• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析

    2015-04-02 05:55:31吉挺沈芳孟祥金王帥李文明
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:遺傳多樣性

    吉挺 沈芳 孟祥金 王帥 李文明

    摘要:利用篩選后的2對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物,研究太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中華蜜蜂(以下簡(jiǎn)稱(chēng)中蜂)間的遺傳多樣性并分析其遺傳分化。研究檢測(cè)判定了60個(gè)中蜂個(gè)體的基因型,計(jì)算2個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)等位基因頻率(i)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(IC)、群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis),并分析中蜂群體內(nèi)與群體間的遺傳變異,采取配對(duì)試驗(yàn)均數(shù)差異t檢驗(yàn)比較太湖中蜂與皖南中蜂群體的遺傳差異。結(jié)果表明,太湖地區(qū)與皖南山區(qū)2個(gè)中蜂群體間的i、He、IC、Fis差異均不顯著(i=0356>005,He=039>005,IC=0260>005,F(xiàn)is=0428>005)??梢?jiàn),太湖地區(qū)與皖南地區(qū)兩地中蜂群體存在一定的遺傳多樣性,但遺傳分化程度不大。本研究結(jié)果對(duì)江蘇與安徽兩地中華蜜蜂品種的選育和保護(hù)也具有一定的指導(dǎo)意義。

    關(guān)鍵詞:太湖地區(qū);皖南地區(qū);中華蜜蜂;微衛(wèi)星DNA標(biāo)記;遺傳多樣性

    中圖分類(lèi)號(hào): S898文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A[HK]

    文章編號(hào):002-302(204)2-002-05

    中華蜜蜂(Apis cerana cerana)簡(jiǎn)稱(chēng)中蜂,指分布于我國(guó)境內(nèi)東方蜜蜂地理亞種的總稱(chēng),是我國(guó)特有的遺傳資源,家養(yǎng)歷史悠久,2006年被列入國(guó)家畜禽保護(hù)名錄中。江蘇省自古是我國(guó)野生中蜂的聚居區(qū),也是最早引入新法飼養(yǎng)的地區(qū)之一[2]。近幾十年來(lái),由于西方蜜蜂大量引入及自然條件的破壞,江蘇省中蜂遺傳資源已消失迨盡,目前僅在環(huán)太湖地區(qū)略有分布,種質(zhì)資源保護(hù)迫在眉睫[3]。同時(shí),隨著近幾年環(huán)太湖地區(qū)設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展,蜜蜂授粉尤其是中蜂授粉的需求越來(lái)越多,現(xiàn)有的中蜂資源已不能滿(mǎn)足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。皖南地區(qū)地形復(fù)雜,植被豐富,適宜中蜂棲息,中蜂資源十分豐富[4],而且皖南地區(qū)與太湖地區(qū)相隔較近,沒(méi)有任何地理隔離,所以從皖南地區(qū)引入蜂群可能是解決太湖地區(qū)中蜂資源缺乏的有效方法。但是引入后是否會(huì)改變太湖地區(qū)原有中蜂的遺傳結(jié)構(gòu),繼而對(duì)當(dāng)?shù)胤N質(zhì)資源保護(hù)造成負(fù)面影響是應(yīng)該考慮的首要問(wèn)題,所以需要對(duì)2個(gè)地區(qū)現(xiàn)有中蜂資源的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性進(jìn)行比較分析。

    微衛(wèi)星是目前普遍使用的分子遺傳標(biāo)記,具有多態(tài)性好、共顯性、易于鑒定、檢測(cè)重復(fù)性好、在基因組分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)在其持續(xù)發(fā)展和管理動(dòng)物遺傳資源的戰(zhàn)略計(jì)劃中,推薦將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先考慮的分析工具[5-6]。近幾年來(lái),微衛(wèi)星標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于我國(guó)各地蜜蜂種質(zhì)資源的分析中,但是目前普遍采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法,不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力效率低,而且誤差較大[7-9]。本研究利用篩選后的2對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物對(duì)太湖地區(qū)與皖南地區(qū)的中蜂進(jìn)行遺傳多樣性比較和遺傳分化分析,旨在初步評(píng)價(jià)2個(gè)地區(qū)中蜂群體遺傳結(jié)構(gòu)的差異,繼而探討江蘇省太湖地區(qū)異地引入蜂群的可能性。

    材料與方法

    試驗(yàn)材料

    太湖地區(qū)中蜂(DS)來(lái)自于江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn),皖南山區(qū)中蜂(X)來(lái)自于安徽省宣城市涇縣山區(qū),每個(gè)地區(qū)各隨機(jī)選取30群,蜂群盡量以野生種群為主,每群隨機(jī)采集成年工蜂0只,用無(wú)水乙醇溶液浸泡保存。中蜂群體的采集信息見(jiàn)表。

    參照吉挺所建立的方法[0]提取中蜂基因組DNA,用微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)(NanoDrop ND-000)測(cè)定其含量與純度,-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

    2微衛(wèi)星引物的篩選及CR條件的優(yōu)化

    根據(jù)筆者所在課題組對(duì)中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果所獲得的3 000多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選,每條染色體選擇2~3對(duì)微衛(wèi)星引物,共初步選取54對(duì)微衛(wèi)星引物,送往上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)GenBank和相應(yīng)文獻(xiàn)提供的微衛(wèi)星引物對(duì)所選54對(duì)引物進(jìn)行優(yōu)化,進(jìn)一步篩選出 30對(duì)擴(kuò)增效果較好的微衛(wèi)星引物,具體所選微衛(wèi)星引物信息見(jiàn)表2。

    由于CR反應(yīng)中影響因素較多,試驗(yàn)分別設(shè)計(jì)了以DNA模板濃度、Mg2濃度、Taq酶用量、退火溫度為因素的梯度試驗(yàn),最終確定CR的反應(yīng)體系:0×Buffer 20 μL,25 mmol/L MgCl2 0 μL,0 mmol/L dNTs 05 μL,0 pmol/μL 上游引物 0 μL,0 pmol/μL 下游引物 0 μL,5 U/μL Taq DNA聚

    配制3%瓊脂糖凝膠,點(diǎn)樣6 μL,20 V電泳20 min,檢查產(chǎn)物的有無(wú)。如有產(chǎn)物,配制8%聚丙烯酰胺凝膠80 mL體系,00 V預(yù)電泳5 min,點(diǎn)樣0 μL,20 V電泳3 h。進(jìn)行硝酸銀染色,直至出現(xiàn)清晰的等位基因條帶。

    4熒光引物的篩選和組合

    根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果,盡量選擇不同染色體上的標(biāo)記,淘汰掉無(wú)法擴(kuò)增以及無(wú)多態(tài)性的引物,最終選出相對(duì)較理想的2對(duì)多態(tài)性較豐富的微衛(wèi)星引物:7-CL278Contig()、5-CL4Contig(γ)、39-CL308Contig6(X)、7-CL462Contig5(S)、8-CL470Contig3(T)、37-CL293Contig(W)、29-CL229Contig33(K)、28-CL650Contig3(B)、33-CL360Contig4(L)、-CL229Contig27(M)、4-CL549Contig3(R)、-CL33Contig4(Q)。每對(duì)引物的上游 5′ 端分別用熒光染料FAM(藍(lán)色)、HEX(綠色)、TAMRA(黃色)進(jìn)行標(biāo)記,獲得的熒光標(biāo)記引物避光保存。按照微衛(wèi)星引物的堿基長(zhǎng)度進(jìn)行組合,為了便于區(qū)分得精確一些,組合的引物長(zhǎng)度至少相差 20 bp,獲得的5個(gè)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物組合信息見(jiàn)表3。

    CR熒光產(chǎn)物STR分型送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行,使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)。上樣的總體積為35 μL,其中的上樣液Hi-Di Formamide 0 μL、GS-500 Size Standard 05 μL,另外的3 μL為混合CR產(chǎn)物。將Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard 混合均勻后與等量的同一個(gè)體的CR產(chǎn)物進(jìn)行混合,然后進(jìn)行個(gè)體編號(hào),依次加樣到96孔板中,接著變性和檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束后,使用GeneMapper 40軟件自動(dòng)生成獨(dú)立的圖譜文件,讀取片段長(zhǎng)度、峰值和峰面積,判斷純合子和雜合子(單峰為純合子,雙峰為雜合子),最后導(dǎo)出Excel數(shù)據(jù)表格。endprint

    6遺傳多樣性分析公式

    6等位基因頻率

    [Z]i=(2niinijnij2…nijn)/(2N)。

    其中:i為第i個(gè)等位基因頻率;nii為第i個(gè)等位基因純合個(gè)數(shù);jn為與i共顯的第n個(gè)等位基因;nij為含i與jn共顯的等位基因個(gè)體數(shù);N為群體中個(gè)體數(shù)。

    62雜合度

    [Z]He=-∑[DD(]ki=-[DD)]2i。

    其中:k為等位基因數(shù);i為第i個(gè)等位基因頻率。

    63多態(tài)信息含量

    [Z]IC=-∑[DD(]ki=[DD)]2i-∑[DD(]k-i=[DD)]∑[DD(]kj=i[DD)]22i2j=2∑[DD(]k-i=[DD)]∑[DD(]kj=i[DD)]ij(-ij)。

    其中:k為等位基因數(shù);i為第i個(gè)等位基因頻率;j為第j個(gè)等位基因頻率。

    64群體內(nèi)近交系數(shù)

    [Z]Fis=(Hs-Ho)/Hs。

    其中:Ho為觀察雜合度;Hs為平均期望雜合度。

    65統(tǒng)計(jì)分析

    利用Microsatellite-Toolkit軟件根據(jù)GeneMapper 40軟件導(dǎo)出的Excel表格來(lái)計(jì)算等位基因頻率與期望雜合度,根據(jù)Botestein等的公式設(shè)計(jì)、計(jì)算群體的多態(tài)信息含量,再根據(jù)FSTAT程序計(jì)算群體內(nèi)近交系數(shù)。

    2結(jié)果與分析

    2DNA提取結(jié)果

    DNA提取出來(lái)以后,將其稀釋到00 ng/μL,部分瓊脂糖凝膠用紫外透視成像系統(tǒng)檢測(cè),其結(jié)果如圖所示:純度比較高,無(wú)拖尾現(xiàn)象。

    [FK(W0][TTtif][FK)]

    22熒光產(chǎn)物STR分型結(jié)果

    使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)掃板,得到的部分微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增結(jié)果與STR分型結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2所示的是太湖地區(qū)中蜂DS0個(gè)體在B位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果,基因型為32/34(雜合子);皖南山區(qū)中蜂X03個(gè)體在T位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果,基因型為32/32(純合子)。

    23太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂優(yōu)勢(shì)等位基因的比較

    由表4可見(jiàn),利用配對(duì)試驗(yàn)均數(shù)差異雙尾t檢驗(yàn)對(duì)2個(gè)群體優(yōu)勢(shì)等位基因頻率進(jìn)行處理,結(jié)果i=0356>005,即太湖地區(qū)與皖南地區(qū)中蜂群體在這2對(duì)微衛(wèi)星引物標(biāo)記上檢測(cè)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)等位基因差異不顯著。

    24群體間相關(guān)參數(shù)分析

    由表5可知,太湖地區(qū)中蜂群體的He、IC、Fis平均為055、059、0053,均略高于皖南山區(qū)中蜂群體(0473、0423、025)。對(duì)2個(gè)群體的He、IC、Fis進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果顯示,2個(gè)群體的3個(gè)參數(shù)差異均不顯著([HT5”]He=039、IC=0260、Fis=0428)。

    3結(jié)論與討論

    從2006年開(kāi)始,陸續(xù)有研究者利用西方蜜蜂微衛(wèi)星標(biāo)記

    對(duì)我國(guó)中蜂遺傳資源及遺傳多樣性進(jìn)行分析,但普遍方法是在CR擴(kuò)增后采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法,通過(guò)人為觀察主觀地對(duì)多態(tài)性條帶進(jìn)行分析,這種方法最令人質(zhì)疑的在于很難將相鄰近的2個(gè)條帶準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)來(lái),從而造成判型誤差[7-8]。目前利用熒光引物擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的分辨率和靈敏度,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物在單堿基水平和表達(dá)量方面也具有較高的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)利用ABI基因測(cè)序分析儀對(duì)熒光標(biāo)記DNA片段進(jìn)行檢測(cè),并利用分子量?jī)?nèi)標(biāo)對(duì)DNA片段長(zhǎng)度進(jìn)行計(jì)算,使2個(gè)地區(qū)的中蜂STR分型方法較傳統(tǒng)方法更精確,更能真實(shí)反映2個(gè)群體內(nèi)的遺傳多樣性及群體間的遺傳分化。

    本研究在筆者所在課題組對(duì)中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果所獲得的 3 000 多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)基礎(chǔ)上篩選出2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),盡量保證其在多條染色體或連鎖群中都有分布,因此得出的數(shù)據(jù)有一定的代表性和可比性。群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的等位基因,其余等位基因是進(jìn)化[CM(25]過(guò)程中由該等位基因突變形成的,因此微衛(wèi)星的多態(tài)性能

    2K2]夠反映物種的進(jìn)化歷史[2]。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)群體的優(yōu)勢(shì)等位基因頻率間存在差異,但差異不顯著(i=0356>005),表明太湖地區(qū)中蜂群體(DS)與皖南地區(qū)(X)各自維持著一定的種質(zhì)特性,但兩者之間遺傳分化較小。這可能與這2個(gè)地區(qū)相隔距離較近、兩者基因流動(dòng)值較高有關(guān),表明從皖南山區(qū)引入部分中蜂蜂群,擴(kuò)大太湖地區(qū)中蜂種群數(shù)量,進(jìn)行蜂蜜生產(chǎn)與授粉,不會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)刂蟹溥z傳資源產(chǎn)生較大影響。

    多態(tài)信息含量是衡量基因片段多態(tài)性較好的指標(biāo),當(dāng)IC>05時(shí),該座位為高度多態(tài)性座位;當(dāng)025

    期望雜合度別稱(chēng)基因多樣度,是一個(gè)度量群體遺傳變異的最適參數(shù)[4]。本研究所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記中,、γ、T、R、Q、X、W等7個(gè)標(biāo)記有較高的多態(tài)性,群體遺傳多樣性豐富,具有較高的選擇潛力;而B(niǎo)標(biāo)記在2個(gè)群體間表現(xiàn)出完全不同的多態(tài)性,其在皖南山區(qū)中蜂群體中為純合子,而在太湖地區(qū)群體中表現(xiàn)為高度多態(tài)(He=0875),今后可將其作為候選遺傳標(biāo)記區(qū)別2個(gè)地理群體。

    本研究通過(guò)對(duì)太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂群體進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè),對(duì)2個(gè)群體主要遺傳參數(shù)進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,2個(gè)群體間的He、IC、Fis差異均不顯著,其中太湖地區(qū)中蜂群體的He、IC還略高于皖南山區(qū),表明太湖地區(qū)中蜂遺傳多樣性仍較豐富,這可能與太湖地區(qū)蜜源植物資源豐富,適宜中蜂生存,同時(shí)該地區(qū)與種群數(shù)量較多的浙北和皖南山區(qū)沒(méi)有明顯的地理隔離,造成相互基因流動(dòng)有一定的關(guān)系。這也說(shuō)明在分析中蜂群體遺傳多樣性時(shí),種群數(shù)量與其擁有的遺傳多樣性高低沒(méi)有直接聯(lián)系。

    綜上所述,本研究利用篩選后的2個(gè)微衛(wèi)星DNA熒光標(biāo)記分析了太湖地區(qū)與皖南山區(qū)中蜂群體的遺傳多樣性與群體間的差異,結(jié)果表明,2個(gè)地理群體遺傳多樣性均較豐富,具有較高的保種價(jià)值,且兩者間遺傳分化不明顯,完全可能從皖南地區(qū)引入中蜂蜂群擴(kuò)大太湖地區(qū)種群數(shù)量。

    [HS23][HT85H]參考文獻(xiàn):[HT8SS]

    [ZK(#]國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)組 中國(guó)畜禽遺傳資源志——蜜蜂志[M] 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,20:2-20

    [2][2]吉挺,陳晶,殷靈,等 江蘇省野生及家養(yǎng)中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2007,34(2):39-4

    [3]何明 江蘇的中蜂資源亟待保護(hù) 蜜蜂雜志,2007,27(3):6

    [4]黃思思 皖南山區(qū)中華蜜蜂遺傳多樣性研究[D] 合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),20:-5

    [5]Crooijmans R ,Groen A F,van Kampen A ,et al Microsatellite polymorphism in commericial broiler and layers lines estimated using pooled blood samples oultry Science,996,7(7):904-909

    [6]Romanov M N,Weigend S Genetic diversity in chicken populations based on microsatellite markers[C]//roceedings of the Conference “From ay Lush to Genomics:Vidions for Animal Breeding and Genetics”999:7

    [7]徐新建,周姝婧,朱翔杰,等 海南島中華蜜蜂遺傳多樣性的微衛(wèi)星DNA分析 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),203,56(5):554-560

    [8]于瀛龍,周姝婧,徐新建,等 長(zhǎng)白山中華蜜蜂(Apis cerana cerana)遺傳多樣性分析 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,203,42(6):643-647

    [9]陳晶,陳國(guó)宏,吉挺,等 沂蒙山中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析 中國(guó)蜂業(yè),2008,59(4):-3[ZK)]

    [0][ZK(#]吉挺 中國(guó)東方蜜蜂資源遺傳多樣性分析[D] 揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2009:35-48

    殷玲 東方蜜蜂抗螨相關(guān)基因的篩選及初步驗(yàn)證[D] 揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),203:3-32

    [2]張揚(yáng),黃正洋,陳陽(yáng),等 采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析巢湖鴨異地小群保種效果 中國(guó)畜牧雜志,202,48():7-

    [3][2]Vanhala T,Tuiskula-Haavisto M,Elo K,et al Evaluation of genetic variability and genetic distances between eight chicken lines using microsatellite markers oultry Science,998,77(6):783-790

    [4]Ott Analysis of human genetic linkage[M] Baltimore:ohns Hopkins University ress,200[ZK)][H][FL)]endprint

    猜你喜歡
    遺傳多樣性
    從葉綠體DNA角度分析云南省砂梨地方品種遺傳多樣性
    寧夏外引水稻種質(zhì)資源表型性狀遺傳多樣性分析
    寧夏外引水稻種質(zhì)資源表型性狀遺傳多樣性分析
    茄子種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀遺傳多樣性分析
    淺析田間水稻紋枯病抗性鑒定體系的確立與完善
    西藏野核桃的表型特征及其保育措施
    金魚(yú)起源及遺傳多樣性研究進(jìn)展
    水稻紋枯病抗性鑒定體系的確立與遺傳多樣性研究
    楊梅種質(zhì)資源遺傳多樣性研究進(jìn)展
    金銀花SSR指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析
    国产精品 欧美亚洲| 久久久久国内视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲欧美激情综合另类| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品合色在线| 久久热在线av| 嫁个100分男人电影在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 大型黄色视频在线免费观看| 高清av免费在线| 黄色视频,在线免费观看| 精品人妻1区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 99国产精品一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 国产精品久久视频播放| 成人亚洲精品一区在线观看| 99re在线观看精品视频| av免费在线观看网站| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品国产一区二区精华液| 一区二区三区精品91| 成人免费观看视频高清| 午夜福利欧美成人| 999精品在线视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久午夜综合久久蜜桃| 麻豆国产av国片精品| 大型av网站在线播放| 国产精品二区激情视频| 在线观看免费视频网站a站| 欧美日韩黄片免| 91九色精品人成在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久九九热精品免费| 嫩草影院精品99| 国产精品日韩av在线免费观看 | 韩国精品一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 人妻久久中文字幕网| 日韩有码中文字幕| tocl精华| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 黄片小视频在线播放| 亚洲全国av大片| 色老头精品视频在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 97人妻天天添夜夜摸| 国产成人av激情在线播放| 人妻久久中文字幕网| 一级作爱视频免费观看| 亚洲五月婷婷丁香| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 午夜免费观看网址| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美乱色亚洲激情| 看免费av毛片| 亚洲免费av在线视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 午夜免费成人在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| av国产精品久久久久影院| 高清av免费在线| 中文欧美无线码| 嫩草影院精品99| 一进一出好大好爽视频| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 神马国产精品三级电影在线观看 | 不卡av一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 国产成人av激情在线播放| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 51午夜福利影视在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲成人免费av在线播放| 超碰97精品在线观看| 99国产精品一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 在线观看免费高清a一片| xxxhd国产人妻xxx| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲免费av在线视频| aaaaa片日本免费| 丝袜人妻中文字幕| 国产免费现黄频在线看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成人手机av| 两性夫妻黄色片| 成人黄色视频免费在线看| av超薄肉色丝袜交足视频| 一夜夜www| 亚洲五月天丁香| 久久久国产精品麻豆| 男人舔女人下体高潮全视频| av中文乱码字幕在线| 身体一侧抽搐| 激情视频va一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 国产熟女xx| 免费日韩欧美在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美日韩福利视频一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 一夜夜www| 一区在线观看完整版| 久久性视频一级片| 99在线视频只有这里精品首页| 久久九九热精品免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 91国产中文字幕| 久久久久国内视频| tocl精华| 麻豆av在线久日| 最近最新免费中文字幕在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线天堂中文资源库| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品二区激情视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 黄色女人牲交| 国产高清激情床上av| 午夜a级毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| 丁香欧美五月| 午夜影院日韩av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜福利免费观看在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲五月天丁香| cao死你这个sao货| 一级作爱视频免费观看| 视频区图区小说| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品一区二区在线不卡| 最近最新中文字幕大全电影3 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 脱女人内裤的视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 一级黄色大片毛片| 亚洲成人久久性| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 18禁观看日本| 国产三级在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 少妇被粗大的猛进出69影院| 美女高潮到喷水免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线看a的网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产成人影院久久av| 中国美女看黄片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 99久久国产精品久久久| aaaaa片日本免费| 色尼玛亚洲综合影院| 天堂影院成人在线观看| 久久影院123| 国产精品野战在线观看 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一进一出好大好爽视频| 精品国产美女av久久久久小说| 免费av毛片视频| 久久精品国产清高在天天线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 88av欧美| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 黄色视频不卡| 大陆偷拍与自拍| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲av熟女| a在线观看视频网站| 日本vs欧美在线观看视频| 黄色丝袜av网址大全| 久久 成人 亚洲| 亚洲专区字幕在线| 手机成人av网站| 精品国产亚洲在线| 亚洲成人久久性| 国产高清视频在线播放一区| 精品人妻1区二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线永久观看黄色视频| 88av欧美| 成在线人永久免费视频| 久久人妻熟女aⅴ| 这个男人来自地球电影免费观看| 99精品久久久久人妻精品| 日韩有码中文字幕| 欧美黄色淫秽网站| 99久久国产精品久久久| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 丰满迷人的少妇在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 美女国产高潮福利片在线看| 久久精品91蜜桃| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久这里只有精品19| 精品久久蜜臀av无| 美女扒开内裤让男人捅视频| 搡老乐熟女国产| 日韩国内少妇激情av| 少妇粗大呻吟视频| 国产野战对白在线观看| 另类亚洲欧美激情| 嫩草影院精品99| 一级片免费观看大全| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 女人精品久久久久毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 一二三四在线观看免费中文在| 丝袜在线中文字幕| 亚洲第一av免费看| 亚洲久久久国产精品| 天堂中文最新版在线下载| 日本wwww免费看| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜影院日韩av| 免费av毛片视频| 日日干狠狠操夜夜爽| www国产在线视频色| 黄片播放在线免费| 国产精品1区2区在线观看.| 一a级毛片在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 大香蕉久久成人网| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人永久免费在线观看视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 深夜精品福利| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费观看人在逋| 男人操女人黄网站| 狂野欧美激情性xxxx| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产xxxxx性猛交| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲一码二码三码区别大吗| av福利片在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜91福利影院| 午夜两性在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品二区激情视频| 久久99一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 国产片内射在线| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲精品在线美女| 一级a爱片免费观看的视频| 日本黄色日本黄色录像| 1024视频免费在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 91在线观看av| 自线自在国产av| 午夜福利,免费看| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美大码av| 欧美日韩av久久| 国产又爽黄色视频| 国产有黄有色有爽视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 美女福利国产在线| 国产一区二区三区视频了| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一夜夜www| 两人在一起打扑克的视频| 一级毛片女人18水好多| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品久久久久久,| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日韩精品网址| 欧美黑人精品巨大| 男女下面插进去视频免费观看| 一级作爱视频免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 九色亚洲精品在线播放| 精品一品国产午夜福利视频| cao死你这个sao货| 大码成人一级视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产野战对白在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 久9热在线精品视频| 高清在线国产一区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美亚洲日本最大视频资源| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久大精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| av国产精品久久久久影院| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 在线观看66精品国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产午夜精品久久久久久| 一区二区三区精品91| 免费av中文字幕在线| 国产成人av激情在线播放| 久久欧美精品欧美久久欧美| 一二三四社区在线视频社区8| 这个男人来自地球电影免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 丁香欧美五月| a在线观看视频网站| 精品第一国产精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 韩国av一区二区三区四区| 97碰自拍视频| 天堂动漫精品| 成年人黄色毛片网站| 国产片内射在线| av免费在线观看网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久精品国产清高在天天线| cao死你这个sao货| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产亚洲精品一区二区www| 涩涩av久久男人的天堂| 男女下面插进去视频免费观看| 十分钟在线观看高清视频www| 91九色精品人成在线观看| 午夜影院日韩av| 69av精品久久久久久| 午夜成年电影在线免费观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 一二三四社区在线视频社区8| x7x7x7水蜜桃| 欧美久久黑人一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 在线永久观看黄色视频| 最近最新免费中文字幕在线| 免费av中文字幕在线| 国产精品1区2区在线观看.| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 香蕉国产在线看| 精品高清国产在线一区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 90打野战视频偷拍视频| 极品人妻少妇av视频| 不卡av一区二区三区| 搡老岳熟女国产| 午夜免费观看网址| 亚洲av熟女| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产午夜精品久久久久久| 操美女的视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 在线视频色国产色| 午夜亚洲福利在线播放| 中出人妻视频一区二区| 曰老女人黄片| 亚洲视频免费观看视频| 香蕉国产在线看| 搡老熟女国产l中国老女人| 男人舔女人的私密视频| 午夜福利免费观看在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 中文亚洲av片在线观看爽| a级片在线免费高清观看视频| 久久九九热精品免费| 丝袜美足系列| 精品国产一区二区三区四区第35| 色精品久久人妻99蜜桃| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲专区中文字幕在线| 露出奶头的视频| 精品无人区乱码1区二区| 久久精品成人免费网站| 久久精品成人免费网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 三上悠亚av全集在线观看| 极品教师在线免费播放| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品一区二区三卡| 国产国语露脸激情在线看| 一本综合久久免费| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美日韩视频精品一区| 日韩大尺度精品在线看网址 | 国产亚洲精品一区二区www| 老汉色∧v一级毛片| 99国产综合亚洲精品| 级片在线观看| 91字幕亚洲| 在线看a的网站| 午夜免费鲁丝| 美女午夜性视频免费| 欧美成狂野欧美在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 一级a爱片免费观看的视频| 1024视频免费在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 在线永久观看黄色视频| 无人区码免费观看不卡| 色老头精品视频在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久伊人香网站| 免费少妇av软件| 女人精品久久久久毛片| 12—13女人毛片做爰片一| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品九九99| 丰满迷人的少妇在线观看| 另类亚洲欧美激情| 国产精品 欧美亚洲| 午夜福利欧美成人| 黄色片一级片一级黄色片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲激情在线av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成人免费观看视频高清| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| av电影中文网址| 国产精品国产av在线观看| 老司机福利观看| 成人三级黄色视频| 国产区一区二久久| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 亚洲三区欧美一区| cao死你这个sao货| 一本大道久久a久久精品| 十八禁网站免费在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品福利永久在线观看| 91九色精品人成在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | a级片在线免费高清观看视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 天堂俺去俺来也www色官网| 1024视频免费在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 天天添夜夜摸| 国产激情欧美一区二区| 久久精品影院6| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产免费av片在线观看野外av| 中出人妻视频一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产野战对白在线观看| 精品国产一区二区久久| 丝袜在线中文字幕| 十八禁人妻一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 狠狠狠狠99中文字幕| 一本综合久久免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 十八禁网站免费在线| 黄色a级毛片大全视频| 搡老岳熟女国产| 少妇的丰满在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 性欧美人与动物交配| 超碰97精品在线观看| 亚洲五月天丁香| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄色视频不卡| 国产人伦9x9x在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品 欧美亚洲| 午夜免费成人在线视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日本a在线网址| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 在线永久观看黄色视频| √禁漫天堂资源中文www| 丰满的人妻完整版| 国产单亲对白刺激| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 窝窝影院91人妻| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产单亲对白刺激| 在线视频色国产色| 操美女的视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品久久久久成人av| 欧美日本中文国产一区发布| 成人影院久久| av欧美777| 亚洲免费av在线视频| www.自偷自拍.com| 两性夫妻黄色片| 国产亚洲av高清不卡| 欧美在线一区亚洲| 一本大道久久a久久精品| 90打野战视频偷拍视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 久久久久久人人人人人| 母亲3免费完整高清在线观看| 热re99久久国产66热| 男女床上黄色一级片免费看| 高清av免费在线| 国产不卡一卡二| 日韩高清综合在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一本大道久久a久久精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 又黄又粗又硬又大视频| 日本a在线网址| 欧美激情久久久久久爽电影 | 香蕉丝袜av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| av网站免费在线观看视频| 9热在线视频观看99| 91av网站免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产免费现黄频在线看| 午夜日韩欧美国产| 国产欧美日韩一区二区三| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 丁香欧美五月| 成人三级做爰电影| 国产又爽黄色视频| 少妇的丰满在线观看| 嫩草影视91久久| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品一区av在线观看| 久久精品成人免费网站| 亚洲欧美激情在线| 十八禁人妻一区二区| 亚洲欧美激情在线| 一区在线观看完整版| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲 国产 在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 国产精品偷伦视频观看了| 黄色 视频免费看| 大香蕉久久成人网| 国产99白浆流出| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄色a级毛片大全视频| 18禁国产床啪视频网站| 精品久久蜜臀av无| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久9热在线精品视频| 黄色 视频免费看| 久99久视频精品免费| 久久人人97超碰香蕉20202| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线观看一区二区三区激情| 午夜久久久在线观看| 亚洲激情在线av| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久中文字幕人妻熟女| 岛国在线观看网站| 男女之事视频高清在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久国产乱子伦精品免费另类|