兒童原發(fā)性腎病綜合征腎組織CD2AP表達(dá)與足細(xì)胞損傷相關(guān)性的初步探討

郝 勝 吳 瀅 康郁林 陳詠琪 黃文彥 何威遜 朱光華

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·論著·

兒童原發(fā)性腎病綜合征腎組織CD2AP表達(dá)與足細(xì)胞損傷相關(guān)性的初步探討

郝 勝 吳 瀅 康郁林 陳詠琪 黃文彥 何威遜 朱光華

目的 觀察原發(fā)性腎病綜合征(PNS)患兒腎組織CD2AP蛋白和mRNA的表達(dá)，探討其與足細(xì)胞損傷的關(guān)系。方法 以2012年1月至2013年6月上海市兒童醫(yī)院收治的PNS且行腎活檢的病例為PNS組，以同期我院行泌尿系統(tǒng)腫瘤切除患兒為對(duì)照組，取遠(yuǎn)離腫瘤并病理確認(rèn)為正常腎組織。PNS組和對(duì)照組均行常規(guī)切片染色，光鏡觀察腎臟組織病理改變，電鏡觀察足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化，分別采用qPCR和免疫組化測(cè)定腎組織CD2APmRNA和蛋白的表達(dá)。PNS組CD2APmRNA表達(dá)與血清白蛋白(ALB)、SCr、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、補(bǔ)體C3、24 h尿蛋白定量和腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)行相關(guān)性分析。結(jié)果 PNS組18例、對(duì)照組11例進(jìn)入分析，兩組性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。①PNS組腎組織CD2AP蛋白的表達(dá)較對(duì)照組降低，(1.302±0.885)vs(2.24±1.18),P<0.05，且病理表現(xiàn)為局灶節(jié)段性硬化(FSGS)的PNS患兒CD2AP蛋白表達(dá)最低。②PNS組腎組織CD2APmRNA的表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)，(0.008 58±0.006 12)vs(0.019±0.012),P<0.05。 ③PNS組腎組織CD2APmRNA表達(dá)與血清TG(r=-0.527，P<0.05)、24 h尿蛋白定量(r=-0.602，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，與腎組織CD2AP的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.788，P<0.01)，而與血清Alb、TC、補(bǔ)體C3、GFR和SCr無(wú)顯著相關(guān)性。結(jié)論 PNS患兒腎小球足細(xì)胞中CD2AP的蛋白和mRNA表達(dá)降低，特別是病理表現(xiàn)為FSGS的患兒，可能對(duì)足細(xì)胞病變的診斷有一定幫助。CD2AP的表達(dá)量可能與PNS臨床指標(biāo)相關(guān)。

CD2AP； 腎病綜合征； 足細(xì)胞； 兒童

原發(fā)性腎病綜合征(PNS)是兒童時(shí)期常見的腎小球疾病，其發(fā)病機(jī)制和蛋白尿形成原因仍不清楚，大量蛋白尿是腎病綜合征(NS)的主要特點(diǎn)，由腎小球?yàn)V過(guò)膜對(duì)血漿蛋白的通透性增高所致，足細(xì)胞在維持腎小球結(jié)構(gòu)和功能中起到了重要的作用[1]，其胞體、足突構(gòu)成了腎小球?yàn)V過(guò)屏障的最外層，上皮細(xì)胞足突間的裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)與蛋白尿產(chǎn)生相關(guān)，近年發(fā)現(xiàn)的CD2AP是SD結(jié)構(gòu)的組成部分之一，其確切臨床意義并不清楚。PNS患兒關(guān)于腎組織CD2AP表達(dá)的研究較少，且多為動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，邢燕等[2]在阿霉素腎病大鼠中發(fā)現(xiàn) nephrin、CD2APmRNA和蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組增高，史秀巖等[3]在成人NS患者研究中卻出現(xiàn)相反的結(jié)果，可能是由于動(dòng)物模型與人體NS的發(fā)病機(jī)制不同所致。本研究通過(guò)檢測(cè)PNS患兒CD2AP在腎組織的表達(dá)，探討其與腎小球足細(xì)胞損傷的相關(guān)性制，為兒童PNS的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 PNS組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) ①2012年1月至2013年6月入住上海市兒童醫(yī)院(我院)確診為PNS的患兒，PNS符合2009年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]；②行腎活檢的病例。排除腎活檢剩余組織較少或提取RNA量不足無(wú)法完成CD2AP表達(dá)檢測(cè)的病例。

1.2 對(duì)照組 同期我院行泌尿系統(tǒng)腫瘤切除患兒為對(duì)照組，取遠(yuǎn)離腫瘤并病理確認(rèn)為正常的腎組織。

1.3 知情同意和倫理 本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。PNS組和對(duì)照組患兒父母被告知研究目的和意義，并簽署知情同意書。

1.4 腎組織活檢 腎組織石蠟切片行蘇木精-伊紅(HE)、PAS、PASM和Masson三色染色，光鏡下觀察腎組織病理改變；免疫病理采用冷凍切片直接免疫熒光標(biāo)記；電鏡組織經(jīng)2.5%戊二醛液和鋨酸4℃固定、乙醇梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋、切片厚度60 nm、醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡(日立公司的H600型透射電子顯微鏡)下觀察。

1.5CD2AP表達(dá)檢測(cè)

1.5.1 腎組織CD2AP蛋白表達(dá) 腎組織4 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟，甲醇中用3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min，微波抗原修復(fù)10 min，1%BSA室溫封閉1 h。滴加一抗兔抗人CD2AP抗體(Santa Cruz，MA，1∶100)，4℃孵育過(guò)夜。PBS漂洗3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(Pierce，美國(guó))37℃孵育30 min。PBS漂洗3次，顯微鏡下DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。用同等濃度的兔血清IgG(Pierce，美國(guó))染色作為陰性對(duì)照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)每例患兒切片中至少 3 個(gè)完整的腎小球視野攝像保存(每張切片在200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取)，選取圖片上具有染色調(diào)的區(qū)域(AOI)，CD2AP為胞漿著色，呈棕黃色或棕褐色。測(cè)定選定區(qū)域的面積和積分光密度(IOD)，計(jì)算平均吸光度(IOD/area)，為腎小球CD2AP蛋白表達(dá)量。

1.5.2 實(shí)時(shí)定量PCT檢測(cè)(qPCR)檢測(cè)CD2APmRNA表達(dá) 腎活檢組織用Trizol法提取總RNA，取1 μg RNA進(jìn)入反轉(zhuǎn)錄體系，合成cDNA，其后參照SYBR Green qPCR SuperMix反應(yīng)試劑盒(Invitrogen公司)說(shuō)明書進(jìn)行qPCR，定量PCR儀為ABI PRISM?7500 Sequence Detection System。β-actin、CD2AP引物由上海銳金生物醫(yī)藥科技有限公司合成；β-actin引物序列：上游5′-ACTTAGTTGCGTT-ACACCCTTTCTTG-3′，下游5′-CCTTGCCACTTCCACTGTCG-TCA-3′ ；CD2AP引物序列：上游5′-CTAAATGGGAGAAGA-GGA-3′，下游5′-TAGGTGCTTATTCGTTGT-3′；以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的基因Ct值作為其相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 截取病史中與PNS相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，包括血清白蛋白(ALB)、肌酐(SCr)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、24 h尿蛋白定量(UP)(采用日立7060全自動(dòng)生化儀)；補(bǔ)體C3(采用德靈全自動(dòng)分析儀)，并根據(jù)Schwatz公式計(jì)算出各患兒的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 PNS組納入18例，男12例，女6例，年齡(6.3±3.7)歲，行腎活檢時(shí)病程為(8.3±6.7)個(gè)月；微小病變(MCD)12例，局灶節(jié)段硬化(FSGS) 4例，系膜增生(MsPGN)2例；激素敏感14例(其中激素依賴10例)，激素耐藥4例。對(duì)照組11例進(jìn)入分析，男7例，女4例，年齡(6.6±3.1)歲。兩組在性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 腎組織CD2AP蛋白表達(dá) PNS組腎小球CD2AP的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(0.008 58±0.006 12)vs(0.019±0.012),P=0.27;不同病理類型PNS患兒腎組織CD2AP蛋白表達(dá)如圖1所示，F(xiàn)SGS、MCD和MsPGN患兒CD2AP蛋白表達(dá)分別為(0.002 4±0.000 9)、(0.011±0.006)和(0.008±0.001)，F(xiàn)SGS患兒CD2AP蛋白表達(dá)最低。激素敏感、激素耐藥患兒腎組織CD2AP蛋白表達(dá)分別為(0.009 7±0.063)和(0.004 5±0.003 2)，激素敏感有高于激素耐藥患兒的傾向。

qPCR結(jié)果顯示，PNS組腎組織CD2APmRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組下降，(1.30±0.88)vs(2.24±1.18),P=0.20，F(xiàn)SGS、MCD和MsPGN患兒CD2APmRNA表達(dá)分別為(0.55±0.18)、(1.58±0.95)和(1.16±0.24)。激素敏感、激素耐藥患兒CD2APmRNA表達(dá)分別為(1.44±0.95)和(0.82±0.35)。

圖1 原發(fā)性腎病綜合征組和對(duì)照組腎組織CD2AP免疫組織化學(xué)染色(×200)

Fig 1 The CD2AP immunohistochemistry findings of renal tissue in primary nephrotic syndrome and control groups(×200)

Notes A: Obvious expression on glomerular capillary loop and several podocytes in normal renal tissue; B: Decreased expression in MCD patients; C: Decreased expression and tablet-like deficit

2.3CD2APmRNA表達(dá)與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析 表1顯示，PNS組腎組織CD2APmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別與血清TG(r=-0.527，P<0.05)、24 h尿蛋白定量(r=-0.602，P<0.01)呈負(fù)相關(guān)，與腎組織CD2AP的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.788，P<0.01)，而與血清ALB、TC、補(bǔ)體C3、GFR、SCr之間的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

LaboatrayindexesValuerPAlb/g·L-123．9±9．70．4130．088TG/mmol·L-12．96±1．90-0．5270．024TC/mmol·L-110．26±4．62-0．3770．123Cr/μmol·L-139．7±8．1-0．1220．630GFR/mL·min-1·1．73m-2141．6±10．80．3230．191C3/g·L-11．19±0．31-0．03620．88724hprotein/mg·kg-1103．5±80．9-0．6020．008CD2APproteinexpression0．00858±0．006120．7880．0001

3 討論

目前研究證實(shí)，足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致大量蛋白尿以及腎小球硬化的原因[5,6]，而兒童PNS的病理類型大部分為MCD及FSGS等足細(xì)胞病變。足細(xì)胞主要通過(guò)SD發(fā)揮其濾過(guò)屏障的功能，足突收縮融合甚至足細(xì)胞缺失可導(dǎo)致形成SD結(jié)構(gòu)的足突數(shù)量下降和功能異常，從而導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生，本文PNS組18例患兒足細(xì)胞病變?yōu)?6例(MCD 12例，F(xiàn)SGS 4例)，電鏡均有典型足細(xì)胞損傷表現(xiàn)，即彌漫足突融合、消失。

近年已發(fā)現(xiàn)nephrin、CD2AP、α-actinin-4、synaptopodin、TRPC6和Dystroglycans等眾多足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子與蛋白尿發(fā)生都有著密切關(guān)系[7～10]。CD2AP屬于免疫球蛋白超家族，人CD2AP基因位于染色體6p12，編碼區(qū)有1 920 bp，17個(gè)外顯子，蛋白質(zhì)序列有639個(gè)氨基酸，分子量為80 kD，其編碼的CD2AP為足細(xì)胞SD蛋白，是一種跨膜蛋白，其N端與nephrin等骨架蛋白分子相連接，C端直接與足細(xì)胞足突骨架肌動(dòng)蛋白絲相連，提示Nephrin、Podocin可能是通過(guò)CD2AP與足細(xì)胞細(xì)胞骨架發(fā)生聯(lián)系，維持足細(xì)胞及SD的正常形態(tài)及功能。

本研究發(fā)現(xiàn)， PNS患兒CD2AP在腎組織中mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，在FSGS患兒中尤為明顯，與成人NS的相關(guān)研究報(bào)道一致[3]，說(shuō)明CD2AP表達(dá)減少和消失可能會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞及其SD的完整性受損，從而參與蛋白尿以及腎小球節(jié)段硬化的形成，但FSGS患兒的腎組織免疫組化僅表現(xiàn)為表達(dá)量下降，并未出現(xiàn)明顯局部節(jié)段性表達(dá)濃度增高，可能由于本研究病例數(shù)較少、患兒發(fā)病年齡小等因素有關(guān)，值得進(jìn)一步探討。本研究還發(fā)現(xiàn)，PNS組腎組織CD2AP蛋白和mRNA水平呈一致性下降，提示其造成足細(xì)胞損傷機(jī)制可能并不僅是由于足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性變化，可能導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)通路異常，從而造成足細(xì)胞凋亡[11]。

正常情況下CD2AP分子均勻分布于足細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞漿及細(xì)胞膜。本研究可見正常腎組織中CD2AP蛋白在腎小球毛細(xì)血管袢和個(gè)別足細(xì)胞上呈明顯的陽(yáng)性表達(dá)，而在PNS患兒腎小球中出現(xiàn)分布不均勻甚至呈片狀缺失，表達(dá)水平明顯降低(與mRNA水平一致)，推測(cè)CD2AP分布沒有在SD上正確定位，足細(xì)胞之間以及其余細(xì)胞骨架之間的正常連接被打亂，致使SD結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生紊亂并失去屏障功能，最終導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。而電鏡中呈現(xiàn)MCD和FSGS等的典型足細(xì)胞病變(彌漫足突融合、消失)，也提示CD2AP低表達(dá)可能參與了足細(xì)胞病變?yōu)橹鞯腜NS發(fā)病。

有研究顯示激素耐藥NS及FSGS可能存在CD2AP基因突變[12,13]，本研究顯示PNS患兒CD2AP在蛋白水平和mRNA水平上降低，提示在基因水平上也可能存在異常，本課題組在前期研究中[14]發(fā)現(xiàn)CD2AP基因的啟動(dòng)子有突變序列，但本文18例PNS患兒的CD2AP基因外顯子檢測(cè)卻未發(fā)現(xiàn)突變(另文發(fā)表)，提示本文患兒CD2AP蛋白和mRNA水平的降低可能與基因轉(zhuǎn)錄等調(diào)控水平上異常有關(guān)。既往研究認(rèn)為激素通過(guò)抗炎和免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗蛋白尿效應(yīng)[15]，晚近研究表明足細(xì)胞中存在糖皮質(zhì)激素的功能受體，提示糖皮質(zhì)激素可能直接作用于足細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)，但具體機(jī)制未明，本文激素敏感患兒CD2AP蛋白和mRNA表達(dá)有高于激素耐藥的傾向。

PNS的臨床特點(diǎn)除了大量蛋白尿外，還有低蛋白血癥、高脂血癥(高膽固醇血癥)和不同程度的水腫，是PNS的發(fā)生、緩解和復(fù)發(fā)的判斷依據(jù)，也是足細(xì)胞受損后所產(chǎn)生的相應(yīng)表現(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)CD2APmRNA的表達(dá)與血清TG和24 h蛋白尿定量呈負(fù)相關(guān)，可能是足細(xì)胞損傷程度與大量蛋白尿相關(guān)，在此狀態(tài)下CD2AP表達(dá)下調(diào)程度亦有不同，而目前認(rèn)為血清TG的升高也與大量蛋白尿密切相關(guān)，但本研究例數(shù)較少，是否存在明確的相關(guān)性有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。

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(本文編輯：丁俊杰)

中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)兒童重癥醫(yī)師分會(huì)成立大會(huì)暨第一次全國(guó)兒童重癥醫(yī)師大會(huì)征文通知

經(jīng)中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)會(huì)員部批準(zhǔn)，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)兒童重癥醫(yī)師分會(huì)成立大會(huì)暨第一次全國(guó)兒童重癥醫(yī)師大會(huì)定于2015年4月16～18日在北京召開。本次會(huì)議內(nèi)容如下：①中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)兒童重癥醫(yī)師分會(huì)成立大會(huì)儀式。宣布：中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)《關(guān)于同意中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)兒童重癥醫(yī)師分會(huì)成立的批復(fù)》、中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)兒童重癥醫(yī)師分會(huì)人員組成及頒發(fā)聘書。②以“新起點(diǎn)、新使命” 為主題，就中國(guó)兒童重癥醫(yī)學(xué)科(PCCM)規(guī)范建設(shè)和科學(xué)技術(shù)等主題，進(jìn)行專題報(bào)告、大會(huì)發(fā)言、分會(huì)場(chǎng)交流和熱點(diǎn)問(wèn)題討論。

本文會(huì)議征文要求如下：①兒童重癥醫(yī)學(xué)科規(guī)范建設(shè)和科學(xué)技術(shù)相關(guān)的論文，且未在全國(guó)性學(xué)術(shù)會(huì)議或刊物上發(fā)表；②來(lái)稿請(qǐng)按照文題、作者姓名、單位、通訊地址、郵編、聯(lián)系電話及E-mail、摘要和正文順序撰寫，其中摘要要求500～800字，包括目的、方法、結(jié)果和結(jié)論4要素；③本次會(huì)議不接收紙質(zhì)投稿，請(qǐng)將稿件投送至cpia2014@163.com；④截稿日期：2015年3月15日。

本次會(huì)議聯(lián)系方式：聯(lián)系人：洪小楊(手機(jī)13311057633)，張倩(手機(jī)1860128286)，聯(lián)系電話：010-66721033，傳真：010-66721033。

Preliminary discussion on the correlation between podocytes injury and CD2AP expression in children with primary nephrotic syndrome

HAOSheng,WUYing,KANGYu-lin,CHENYong-qi,HUANGWen-yan,HEWei-xun,ZHUGuang-hua(DepartmentofNephrology,ShanghaiChildren′sHospital,Children′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200040,China)

ZHU Guang-hua，E-mail: ghzhu301@aliyun.com

ObjectiveTo observe theCD2APexpression in renal tissue of children with primary nephrotic syndrome(PNS), and to discuss the association between the expression ofCD2APand podocytes injury．MethodsChildren with PNS after renal biopsy in Shanghai Children′s Hospital from Jan. 2012 to Jun. 2013 were enrolled as PNS group, patients with renal tumor undergone nephrectomy were recruited as control group. Renal pathological change was observed by conventional optical microscopes. Structure of podocyte was observed by electron microscopy. The renalCD2APmRNA and protein were examined by quantitive real time PCR and immunohistochemistry. Then serum albumin(Alb),creatinine(Cr),complement 3(C3),triglyeride(TG),cholesterol(TC),glomerular filtration rate(GFR)and 24-hours proteinuria were detected, simultaneously the relationship between these index and theCD2APexpression was analyzed.ResultsEighteen patients were enrolled as PNS group and 11 patients were enrolled as control group. ①Compared to the controls, the expression ofCD2APmRNA decreased significantly in patients with PNS(0.008 58±0.006 12vs0.019±0.012,P<0.05). ②Compared to the control group, protein expression decreased significantly in PNS group, (1.302±0.885)vs(2.24±1.18),P<0.05, and children with PNS were the lowest. ③In PNS group, there was moderate correlation betweenCD2APmRNA relative expression and TG(r=-0.527，P<0.05), 24 h proteinuria(r=-0.602，P<0.01), there was strong positive correlation betweenCD2APmRNA and protein expressions (r=0.788,P<0.01). The relationship betweenCD2APrelative expression and those index such as complement C3, GFR, Cr and TC had no statistic significance. ConclusionThe expression ofCD2APin podocyte of PNS cases decreased significantly, especially in those with FSGS. And this change may be correlated with clinical indexes of patients with PNS.

CD2AP; Nephrotic syndrome; Podocyte; Children

上海市衛(wèi)生局級(jí)青年課題：2009Y048;上海市衛(wèi)生局級(jí)課題：2009094

上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，腎臟風(fēng)濕科 上海，200040

朱光華，E-mail:ghzhu301@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.013

2014-09-20

2014-12-02)