(shù)據(jù)來自4個不同的外顯子組捕獲試劑盒和2個測序平臺。研究人員還研究了WES檢測56個ACMG基因中相關突變的能力。總體而言，這4種外顯子組方法的覆蓋度都不足。在每種外顯子組方法中，至少有1個基因錯過了40%以上的致病基因變異；最差的有4個基因錯過了>90%的變異?，F(xiàn)有的測序試劑盒有較高的假陰性率。必須強調的是，當臨床外顯子組分析沒有報告致病的基因變異，可能是因為變異所在的區(qū)域沒有被分析，而不是患者的DNA中沒有致病變異。因此，如果外顯子組無法獲得預期的表現(xiàn)，則應當進一步使用疾病特異的靶向基因panel。產(chǎn)生足夠大量的序列數(shù)據(jù)，以實現(xiàn)最佳的覆蓋度。

綜上所述,由于WES是將全基因組外顯子區(qū)域DNA富集后進行高通量測序的基因組分析方法，其對基因組信息的解讀可能出現(xiàn)以下重要遺漏：①在染色體末端重復區(qū)域內的外顯子不能被檢測到；②無法發(fā)現(xiàn)線粒體基因中的突變；③忽略染色體結構變異，如易位或倒位；④無法有效診斷三堿基突變疾病，如Huntington's病和脆性X綜合征；⑤無法發(fā)現(xiàn)其他罕見CNVs；⑥內含子中的致病突變會被WES忽略；⑦無法發(fā)現(xiàn)單親二倍體；⑧無法發(fā)現(xiàn)調控序列的DNA變異；⑨無法檢測基因之間是否有相互作用；⑩無法解讀表觀遺傳學改變。

6 WES的相關倫理問題

目前在遺傳學者中已達成這樣一種共識：WGS和WES的廣泛應用不僅是大勢所趨，而且將大有益處[155]。但是，由于其較以前的基因檢測相比定位精確度有所下降，對于在測序過程中可能出現(xiàn)的重要臨床發(fā)現(xiàn)應如何處理，引發(fā)了道德辯論。測序的結果可能被指定為有科學意義，也可能恰恰相反?？茖W意義的結果是指那些有統(tǒng)計證據(jù)證明的基因型(遺傳變異)與一個特定表型(例如，疾病的癥狀或危險因素)之間有相互關系的變異。如果沒有足夠的證據(jù)來支持這種關系，那么這種變異叫做“不確定意義變異”(VUS)。VUS并不一定意味著基因型-表型之間的關系不存在，而是表示當前沒有該人群足夠的統(tǒng)計學證據(jù)來證實這個結果。WGS產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，許多觀察到的變異都只有不確定的意義，需要進一步的臨床研究來確定其意義，這也使反饋研究參與者更多個人信息的行為成為收集更多數(shù)據(jù)的必要(例如，從其他家庭成員采集更多的生物樣本和表型數(shù)據(jù))。Hallowell等[156]認為，拋開這些發(fā)現(xiàn)是有意為之或是偶然出現(xiàn)，如何處理WES和WGS研究的倫理問題也受到臨床或科學研究背景的影響。Hallowell等[156]還呼吁，增加樣品采集目的的透明度，更加明確科學研究與臨床背景轉換的議程，落實患者和研究參與者對于偶發(fā)問題及其影響的知情權，并曉之以必要的應對措施。

2014年1月，Illumina公司宣布可在不超過1 d的時間內，以1 000美元的夢幻價格完成對1個人的WGS，測序價格的急劇下降無疑極大提高了新一代測序的可行性。雖然從技術上來說測序一個基因組和獲得原始數(shù)據(jù)的成本急劇下降，WGS的總體成本，包括數(shù)據(jù)的安全儲存、解讀和處理，目前還不清楚。文獻[155]對WGS的成本計算進行了回顧分析，發(fā)現(xiàn)如果考慮到分析數(shù)據(jù)和結果處理時需要的專家團隊，就必須認真考慮“1 000美元的基因組”和“100 000美元的分析”。此外，為讓臨床醫(yī)生正確解讀WGS結果而必需的一般背景知識培訓目前還很缺乏[1]。遺傳咨詢面臨的困境在于，向患者解釋技術的本質和結果需要大量的時間，而且實際上如何傳達信息以讓他們更好地理解也是難題所在。目前大多數(shù)已構建的引導生物醫(yī)學研究和診斷實踐的倫理框架并非專為NGS的應用而設計[157, 158]，因此這些框架可能需要重新闡釋和修正。

6.1 知情同意 知情同意實施過程中常存在以下問題：①需告知的信息量超載或信息內容過于復雜；②患者及家屬對信息的理解和記憶能力有限；③醫(yī)患雙方間存在信息理解偏差和虛假希望。這些都有可能使WGS實施時知情同意過程變得更加復雜[157, 159, 160]。以下問題尤其需要關注：知情同意過程中哪些信息需要收錄、知情同意應如何實現(xiàn)以及是否可以保留在遺傳學研究中習慣使用的觀念等[161]。主要關注理由之一是最終分析結果的高度不確定性。首先，這種不確定性一方面會造成期望結果的益處和風險因素的不平衡，例如得到不希望得到的信息、丟失隱私權和虛假期望；另一方面，對突變意義的錯誤理解也間接影響治療方案[162]。因此，應客觀表述WES和WGS在臨床應用上的益處[163]。第二，結果的多樣性也引出了如下問題：需要決定哪些結果將反饋給研究對象和患者，以及不同的利益相關者在決定反饋給研究對象的結果時有多大的自主權。第三，結果信息可能與家屬相關或有暗示作用，而家屬并沒有參與知情同意過程。第四，考慮到數(shù)據(jù)的未來利用度和分享度，必須再三斟酌知情同意的適用范圍。最后，必須強調知情同意在研究過程和臨床場景中的差別，避免治療性誤解的發(fā)生。為了在臨床中進行WES和WGS時實施恰當?shù)闹橥?，應在測序前花費大量時間做充分輔導咨詢[164]。具體注意事項可參考Ayuso等[165]總結的WGS知情同意參考標準。

6.2 數(shù)據(jù)解讀 為決定哪些結果需要反饋，Berg等[166]提出了臨床WGS中間儲倉式系統(tǒng)的構想，根據(jù)分類標準決定反饋計劃。例如，具有臨床可行性的結果一定要上報，無臨床意義或不明的結果不需反饋，臨床上有效但可行性欠佳的結果根據(jù)研究對象的意愿反饋等。McGuire等總結了目前已有的共識：與臨床確實相關且具有直接可行性的結果應該反饋給受試對象[167],而不必公開意義不明的研究結果[168]。而對于預期沒有估計到的意外結果，或稱“脫靶結果”[154],是否應反饋給受試對象至今還沒有能被廣泛認可的解決方案[154,169～173]。

6.3 數(shù)據(jù)知情和處理意見 NGS的應用產(chǎn)生了大量的原始序列數(shù)據(jù)和遺傳變異結果：WGS有望揭示300萬至400萬的基因變異，WES也有望顯示大約2萬的突變型[164]。Pinxten等[174]分別從數(shù)據(jù)存儲、分析和分享3個方面討論數(shù)據(jù)處理的倫理和實用性問題。①是否有及在何種情況下有義務必須做到記錄保存，②未成年人達到法定成年年齡時能否訪問曾經(jīng)的測序數(shù)據(jù)，③尋求新的診斷和治療方案的患者是否應重新聯(lián)系[175]，④電子病歷還不能很好地儲存大量WES和WGS原始數(shù)據(jù)的問題[164]，⑤存儲的數(shù)據(jù)可能會產(chǎn)生實際鑒定和破壞隱私保密的風險等[176]。生物信息學分析也并非完全是自動化處理，許多醫(yī)療保健機構都缺乏必要的資源投資昂貴的設備，聘請包括生物信息學等方面的有關專家。仍然需要包含更多醫(yī)療相關數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫[177]。由此所帶來的經(jīng)濟成本的增加可能已超過技術上的花費[178]。此外，決定不同遺傳變異對研究對象個人健康的意義[166]和將不同變異恰當分類[176, 179]是很困難的。而要使所得數(shù)據(jù)價值最大化就必須分享數(shù)據(jù)，越是更多地分享在表型相似患者身上發(fā)現(xiàn)的變異，就越能實現(xiàn)對變異的正確分類。對研究人員和專家們，應提倡并保證數(shù)據(jù)分享的合理實現(xiàn)[180]；對患者和研究對象，應保證他們對數(shù)據(jù)分享計劃的知情，否則缺少透明度會損害公眾對WES和WGS的信任[176]。

7 展望

WES的臨床價值在于，可對單獨依據(jù)臨床或實驗室難以確診的不典型疾病、檢查項目昂貴疾病和基因突變型未知的疾病做出診斷[181]，從而更全面地了解疾病的病因和發(fā)展史，指導特異性治療[182]。WES的應用給兒童疾病診斷帶來了全新的思路，進一步擴展了人們對疾病譜的認知度。依據(jù)目前WES在兒童單基因遺傳病和一些復雜疾病研究中的突出表現(xiàn)，不難推測其在腫瘤學、慢性疾病、產(chǎn)前診斷、新生兒疾病篩查和健康人群普查中也將發(fā)揮重要作用，因此明確WES的有效應用領域和范圍十分必要。

臨床醫(yī)師應該明智地判斷在何種情況下需使用WES診斷，向患者及其家屬詳細解釋WES的結果含義、風險和限制，并避免為追求診斷給患者增加不必要的經(jīng)濟負擔。WES推動了對疾病遺傳致病機制的深入探究，隨著致病基因的不斷發(fā)現(xiàn)和發(fā)病機制的逐漸揭示，臨床個體化用藥和個性化治療也將真正成為現(xiàn)實，從而顯著改善生命質量[183, 184]。

對兒科學領域而言，WES在產(chǎn)前診斷中的意義尤為重要。WES能識別家族中的致病基因攜帶者和疾病易感者，預測后代患病風險，為早期診斷和排除診斷提供信息基礎[185]?；颊呒覍倏衫眠@些信息作為產(chǎn)前診斷、植入前遺傳學診斷和是否繼續(xù)生育的參考，避免嚴重缺陷患兒的出生或及早采取有效的針對措施。但是，分子診斷的建立能否對患者及其家庭的醫(yī)療情況產(chǎn)生深遠影響還存在爭論。目前的數(shù)據(jù)依然很難準確識別WES的整體性能[26]，由于對突變體致病性的錯誤解釋，以及醫(yī)學文獻中對基因與相關表型的張冠李戴，仍不可避免假陽性的產(chǎn)生。同時，基因病因的未知性和不可測性也增加了假陰性的可能。關于WES性價比、精確度、收益率和與臨床基因診斷的有效整合程度還需通過前瞻性研究進一步分析。

如今，WES已成為WGS的經(jīng)濟替代[14]，但其在測序覆蓋度、檢測變異類型、操作復雜度和有效數(shù)據(jù)的覆蓋均一性等許多方面與WGS相比依然存在明顯不足。隨著WGS的成本不斷下降，WES的吸引力將會消退。可以預測，WGS會大范圍地替代WES，WES今后可能僅在科研和臨床診斷中還有所運用，直至完全退出測序市場。

隨著第二代高通量測序技術的廣泛應用，其不足之處也日益凸顯。例如，讀長較短對后續(xù)生物信息學分析帶來困難[186]，擴增后和擴增前DNA 分子片段的數(shù)目偏差對基因表達分析有很大影響[187]等。而日漸興起的第三代單分子測序技術，因其采用單分子讀取技術，數(shù)據(jù)讀取速度更快且不需要PCR 擴增，進一步降低了測序成本，比第二代測序技術有著更廣闊的應用空間。單分子測序技術的出現(xiàn)將促進個體醫(yī)學研究的飛速發(fā)展。測序通量的增加可以在短時間內就完成人體染色體將近300 億個堿基對的測序。而費用的降低則使WGS接近甚至達到1 000美元基因組的目標。這預示著建立個人基因組信息檔案將不再遙遠，個人的基因組基本信息將作為診斷、治療和預防的手段。

[1]Kwon JM, Goate AM. The candidate gene approach. Alcohol Res Health, 2000, 24(3): 164-168

[2]Dawn TM, Barrett JH. Genetic linkage studies. Lancet, 2005, 366(9490): 1036-1044

[3]Teare MD. Approaches to genetic linkage analysis. Methods Mol Biol, 2011, 713: 55-67

[4]Dueker ND, Pericak-Vance MA. Analysis of genetic linkage data for mendelian traits. Curr Protoc Hum Genet, 2014, 83: 1-4

[5]Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001, 409(6822): 860-921

[6]Cargill M, Altshuler D, Ireland J, et al. Characterization of single-nucleotide polymorphisms in coding regions of human genes. Nat Genet, 1999, 22(3): 231-238

[7]Bush WS, Moore JH. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS Comput Biol, 2012, 8(12): e1002822

[8]Marian AJ. Molecular genetic studies of complex phenotypes. Transl Res, 2012, 159(2): 64-79

[9]Lunetta KL. Genetic association studies. Circulation, 2008, 118(1): 96-101

[10]Manolio TA, Collins FS, Cox NJ, et al. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature, 2009, 461(7265): 747-753

[11]Stranger BE, Stahl EA, Raj T. Progress and promise of genome-wide association studies for human complex trait genetics. Genetics, 2011, 187(2): 367-383

[12]Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science, 2002, 296(5576): 2225-2229

[13]International HapMap Consortium. A haplotype map of the human genome. Nature, 2005, 437(7063): 1299-1320

[14]Biesecker LG, Green RC. Diagnostic clinical genome and exome sequencing. N Engl J Med, 2014, 371(12): 1170

[15]Stenson PD, Mort M, Ball EV, et al. The Human Gene Mutation Database: 2008 update. Genome Med, 2009, 1(1): 13

[16]Choi M, Scholl UI, Ji W, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(45): 19096-19101

[17]Hedges DJ, Burges D, Powell E, et al. Exome sequencing of a multigenerational human pedigree. PLoS One,2009, 4(12): e8232

[18]Jiang X, Chen R, Cheng S, et al. Computational advances in cancer informatics (a). Cancer Inform, 2014, 13(Suppl 1): 45

[19]Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature, 2009, 461(7261): 272-276

[20]Choi M, Scholl UI, Ji W, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A,2009, 106(45): 19096-19101

[21]Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, et al. Making a definitive diagnosis: successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease. Genet Med, 2011, 13(3): 255-262

[22]Yang Y, Muzny DM, Xia F, et al. Molecular findings among patients referred for clinical whole-exome sequencing. JAMA, 2014, 312(18): 1870

[23]Yang Y, Niu Z, Hardison M, et al. Clinical whole-exome sequencing for the diagnosis of mendelian disorders. New Engl J Med,. 2013, 369(16): 1502

[24]Lee H, Deignan JL, Dorrani N, et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA, 2014, 312(18): 1880

[25]Dewey FE, Grove ME, Pan C, et al. Clinical Interpretation and Implications of Whole-Genome Sequencing. JAMA, 2014, 311(10): 1035

[26]Berg JS. Genome-scale sequencing in clinical care: establishing molecular diagnoses and measuring value. JAMA,2014, 312(18): 1865-1867

[27]Eng CM, Yang Y, Plon SE. Genetic diagnosis through whole-exome sequencing. N Engl J Med,2014, 370(11): 1068

[28]Need AC, Shashi V, Hitomi Y, et al. Clinical application of exome sequencing in undiagnosed genetic conditions. J Med Genet, 2012, 49(6): 353-361

[29]Atwal PS, Brennan M, Cox R, et al. Clinical whole-exome sequencing: are we there yet? Genet Med,2014, 16(9): 717-719

[30]de Ligt J, Gilissen C, Del Rosario M, et al. Diagnostic exome sequencing in persons with severe intellectual disability. N Engl J Med, 2012, 367(20): 1921

[31]Rauch A, Wieczorek D, Graf E, et al. Range of genetic mutations associated with severe non-syndromic sporadic intellectual disability: an exome sequencing study. Lancet, 2012, 380(9854): 1674-1682

[32]Soden SE, Saunders CJ, Willig LK, et al. Effectiveness of exome and genome sequencing guided by acuity of illness for diagnosis of neurodevelopmental disorders. Sci Transl Med, 2014, 6(265): 168-265

[33]Fitzgerald TW, Gerety SS, Jones WD, et al. Large-scale discovery of novel genetic causes of developmental disorders. Nature, 2014

[34]Craddock N, Owen MJ. The Kraepelinian dichotomy - going, going... but still not gone. Br J Psychiatry, 2010, 196(2): 92-95

[35]Jacquemont S, Coe BP, Hersch M, et al. A higher mutational burden in females supports a "female protective model" in neurodevelopmental disorders. Am J Hum Genet, 2014, 94(3): 415-425

[36]Levy D, Ronemus M, Yamrom B, et al. Rare de novo and transmitted copy-number variation in autistic spectrum disorders. Neuron, 2011, 70(5): 886-897

[37]Goriely A, Wilkie AO. Paternal age effect mutations and selfish spermatogonial selection: causes and consequences for human disease. Am J Hum Genet, 2012, 90(2): 175-200

[38]Allen AS, Berkovic SF, Cossette P, et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature, 2013, 501(7466): 217-221

[39]Pagnamenta AT, Lise S, Harrison V, et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet,2012, 57(1): 70-72

[40]Tapper WJ, Foulds N, Cross NC, et al. Megalencephaly syndromes: exome pipeline strategies for detecting low-level mosaic mutations. PLoS One, 2014, 9(1): e86940

[41]Lohmann K, Klein C. Next generation sequencing and the future of genetic diagnosis. Neurotherapeutics,2014, 11(4): 699-707

[42]Huisman SA, Redeker EJ, Maas SM, et al. High rate of mosaicism in individuals with Cornelia de Lange syndrome. J Med Genet,2013, 50(5): 339-344

[43]Ansari M, Poke G, Ferry Q, et al. Genetic heterogeneity in Cornelia de Lange syndrome (CdLS) and CdLS-like phenotypes with observed and predicted levels of mosaicism. J Med Genet,2014, 51(10): 659-668

[44]King DA, Fitzgerald TW, Miller R, et al. A novel method for detecting uniparental disomy from trio genotypes identifies a significant excess in children with developmental disorders. Genome Res,2014, 24(4): 673-687

[45]Lindhurst MJ, Sapp JC, Teer JK, et al. A mosaic activating mutation in AKT1 associated with the Proteus syndrome. N Engl J Med, 2011,365(7):611-619

[46]Tapper WJ, Foulds N, Cross NC, et al. Megalencephaly syndromes: exome pipeline strategies for detecting low-level mosaic mutations. PLoS One,2014, 9(1): e86940

[47]Lupski JR. Genetics. Genome mosaicism--one human, multiple genomes. Science, 2013, 341(6144): 358-359

[48]Campbell IM, Yuan B, Robberecht C, et al. Parental somatic mosaicism is underrecognized and influences recurrence risk of genomic disorders. Am J Hum Genet, 2014, 95(2): 173-182

[49]Petersen BS, Spehlmann ME, Raedler A, et al. Whole genome and exome sequencing of monozygotic twins discordant for Crohn′s disease. BMC Genomics, 2014, 15: 564

[50]Bainbridge MN, Hu H, Muzny DM, et al. De novo truncating mutations in ASXL3 are associated with a novel clinical phenotype with similarities to Bohring-Opitz syndrome. Genome Med, 2013, 5(2): 11

[51]Yu S, Chen L, Ye L, et al. Identification of two missense mutations of ERCC6 in three Chinese sisters with cockayne syndrome by whole exome sequencing. PLoS One, 2014, 9(12): e113914

[52]Laugel V. Cockayne syndrome: the expanding clinical and mutational spectrum. Mech Ageing Dev, 2013, 134(5-6): 161-170

[53]Punetha J, Monges S, Franchi ME, et al. Exome sequencing identifies DYNC1H1 variant associated with vertebral abnormality and spinal muscular atrophy with lower extremity predominance. Pediatr Neurol, 2014,pii: S0887-8994

[54]Willemsen MH, Vissers LE, Willemsen MA, et al. Mutations in DYNC1H1 cause severe intellectual disability with neuronal migration defects. J Med Genet, 2012, 49(3): 179-183

[55]Poirier K, Lebrun N, Broix L, et al. Mutations in TUBG1, DYNC1H1, KIF5C and KIF2A cause malformations of cortical development and microcephaly. Nat Genet, 2013, 45(6): 639-647

[56]Fiorillo C, Moro F, Yi J, et al. Novel dynein DYNC1H1 neck and motor domain mutations link distal spinal muscular atrophy and abnormal cortical development. Hum Mutat, 2014, 35(3): 298-302

[57]Baasch A, Hüning I, Gilissen C, et al. Exome sequencing identifies a de novo SCN2A mutation in a patient with intractable seizures, severe intellectual disability, optic atrophy, muscular hypotonia, and brain abnormalities. Epilepsia, 2014, 55(4): e25-e29

[58]Lin F, Bian F, Zou J, et al. Whole exome sequencing reveals novel COL4A3 and COL4A4 mutations and resolves diagnosis in Chinese families with kidney disease. BMC Nephrol,2014: 15, 175

[59]Moriniere V, Dahan K, Hilbert P, et al. Improving mutation screening in familial hematuric nephropathies through next generation sequencing. J Am Soc Nephrol, 2014, 25(12): 2740-2751

[60]Deltas C, Pierides A, Voskarides K. Molecular genetics of familial hematuric diseases. Nephrol Dial Transplant, 2013, 28(12): 2946-2960

[61]Fallerini C, Dosa L, Tita R, et al. Unbiased next generation sequencing analysis confirms the existence of autosomal dominant Alport syndrome in a relevant fraction of cases. Clin Genet, 2014, 86(3): 252-257

[62]Barzaghi F, Passerini L, Gambineri E, et al. Demethylation analysis of the FOXP3 locus shows quantitative defects of regulatory T cells in IPEX-like syndrome. J Autoimmun,2012, 38(1): 49-58

[63]Charbonnier L, Janssen E, Chou J, et al. Regulatory T-cell deficiency and immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked-like disorder caused by loss-of-function mutations in LRBA. J Allergy Clin Immunol, 2015, 135(1): 217-227

[64]Lopez-Herrera G, Tampella G, Pan-Hammarstrom Q, et al. Deleterious mutations in LRBA are associated with a syndrome of immune deficiency and autoimmunity. Am J Hum Genet, 2012, 90(6): 986-1001

[65]Verbsky JW, Chatila T A. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX) and IPEX-related disorders: an evolving web of heritable autoimmune diseases. Curr Opin Pediatr, 2013, 25(6): 708-714

[66]Burns SO, Zenner HL, Plagnol V, et al. LRBA gene deletion in a patient presenting with autoimmunity without hypogammaglobulinemia. J Allergy Clin Immunol, 2012, 130(6): 1428-1432

[67]Kiezun A, Garimella K, Do R, et al. Exome sequencing and the genetic basis of complex traits. Nat Genet, 2012, 44(6): 623-630

[68]Manolio TA, Collins FS, Cox NJ, et al. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature, 2009, 461(7265): 747-753

[69]Mccarthy MI, Abecasis GR, Cardon LR, et al. Genome-wide association studies for complex traits: consensus, uncertainty and challenges. Nat Rev Genet, 2008, 9(5): 356-369

[70]Wu L, Schaid DJ, Sicotte H, et al. Case-only exome sequencing and complex disease susceptibility gene discovery: study design considerations. J Med Genet, 2014, 52(1): 10-16

[71]Kumar A, White TA, Mackenzie AP, et al. Exome sequencing identifies a spectrum of mutation frequencies in advanced and lethal prostate cancers. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(41): 17087-17092

[72]Taylor BS, Schultz N, Hieronymus H, et al. Integrative genomic profiling of human prostate cancer. Cancer Cell, 2010, 18(1): 11-22

[73]Barbieri CE, Baca SC, Lawrence MS, et al. Exome sequencing identifies recurrent SPOP, FOXA1 and MED12 mutations in prostate cancer. Nature Genet, 2012, 44(6): 685-689

[74]Kan Z, Jaiswal BS, Stinson J, et al. Diverse somatic mutation patterns and pathway alterations in human cancers. Nature, 2010, 466(7308): 869-873

[75]Berger MF, Lawrence MS, Demichelis F, et al. The genomic complexity of primary human prostate cancer. Nature, 2011, 470(7333): 214-220

[76]Zhuang M, Calabrese MF, Liu J, et al. Structures of SPOP-substrate complexes: insights into molecular architectures of BTB-Cul3 ubiquitin ligases. Mol Cell, 2009, 36(1): 39-50

[77]Blair DR, Lyttle CS, Mortensen JM, et al. A nondegenerate code of deleterious variants in Mendelian loci contributes to complex disease risk. Cell, 2013, 155(1): 70-80

[78]Novarino G, Fenstermaker AG, Zaki MS, et al. Exome sequencing links corticospinal motor neuron disease to common neurodegenerative disorders. Science, 2014, 343(6170): 506-511

[79]Duggan S, Prichard D, Kirca M, et al. Inherited Syndromes Predisposing to Inflammation and GI Cancer. Recent Results Cancer Res, 2011, 185: 35-50

[80]Wu L, Goldstein AM, Yu K, et al. Variants associated with susceptibility to pancreatic cancer and melanoma do not reciprocally affect risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2014, 23(6): 1121-1124

[81]Iyer G, Al-Ahmadie H, Schultz N, et al. Prevalence and co-occurrence of actionable genomic alterations in high-grade bladder cancer. J Clin Oncol, 2013, 31(25): 3133-3140

[82]Jia P, Zhao Z. VarWalker: personalized mutation network analysis of putative cancer genes from next-generation sequencing data. PLoS Comput Biol, 2014, 10(2): e1003460

[83]O′Roak BJ, Vives L, Girirajan S, et al. Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations. Nature,2012, 485(7397): 246-250

[84]Li MX, Kwan JS, Bao SY, et al. Predicting mendelian disease-causing non-synonymous single nucleotide variants in exome sequencing studies. PLoS Genet, 2013, 9(1): e1003143

[85]Bendl J, Stourac J, Salanda O, et al. PredictSNP: robust and accurate consensus classifier for prediction of disease-related mutations. PLoS Comput Bio, 2014, 10(1): e1003440

[86]Torkamani A, Scott-Van ZA, Topol EJ, et al. Annotating individual human genomes. Genomics,2011, 98(4): 233-241

[87]Khurana E, Fu Y, Colonna V, et al. Integrative annotation of variants from 1092 humans: application to cancer genomics. Science, 2013, 342(6154): 1235587

[88]Do R, Kathiresan S, Abecasis GR. Exome sequencing and complex disease: practical aspects of rare variant association studies. Hum Mol Genet, 2012, 21(R1): R1-R9

[89]Myers RA, Casals F, Gauthier J, et al. A population genetic approach to mapping neurological disorder genes using deep resequencing. PLoS Genet, 2011, 7(2): e1001318

[90]Cristino AS, Williams SM, Hawi Z, et al. Neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders represent an interconnected molecular system. Mol Psychiatry,2014, 19(3): 294-301

[91]Neale BM, Kou Y, Liu L, et al. Patterns and rates of exonic de novo mutations in autism spectrum disorders. Nature, 2012, 485(7397): 242-245

[92]Sanders SJ, Murtha MT, Gupta AR, et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature, 2012, 485(7397): 237-241

[93]Iossifov I, Ronemus M, Levy D, et al. De novo gene disruptions in children on the autistic spectrum. Neuron, 2012, 74(2): 285-299

[94]Lim E T, Raychaudhuri S, Sanders SJ, et al. Rare complete knockouts in humans: population distribution and significant role in autism spectrum disorders. Neuron, 2013, 77(2): 235-242

[95]Chahrour MH, Yu TW, Lim ET, et al. Whole-exome sequencing and homozygosity analysis implicate depolarization-regulated neuronal genes in autism. PLoS Genet, 2012, 8(4): e1002635

[96]Yu TW, Chahrour MH, Coulter ME, et al. Using whole-exome sequencing to identify inherited causes of autism. Neuron, 2013, 77(2): 259-273

[97]Toma C, Torrico B, Hervas A, et al. Exome sequencing in multiplex autism families suggests a major role for heterozygous truncating mutations. Mol Psychiatry, 2014, 19(7): 784-790

[98]Jiang YH, Yuen RK, Jin X, et al. Detection of clinically relevant genetic variants in autism spectrum disorder by whole-genome sequencing. Am J Hum Genet, 2013, 93(2): 249-263

[99]Shi L, Zhang X, Golhar R, et al. Whole-genome sequencing in an autism multiplex family. Mol Autism, 2013, 4(1): 8

[100]Betancur C. Etiological heterogeneity in autism spectrum disorders: more than 100 genetic and genomic disorders and still counting. Brain Res, 2011, 1380: 42-77

[101]Willsey AJ, Sanders SJ, Li M, et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell, 2013, 155(5): 997-1007

[102]De Rubeis S, He X, Goldberg AP, et al. Synaptic, transcriptional and chromatin genes disrupted in autism. Nature,2014, 515(7526): 209-215

[103]Iossifov I, O′Roak BJ, Sanders SJ, et al. The contribution of de novo coding mutations to autism spectrum disorder. Nature,2014, 515(7526): 216-221

[104]An JY, Cristino AS, Zhao Q, et al. Towards a molecular characterization of autism spectrum disorders: an exome sequencing and systems approach. Transl Psychiatry, 2014, 4: e394

[105]Chang J, Gilman SR, Chiang AH, et al. Genotype to phenotype relationships in autism spectrum disorders. Nat Neurosci, 2015, 18(2): 191-198

[106]Hoffman JI, Kaplan S. The incidence of congenital heart disease. J Am Coll Cardiol, 2002, 39(12): 1890-1900

[107]Reller MD, Strickland MJ, Riehle-Colarusso T, et al. Prevalence of congenital heart defects in metropolitan Atlanta, 1998-2005. J Pediatr, 2008, 153(6): 807-813

[108]Nora JJ. Multifactorial inheritance hypothesis for the etiology of congenital heart diseases. The genetic-environmental interaction. Circulation, 1968, 38(3): 604-617

[109]Antonarakis SE, Lyle R, Dermitzakis ET, et al. Chromosome 21 and down syndrome: from genomics to pathophysiology. Nat Rev Genet, 2004, 5(10): 725-738

[110]Momma K. Cardiovascular anomalies associated with chromosome 22q11.2 deletion syndrome. Am J Cardiol, 2010, 105(11): 1617-1624

[111]Basson CT, Bachinsky DR, Lin RC, et al. Mutations in human TBX5 cause limb and cardiac malformation in Holt-Oram syndrome. Nat Genet, 1997, 15(1): 30-35

[112]Schott JJ, Benson DW, Basson CT, et al. Congenital heart disease caused by mutations in the transcription factor NKX2-5. Science,1998, 281(5373): 108-111

[113]Sperling S, Grimm CH, Dunkel I, et al. Identification and functional analysis of CITED2 mutations in patients with congenital heart defects. Hum Mutat, 2005, 26(6): 575-582

[114]Driscoll DA, Salvin J, Sellinger B, et al. Prevalence of 22q11 microdeletions in DiGeorge and velocardiofacial syndromes: implications for genetic counselling and prenatal diagnosis. J Med Genet, 1993, 30(10): 813-817

[115]Yamagishi H, Srivastava D. Unraveling the genetic and developmental mysteries of 22q11 deletion syndrome. Trends Mol Med, 2003, 9(9): 383-389

[116]Thienpont B, Mertens L, de Ravel T, et al. Submicroscopic chromosomal imbalances detected by array-CGH are a frequent cause of congenital heart defects in selected patients. Eur Heart J, 2007, 28(22): 2778-2784

[117]Erdogan F, Larsen LA, Zhang L, et al. High frequency of submicroscopic genomic aberrations detected by tiling path array comparative genome hybridisation in patients with isolated congenital heart disease. J Med Genet, 2008, 45(11): 704-709

[118]Alkan C, Coe BP, Eichler EE. Genome structural variation discovery and genotyping. Nat Rev Genet,2011, 12(5): 363-376

[119]Greenway SC, Pereira AC, Lin JC, et al. De novo copy number variants identify new genes and loci in isolated sporadic tetralogy of Fallot. Nat Genet, 2009, 41(8): 931-935

[120]Soemedi R, Wilson IJ, Bentham J, et al. Contribution of global rare copy-number variants to the risk of sporadic congenital heart disease. Am J Hum Genet, 2012, 91(3): 489-501

[121]Manolio TA. Genomewide association studies and assessment of the risk of disease. N Engl J Med, 2010, 363(2): 166-176

[122]Blue GM, Kirk EP, Sholler GF, et al. Congenital heart disease: current knowledge about causes and inheritance. Med J Aust, 2012, 197(3): 155-159

[123]Fahed AC, Gelb BD, Seidman JG, et al. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circ Res, 2013, 112(4): 707-720

[124]Dorn C, Grunert M, Sperling SR. Application of high-throughput sequencing for studying genomic variations in congenital heart disease. Brief Funct Genomics, 2014, 13(1): 51-65

[125]Glessner JT, Bick AG, Ito K, et al. Increased frequency of de novo copy number variants in congenital heart disease by integrative analysis of single nucleotide polymorphism array and exome sequence data. Circ Res, 2014, 115(10): 884-896

[126]Liu JJ, Fan L L, Chen JL, et al. A novel variant in TBX20 (p.D176N) identified by whole-exome sequencing in combination with a congenital heart disease related gene filter is associated with familial atrial septal defect. J Zhejiang Univ Sci B, 2014, 15(9): 830-837

[127]Tennessen JA, Bigham AW, O′Connor TD, et al. Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes. Science,2012, 337(6090): 64-69

[128]Marth GT, Yu F, Indap AR, et al. The functional spectrum of low-frequency coding variation. Genome Biol,2011, 12(9): R84

[129]Li Y, Vinckenbosch N, Tian G, et al. Resequencing of 200 human exomes identifies an excess of low-frequency non-synonymous coding variants. Nat Genet, 2010, 42(11): 969-972

[130]Greenway SC, Mcleod R, Hume S, et al. Exome sequencing identifies a novel variant in ACTC1 associated with familial atrial septal defect. Can J Cardiol, 2014, 30(2): 181-187

[131]Tan ZP, Xie L, Deng Y, et al. Whole-exome sequencing identifies Y1495X of SCN5A to be associated with familial conduction disease and sudden death. Sci Rep, 2014, 4: 5616

[132]Zaidi S, Choi M, Wakimoto H, et al. De novo mutations in histone-modifying genes in congenital heart disease. Nature, 2013, 498(7453): 220-223

[133]Wessels MW, Willems PJ. Genetic factors in non-syndromic congenital heart malformations. Clin Genet, 2010, 78(2): 103-123

[134]Soemedi R, Wilson IJ, Bentham J, et al. Contribution of global rare copy-number variants to the risk of sporadic congenital heart disease. Am J Hum Genet,2012, 91(3): 489-501

[135]Blue GM, Kirk EP, Giannoulatou E, et al. Targeted next-generation sequencing identifies pathogenic variants in familial congenital heart disease. J Am Coll Cardiol,2014, 64(23): 2498-2506

[136]Andelfinger G. Next-generation sequencing in congenital heart disease: do new brooms sweep clean? J Am Coll Cardiol,2014, 64(23): 2507-2509

[137]Martin LJ, Pilipenko V, Kaufman KM, et al. Whole exome sequencing for familial bicuspid aortic valve identifies putative variants. Circ Cardiovasc Genet,2014, 7(5): 677-683

[138]Sausen M, Leary RJ, Jones S, et al. Integrated genomic analyses identify ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer neuroblastoma. Nat Genet, 2013, 45(1): 12-17

[139]Rakheja D, Chen KS, Liu Y, et al. Somatic mutations in DROSHA and DICER1 impair microRNA biogenesis through distinct mechanisms in Wilms tumours. Nat Commun, 2014, 2: 4802

[140]Fontebasso AM, Schwartzentruber J, Khuong-Quang DA, et al. Mutations in SETD2 and genes affecting histone H3K36 methylation target hemispheric high-grade gliomas. Acta Neuropathol, 2013, 125(5): 659-669

[141]Pugh TJ, Weeraratne SD, Archer TC, et al. Medulloblastoma exome sequencing uncovers subtype-specific somatic mutations. Nature, 2012, 488(7409): 106-110

[142]Mack SC, Witt H, Piro RM, et al. Epigenomic alterations define lethal CIMP-positive ependymomas of infancy. 2014: 506, 445-450

[143]Shern JF, Chen L, Chmielecki J, et al. Comprehensive genomic analysis of rhabdomyosarcoma reveals a landscape of alterations affecting a common genetic axis in fusion-positive and fusion-negative tumors. Cancer Discov, 2014, 4(2): 216-231

[144]Brastianos PK, Taylor-Weiner A, Manley PE, et al. Exome sequencing identifies BRAF mutations in papillary craniopharyngiomas. Nature Genet,2014, 46(2): 161-165

[145]Martignetti JA, Tian L, Li D, et al. Mutations in PDGFRB cause autosomal-dominant infantile myofibromatosis. Am J Hum Genet, 2013, 92(6): 1001-1007

[146]Cheung YH, Gayden T, Campeau PM, et al. A recurrent PDGFRB mutation causes familial infantile myofibromatosis. Am J Hum Genet,2013, 92(6): 996-1000

[147]Wu G, Diaz AK, Paugh BS, et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat Genet, 2014, 46(5): 444-450

[148]Perry JA, Kiezun A, Tonzi P, et al. Complementary genomic approaches highlight the PI3K/mTOR pathway as a common vulnerability in osteosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(51): E5564-E5573

[149]Majczenko K, Davidson AE, Camelo-Piragua S, et al. Dominant mutation of CCDC78 in a unique congenital myopathy with prominent internal nuclei and atypical cores. Am J Hum Genet, 2012, 91(2): 365-371

[150]Green RC, Lupski JR, Biesecker LG. Reporting genomic sequencing results to ordering clinicians: incidental, but not exceptional. JAMA, 2013, 310(4): 365-366

[151]Ross LF, Rothstein MA, Clayton EW. Mandatory extended searches in all genome sequencing: "incidental findings," patient autonomy, and shared decision making. JAMA,2013, 310(4): 367-368

[152]Klitzman R, Appelbaum PS, Chung W. Return of secondary genomic findings vs patient autonomy: implications for medical care. JAMA,2013, 310(4): 369-370

[153]Park JY, Clark P, Londin E, et al. Clinical exome performance for reporting secondary genetic findings. Clin Chem, 2015,61(1):213-220

[154]Green RC, Berg JS, Grody WW, et al. ACMG recommendations for reporting of incidental findings in clinical exome and genome sequencing. Genet Med, 2013, 15(7): 565-574

[155]Lerner-Ellis JP. The clinical implementation of whole genome sequencing: a conversation with seven scientific experts. J Inherit Metab Dis,2012, 35(4): 689-693

[156]Hallowell N, Hall A, Alberg C, et al. Revealing the results of whole-genome sequencing and whole-exome sequencing in research and clinical investigations: some ethical issues. J Med Ethics,2014,pii: medethics-2013-101996

[157]Caulfield T, Mcguire AL, Cho M, et al. Research ethics recommendations for whole-genome research: consensus statement. PLoS Biol, 2008, 6(3): e73

[158]Kaye J, Boddington P, de Vries J, et al. Ethical implications of the use of whole genome methods in medical research. Eur J Hum Genet, 2010, 18(4): 398-403

[159]Levenseller BL, Soucier DJ, Miller VA, et al. Stakeholders′ opinions on the implementation of pediatric whole exome sequencing: implications for informed consent. J Genet Couns, 2014, 23(4): 552-565

[160]Mcguire AL, Caulfield T, Cho MK. Research ethics and the challenge of whole-genome sequencing. Nat Rev Genet, 2008, 9(2): 152-156

[161]Ormond KE. From genetic counseling to "genomic counseling". Mol Genet Genomic Med, 2013, 1(4): 189-193

[162]Hayden EC. Sequencing set to alter clinical landscape. Nature,2012, 482(7385): 288

[163]Brunham LR, Hayden M R. Medicine. Whole-genome sequencing: the new standard of care?. Science, 2012, 336(6085): 1112-1113

[164]Johansen TK, Dickinson BD, Wilson M. The promise and challenges of next-generation genome sequencing for clinical care. JAMA Intern Med, 2014, 174(2): 275-280

[165]Ayuso C, Millan JM, Mancheno M, et al. Informed consent for whole-genome sequencing studies in the clinical setting. Proposed recommendations on essential content and process. Eur J Hum Genet, 2013, 21(10): 1054-1059

[166]Berg JS, Khoury MJ, Evans JP. Deploying whole genome sequencing in clinical practice and public health: meeting the challenge one bin at a time. Genet Med, 2011, 13(6): 499-504

[167]Wolf SM. Return of individual research results and incidental findings: facing the challenges of translational science. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2013, 14: 557-577

[168]Mcguire AL, Lupski JR. Personal genome research : what should the participant be told? Trends Genet,2010, 26(5): 199-201

[169]van El CG, Cornel MC, Borry P, et al. Whole-genome sequencing in health care: recommendations of the European Society of Human Genetics. Eur J Hum Genet, 2013, 21(6): 580-584

[170]Miller FA, Giacomini M, Ahern C, et al. When research seems like clinical care: a qualitative study of the communication of individual cancer genetic research results. BMC Med Ethics, 2008, 9: 4

[171]Murphy J, Scott J, Kaufman D, et al. Public expectations for return of results from large-cohort genetic research. Am J Bioeth, 2008, 8(11): 36-43

[172]Shalowitz DI, Miller FG. Communicating the results of clinical research to participants: attitudes, practices, and future directions. PLoS Med, 2008, 5(5): e91

[173]Kaufman D, Murphy J, Scott J, et al. Subjects matter: a survey of public opinions about a large genetic cohort study. Genet Med, 2008, 10(11): 831-839

[174]Pinxten W, Howard HC. Ethical issues raised by whole genome sequencing. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2014, 28(2): 269-279

[175]Jacob HJ, Abrams K, Bick DP, et al. Genomics in clinical practice: lessons from the front lines. Sci Transl Med,2013, 5(194): 194-195

[176]Tabor HK, Berkman BE, Hull SC, et al. Genomics really gets personal: how exome and whole genome sequencing challenge the ethical framework of human genetics research. Am J Med Genet A,2011, 155A(12): 2916-2924

[177]Landrum MJ, Lee JM, Riley GR, et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Res, 2013, 42(D1): D980-D985

[178]Mardis ER. The $1,000 genome, the $100,000 analysis?. Genome Med, 2010, 2(11): 84

[179]Grove ME, Wolpert MN, Cho MK, et al. Views of genetics health professionals on the return of genomic results. J Genet Couns, 2014, 23(4): 531-538

[180]Mabile L, Dalgleish R, Thorisson GA, et al. Quantifying the use of bioresources for promoting their sharing in scientific research. Gigascience, 2013, 2(1): 7

[181]Johansen TK, Dickinson BD, Wilson M. The promise and challenges of next-generation genome sequencing for clinical care. JAMA Intern Med, 2014, 174(2): 275-280

[182]Desai AN, Jere A. Next-generation sequencing: ready for the clinics? Clin Genet, 2012, 81(6): 503-510

[183]Fan Z, Greenwood R, Felix AC, et al. GCH1 heterozygous mutation identified by whole-exome sequencing as a treatable condition in a patient presenting with progressive spastic paraplegia. J Neurol, 2014, 261(3): 622-624

[184]Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, et al. Making a definitive diagnosis: successful clinical application of whole exome sequencing in a child with intractable inflammatory bowel disease. Genet Med, 2011, 13(3): 255-262

[185]Iglesias A, Anyane-Yeboa K, Wynn J, et al. The usefulness of whole-exome sequencing in routine clinical practice. Genet Med, 2014, 16(12): 922-931

[186]Pop M, Salzberg SL. Bioinformatics challenges of new sequencing technology. Trends Genet,2008, 24(3): 142-149

[187]Acinas SG, Sarma-Rupavtarm R, Klepac-Ceraj V, et al. PCR-induced sequence artifacts and bias: insights from comparison of two 16S rRNA clone libraries constructed from the same sample. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(12): 8966-8969

(本文編輯：張崇凡)

復旦大學附屬兒科醫(yī)院2015年國家級繼續(xù)醫(yī)學教育項目(二)

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.002

上海市衛(wèi)生局重要疾病攻關項目:2013ZYJB0015；上海市科委/醫(yī)學領域重點項目子課題：14411950402,14DJ1400103；上海市衛(wèi)計委項目：滬衛(wèi)計科教〔2013〕018號

1 復旦大學附屬兒科醫(yī)院 上海，201102；2 上海市出生缺陷防治重點實驗室，復旦大學兒童發(fā)育與疾病轉化醫(yī)學研究中心，衛(wèi)生部新生兒疾病重點實驗室，復旦大學附屬兒科醫(yī)院上海，201102；3 復旦大學生物醫(yī)學研究院上海，200032；4 共同第一作者

周文浩，E-mail：zwhchfu@126.com

2014-12-17

2015-01-20)