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    太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析

    2015-04-02 05:55:31吉挺沈芳孟祥金王帥李文明
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:遺傳多樣性

    吉挺 沈芳 孟祥金 王帥 李文明

    摘要:利用篩選后的2對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物,研究太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中華蜜蜂(以下簡(jiǎn)稱(chēng)中蜂)間的遺傳多樣性并分析其遺傳分化。研究檢測(cè)判定了60個(gè)中蜂個(gè)體的基因型,計(jì)算2個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)等位基因頻率(i)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(IC)、群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis),并分析中蜂群體內(nèi)與群體間的遺傳變異,采取配對(duì)試驗(yàn)均數(shù)差異t檢驗(yàn)比較太湖中蜂與皖南中蜂群體的遺傳差異。結(jié)果表明,太湖地區(qū)與皖南山區(qū)2個(gè)中蜂群體間的i、He、IC、Fis差異均不顯著(i=0356>005,He=039>005,IC=0260>005,F(xiàn)is=0428>005)??梢?jiàn),太湖地區(qū)與皖南地區(qū)兩地中蜂群體存在一定的遺傳多樣性,但遺傳分化程度不大。本研究結(jié)果對(duì)江蘇與安徽兩地中華蜜蜂品種的選育和保護(hù)也具有一定的指導(dǎo)意義。

    關(guān)鍵詞:太湖地區(qū);皖南地區(qū);中華蜜蜂;微衛(wèi)星DNA標(biāo)記;遺傳多樣性

    中圖分類(lèi)號(hào): S898文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A[HK]

    文章編號(hào):002-302(204)2-002-05

    中華蜜蜂(Apis cerana cerana)簡(jiǎn)稱(chēng)中蜂,指分布于我國(guó)境內(nèi)東方蜜蜂地理亞種的總稱(chēng),是我國(guó)特有的遺傳資源,家養(yǎng)歷史悠久,2006年被列入國(guó)家畜禽保護(hù)名錄中。江蘇省自古是我國(guó)野生中蜂的聚居區(qū),也是最早引入新法飼養(yǎng)的地區(qū)之一[2]。近幾十年來(lái),由于西方蜜蜂大量引入及自然條件的破壞,江蘇省中蜂遺傳資源已消失迨盡,目前僅在環(huán)太湖地區(qū)略有分布,種質(zhì)資源保護(hù)迫在眉睫[3]。同時(shí),隨著近幾年環(huán)太湖地區(qū)設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展,蜜蜂授粉尤其是中蜂授粉的需求越來(lái)越多,現(xiàn)有的中蜂資源已不能滿(mǎn)足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。皖南地區(qū)地形復(fù)雜,植被豐富,適宜中蜂棲息,中蜂資源十分豐富[4],而且皖南地區(qū)與太湖地區(qū)相隔較近,沒(méi)有任何地理隔離,所以從皖南地區(qū)引入蜂群可能是解決太湖地區(qū)中蜂資源缺乏的有效方法。但是引入后是否會(huì)改變太湖地區(qū)原有中蜂的遺傳結(jié)構(gòu),繼而對(duì)當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源保護(hù)造成負(fù)面影響是應(yīng)該考慮的首要問(wèn)題,所以需要對(duì)2個(gè)地區(qū)現(xiàn)有中蜂資源的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性進(jìn)行比較分析。

    微衛(wèi)星是目前普遍使用的分子遺傳標(biāo)記,具有多態(tài)性好、共顯性、易于鑒定、檢測(cè)重復(fù)性好、在基因組分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)在其持續(xù)發(fā)展和管理動(dòng)物遺傳資源的戰(zhàn)略計(jì)劃中,推薦將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先考慮的分析工具[5-6]。近幾年來(lái),微衛(wèi)星標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于我國(guó)各地蜜蜂種質(zhì)資源的分析中,但是目前普遍采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法,不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力效率低,而且誤差較大[7-9]。本研究利用篩選后的2對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物對(duì)太湖地區(qū)與皖南地區(qū)的中蜂進(jìn)行遺傳多樣性比較和遺傳分化分析,旨在初步評(píng)價(jià)2個(gè)地區(qū)中蜂群體遺傳結(jié)構(gòu)的差異,繼而探討江蘇省太湖地區(qū)異地引入蜂群的可能性。

    材料與方法

    試驗(yàn)材料

    太湖地區(qū)中蜂(DS)來(lái)自于江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn),皖南山區(qū)中蜂(X)來(lái)自于安徽省宣城市涇縣山區(qū),每個(gè)地區(qū)各隨機(jī)選取30群,蜂群盡量以野生種群為主,每群隨機(jī)采集成年工蜂0只,用無(wú)水乙醇溶液浸泡保存。中蜂群體的采集信息見(jiàn)表。

    參照吉挺所建立的方法[0]提取中蜂基因組DNA,用微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)(NanoDrop ND-000)測(cè)定其含量與純度,-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

    2微衛(wèi)星引物的篩選及CR條件的優(yōu)化

    根據(jù)筆者所在課題組對(duì)中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果所獲得的3 000多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選,每條染色體選擇2~3對(duì)微衛(wèi)星引物,共初步選取54對(duì)微衛(wèi)星引物,送往上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)GenBank和相應(yīng)文獻(xiàn)提供的微衛(wèi)星引物對(duì)所選54對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步篩選出 30對(duì)擴(kuò)增效果較好的微衛(wèi)星引物,具體所選微衛(wèi)星引物信息見(jiàn)表2。

    由于CR反應(yīng)中影響因素較多,試驗(yàn)分別設(shè)計(jì)了以DNA模板濃度、Mg2濃度、Taq酶用量、退火溫度為因素的梯度試驗(yàn),最終確定CR的反應(yīng)體系:0×Buffer 20 μL,25 mmol/L MgCl2 0 μL,0 mmol/L dNTs 05 μL,0 pmol/μL 上游引物 0 μL,0 pmol/μL 下游引物 0 μL,5 U/μL Taq DNA聚

    配制3%瓊脂糖凝膠,點(diǎn)樣6 μL,20 V電泳20 min,檢查產(chǎn)物的有無(wú)。如有產(chǎn)物,配制8%聚丙烯酰胺凝膠80 mL體系,00 V預(yù)電泳5 min,點(diǎn)樣0 μL,20 V電泳3 h。進(jìn)行硝酸銀染色,直至出現(xiàn)清晰的等位基因條帶。

    4熒光引物的篩選和組合

    根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果,盡量選擇不同染色體上的標(biāo)記,淘汰掉無(wú)法擴(kuò)增以及無(wú)多態(tài)性的引物,最終選出相對(duì)較理想的2對(duì)多態(tài)性較豐富的微衛(wèi)星引物:7-CL278Contig()、5-CL4Contig(γ)、39-CL308Contig6(X)、7-CL462Contig5(S)、8-CL470Contig3(T)、37-CL293Contig(W)、29-CL229Contig33(K)、28-CL650Contig3(B)、33-CL360Contig4(L)、-CL229Contig27(M)、4-CL549Contig3(R)、-CL33Contig4(Q)。每對(duì)引物的上游 5′ 端分別用熒光染料FAM(藍(lán)色)、HEX(綠色)、TAMRA(黃色)進(jìn)行標(biāo)記,獲得的熒光標(biāo)記引物避光保存。按照微衛(wèi)星引物的堿基長(zhǎng)度進(jìn)行組合,為了便于區(qū)分得精確一些,組合的引物長(zhǎng)度至少相差 20 bp,獲得的5個(gè)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物組合信息見(jiàn)表3。

    CR熒光產(chǎn)物STR分型送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行,使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)。上樣的總體積為35 μL,其中的上樣液Hi-Di Formamide 0 μL、GS-500 Size Standard 05 μL,另外的3 μL為混合CR產(chǎn)物。將Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard 混合均勻后與等量的同一個(gè)體的CR產(chǎn)物進(jìn)行混合,然后進(jìn)行個(gè)體編號(hào),依次加樣到96孔板中,接著變性和檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束后,使用GeneMapper 40軟件自動(dòng)生成獨(dú)立的圖譜文件,讀取片段長(zhǎng)度、峰值和峰面積,判斷純合子和雜合子(單峰為純合子,雙峰為雜合子),最后導(dǎo)出Excel數(shù)據(jù)表格。endprint

    6遺傳多樣性分析公式

    6等位基因頻率

    [Z]i=(2niinijnij2…nijn)/(2N)。

    其中:i為第i個(gè)等位基因頻率;nii為第i個(gè)等位基因純合個(gè)數(shù);jn為與i共顯的第n個(gè)等位基因;nij為含i與jn共顯的等位基因個(gè)體數(shù);N為群體中個(gè)體數(shù)。

    62雜合度

    [Z]He=-∑[DD(]ki=-[DD)]2i。

    其中:k為等位基因數(shù);i為第i個(gè)等位基因頻率。

    63多態(tài)信息含量

    [Z]IC=-∑[DD(]ki=[DD)]2i-∑[DD(]k-i=[DD)]∑[DD(]kj=i[DD)]22i2j=2∑[DD(]k-i=[DD)]∑[DD(]kj=i[DD)]ij(-ij)。

    其中:k為等位基因數(shù);i為第i個(gè)等位基因頻率;j為第j個(gè)等位基因頻率。

    64群體內(nèi)近交系數(shù)

    [Z]Fis=(Hs-Ho)/Hs。

    其中:Ho為觀察雜合度;Hs為平均期望雜合度。

    65統(tǒng)計(jì)分析

    利用Microsatellite-Toolkit軟件根據(jù)GeneMapper 40軟件導(dǎo)出的Excel表格來(lái)計(jì)算等位基因頻率與期望雜合度,根據(jù)Botestein等的公式設(shè)計(jì)、計(jì)算群體的多態(tài)信息含量,再根據(jù)FSTAT程序計(jì)算群體內(nèi)近交系數(shù)。

    2結(jié)果與分析

    2DNA提取結(jié)果

    DNA提取出來(lái)以后,將其稀釋到00 ng/μL,部分瓊脂糖凝膠用紫外透視成像系統(tǒng)檢測(cè),其結(jié)果如圖所示:純度比較高,無(wú)拖尾現(xiàn)象。

    [FK(W0][TTtif][FK)]

    22熒光產(chǎn)物STR分型結(jié)果

    使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)掃板,得到的部分微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增結(jié)果與STR分型結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2所示的是太湖地區(qū)中蜂DS0個(gè)體在B位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果,基因型為32/34(雜合子);皖南山區(qū)中蜂X03個(gè)體在T位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果,基因型為32/32(純合子)。

    23太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂優(yōu)勢(shì)等位基因的比較

    由表4可見(jiàn),利用配對(duì)試驗(yàn)均數(shù)差異雙尾t檢驗(yàn)對(duì)2個(gè)群體優(yōu)勢(shì)等位基因頻率進(jìn)行處理,結(jié)果i=0356>005,即太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中蜂群體在這2對(duì)微衛(wèi)星引物標(biāo)記上檢測(cè)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)等位基因差異不顯著。

    24群體間相關(guān)參數(shù)分析

    由表5可知,太湖地區(qū)中蜂群體的He、IC、Fis平均為055、059、0053,均略高于皖南山區(qū)中蜂群體(0473、0423、025)。對(duì)2個(gè)群體的He、IC、Fis進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果顯示,2個(gè)群體的3個(gè)參數(shù)差異均不顯著([HT5”]He=039、IC=0260、Fis=0428)。

    3結(jié)論與討論

    從2006年開(kāi)始,陸續(xù)有研究者利用西方蜜蜂微衛(wèi)星標(biāo)記

    對(duì)我國(guó)中蜂遺傳資源及遺傳多樣性進(jìn)行分析,但普遍方法是在CR擴(kuò)增后采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法,通過(guò)人為觀察主觀地對(duì)多態(tài)性條帶進(jìn)行分析,這種方法最令人質(zhì)疑的在于很難將相鄰近的2個(gè)條帶準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)來(lái),從而造成判型誤差[7-8]。目前利用熒光引物擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的分辨率和靈敏度,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在單堿基水平和表達(dá)量方面也具有較高的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)利用ABI基因測(cè)序分析儀對(duì)熒光標(biāo)記DNA片段進(jìn)行檢測(cè),并利用分子量?jī)?nèi)標(biāo)對(duì)DNA片段長(zhǎng)度進(jìn)行計(jì)算,使2個(gè)地區(qū)的中蜂STR分型方法較傳統(tǒng)方法更精確,更能真實(shí)反映2個(gè)群體內(nèi)的遺傳多樣性及群體間的遺傳分化。

    本研究在筆者所在課題組對(duì)中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果所獲得的 3 000 多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)基礎(chǔ)上篩選出2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),盡量保證其在多條染色體或連鎖群中都有分布,因此得出的數(shù)據(jù)有一定的代表性和可比性。群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的等位基因,其余等位基因是進(jìn)化[CM(25]過(guò)程中由該等位基因突變形成的,因此微衛(wèi)星的多態(tài)性能

    2K2]夠反映物種的進(jìn)化歷史[2]。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)等位基因頻率間存在差異,但差異不顯著(i=0356>005),表明太湖地區(qū)中蜂群體(DS)與皖南地區(qū)(X)各自維持著一定的種質(zhì)特性,但兩者之間遺傳分化較小。這可能與這2個(gè)地區(qū)相隔距離較近、兩者基因流動(dòng)值較高有關(guān),表明從皖南山區(qū)引入部分中蜂蜂群,擴(kuò)大太湖地區(qū)中蜂種群數(shù)量,進(jìn)行蜂蜜生產(chǎn)與授粉,不會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)刂蟹溥z傳資源產(chǎn)生較大影響。

    多態(tài)信息含量是衡量基因片段多態(tài)性較好的指標(biāo),當(dāng)IC>05時(shí),該座位為高度多態(tài)性座位;當(dāng)025

    期望雜合度別稱(chēng)基因多樣度,是一個(gè)度量群體遺傳變異的最適參數(shù)[4]。本研究所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記中,、γ、T、R、Q、X、W等7個(gè)標(biāo)記有較高的多態(tài)性,群體遺傳多樣性豐富,具有較高的選擇潛力;而B(niǎo)標(biāo)記在2個(gè)群體間表現(xiàn)出完全不同的多態(tài)性,其在皖南山區(qū)中蜂群體中為純合子,而在太湖地區(qū)群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)(He=0875),今后可將其作為候選遺傳標(biāo)記區(qū)別2個(gè)地理群體。

    本研究通過(guò)對(duì)太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂群體進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè),對(duì)2個(gè)群體主要遺傳參數(shù)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,2個(gè)群體間的He、IC、Fis差異均不顯著,其中太湖地區(qū)中蜂群體的He、IC還略高于皖南山區(qū),表明太湖地區(qū)中蜂遺傳多樣性仍較豐富,這可能與太湖地區(qū)蜜源植物資源豐富,適宜中蜂生存,同時(shí)該地區(qū)與種群數(shù)量較多的浙北和皖南山區(qū)沒(méi)有明顯的地理隔離,造成相互基因流動(dòng)有一定的關(guān)系。這也說(shuō)明在分析中蜂群體遺傳多樣性時(shí),種群數(shù)量與其擁有的遺傳多樣性高低沒(méi)有直接聯(lián)系。

    綜上所述,本研究利用篩選后的2個(gè)微衛(wèi)星DNA熒光標(biāo)記分析了太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂群體的遺傳多樣性與群體間的差異,結(jié)果表明,2個(gè)地理群體遺傳多樣性均較豐富,具有較高的保種價(jià)值,且兩者間遺傳分化不明顯,完全可能從皖南地區(qū)引入中蜂蜂群擴(kuò)大太湖地區(qū)種群數(shù)量。

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