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    正交設(shè)計(jì)優(yōu)化芒果SRA—CR反應(yīng)體系及引物篩選

    2015-04-02 00:47:44趙英付海天周俊岸李日旺莫永龍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:體系優(yōu)化芒果

    趙英 付海天 周俊岸 李日旺 莫永龍 張宇 黃國(guó)弟

    摘要:以芒果基因組DNA為模板,采用正交試驗(yàn)對(duì)模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進(jìn)行3因素5水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性CR(sequence related amplified polymorphism,SRA-CR)最佳反應(yīng)體系為:30 ng 模板DNA、03 μmol/L 引物、0 μL 2×Taq CR Master Mix,總體積為25 μL。運(yùn)用該體系對(duì)0份芒果種質(zhì)材料進(jìn)行驗(yàn)證,證明該體系穩(wěn)定可靠,并從00對(duì)引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的36對(duì)引物組合。

    關(guān)鍵詞:芒果;SRA標(biāo)記;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);體系優(yōu)化;引物篩選

    中圖分類號(hào): Q9432;S667703文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):002-302(204)2-004-03

    芒果(Mangifera indica L)為漆樹科常綠果樹,是著名的熱帶亞熱帶水果,享有“熱帶果王”之美譽(yù),為世界五大名果之一。近年來(lái)由于我國(guó)芒果種質(zhì)資源的深入挖掘利用以及芒果育種的進(jìn)步,特別是國(guó)外引進(jìn)品種的增多,芒果種質(zhì)資源日益豐富,為芒果的品種創(chuàng)新奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),同時(shí)也對(duì)芒果遺傳多樣性鑒定和新品種測(cè)試與保護(hù)工作提出了新的挑戰(zhàn)。

    相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphism,SRA)是Li等于200年發(fā)明的一種新的標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)集隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAD)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFL)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一體,具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、在基因組中分布均勻等優(yōu)點(diǎn)。目前已應(yīng)用于蘋果、柑橘類果樹、櫻桃、大蒜、棉花、水稻、澳洲堅(jiān)果[2]、菠蘿、桃、花生[3]、番木瓜[4]等,但至今尚未見SRA分子標(biāo)記應(yīng)用于我國(guó)芒果遺傳多樣性分析、分類鑒定等方面的報(bào)道。[3]筆者在開展芒果遺傳多樣性及其親緣關(guān)系研究的過程中發(fā)現(xiàn),SRA-CR條件的變化會(huì)得到不同的結(jié)果,影響芒果的遺傳多樣性評(píng)價(jià),因此構(gòu)建適用于芒果的SRA-CR體系至關(guān)重要。

    [3]本試驗(yàn)以0份芒果種質(zhì)為材料,借鑒其他作物的研究成果,就影響芒果SRA-CR反應(yīng)的因素進(jìn)行探索,建立了適合芒果SRA分析的反應(yīng)條件及體系,旨在為芒果種質(zhì)資源鑒定和創(chuàng)新、分子標(biāo)記輔助育種等提供技術(shù)幫助,為近一步開展芒果種質(zhì)資源遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

    材料與方法

    試驗(yàn)材料

    參試芒果種質(zhì)共0份,均采自廣西亞熱帶作物研究所芒果種質(zhì)資源圃。選取芒果健康植株上的無(wú)病蟲嫩葉,采摘洗凈后于-70 ℃保存,反應(yīng)體系的優(yōu)化以金煌芒DNA為模板完成,供試品種見表。

    2試驗(yàn)方法

    2DNA的提取和檢測(cè)芒果基因組DNA的提取參照何新華等的CTAB法[5],并稍加改良,利用0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性,根據(jù)樣品D260 nm/D280 nm計(jì)算DNA純度,根據(jù)D260 nm值計(jì)算樣品DNA的濃度,并稀釋至0 ng/μL,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    22SRA-CR反應(yīng)條件參考Li等所用引物[,6],設(shè)計(jì)0條正向引物和0條反向引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。選用引物Me9與Em9進(jìn)行體系優(yōu)化,試驗(yàn)重復(fù)2次。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性 min,35 ℃退火 min,72 ℃延伸5 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃預(yù)變性 min,50 ℃ 退火 min,72 ℃ 延伸 5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸0 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩R產(chǎn)物用20%瓊脂糖凝膠在 05×TBE 電泳緩沖液中、85 W條件下電泳5 h,采用核酸染料染色法進(jìn)行條帶檢測(cè)。電泳結(jié)束后,于凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照,依照擴(kuò)增條帶的敏感性與特異性,即條帶的強(qiáng)弱及雜帶的多少來(lái)判斷各體系的優(yōu)劣。

    24優(yōu)化體系的穩(wěn)定性檢測(cè)及引物篩選隨機(jī)選擇6對(duì)SRA引物組合對(duì)優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證,確定芒果SRA-CR的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件,并對(duì)00條引物組合進(jìn)行CR擴(kuò)增,篩選多態(tài)性引物。

    2結(jié)果與分析

    2芒果基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果

    DNA的提取質(zhì)量是決定SRA-CR擴(kuò)增效果的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)以芒果嫩葉為材料,對(duì)0份芒果種質(zhì)材料的基因組DNA 進(jìn)行提取,最后得到的DNA呈透明絮狀,電泳后條帶清晰,無(wú)拖尾現(xiàn)象(圖)。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定,所用DNA樣品的D260 nm/D230 nm值均在20~25之間,D260 nm/D280 nm 值均在7~9之間,表明所提取的DNA質(zhì)量較高,符合試驗(yàn)要求。

    [FK(W0][TZYtif][FK)]

    22正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的SRA-CR擴(kuò)增結(jié)果分析

    由圖2可見,25個(gè)芒果正交試驗(yàn)處理的SRA-CR擴(kuò)增結(jié)果存在著一定的差異。從2次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看,、6、0、4、5、22號(hào)處理譜帶少且不清晰,4、5、8、9、2、3與7號(hào)組合的譜[2]帶清晰,亮度、重復(fù)性好。綜合擴(kuò)增條帶的數(shù)目、強(qiáng)弱、清晰度、可分辯率與節(jié)約成本等指標(biāo),確定組合8號(hào)是比較理想的擴(kuò)增模式體系,即25 μL反應(yīng)體系中含30 ng DNA,03 μmol/L 引物,25 μL 2×Taq CR Master Mix。

    23引物篩選

    以隨機(jī)選取的芒果DNA作模板,用00對(duì)引物進(jìn)行CR擴(kuò)增,從中選擇擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性高的適合芒果種質(zhì)鑒定的引物進(jìn)行正式擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增條帶的多少、清晰度、穩(wěn)定性和多態(tài)性高低,最終從所合成的00對(duì)引物中篩選出36對(duì)引物用于SRA擴(kuò)增(表5)。

    24SRA 優(yōu)化體系在不同芒果種間的擴(kuò)增

    根據(jù)上述試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果,隨機(jī)選取Me6與Em引物組合來(lái)對(duì)0份芒果種質(zhì)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,以進(jìn)一步驗(yàn)證該擴(kuò)增反應(yīng)體系的效果。由圖3可以看出,引物Me6與Em不

    但對(duì)0份芒果種質(zhì)均能擴(kuò)增出較好的條帶,而且也存在著很明顯[CM(25]的多態(tài)性條帶,由此說(shuō)明所優(yōu)化的擴(kuò)增體系比較可靠,適合芒果種質(zhì)的SRA分析研究。

    3結(jié)論與討論

    CR反應(yīng)體系的優(yōu)化方法主要有3種:?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)、均勻試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相對(duì)單因素試驗(yàn)而言具有試驗(yàn)次數(shù)較少、效用明確且能較快地獲得極佳的試驗(yàn)結(jié)果的特點(diǎn),避免了單一因素試驗(yàn)結(jié)果的不足。目前,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)已成功應(yīng)用于棗、價(jià)廉草、花生、番石榴等植物的 SRA-CR 反應(yīng)體系優(yōu)化[7],但在芒果上還未曾見報(bào)道。本試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì),對(duì)影響芒果SRA 反應(yīng)體系的模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進(jìn)行了優(yōu)化,建立了適用于芒果的最優(yōu)SRA反應(yīng)體系,即25μL反應(yīng)體系中包含30 ng 模板DNA、03μmol/L 引物、0μL 2×Taq CR Master Mix。同時(shí),在00個(gè)引物組合中,共得到多態(tài)性引物組合36個(gè)。該反應(yīng)體系及36個(gè)多態(tài)性引物組合可用于芒果種質(zhì)遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育和育種應(yīng)用等方面,同時(shí)也為芒果品種鑒定、親緣關(guān)系分析及優(yōu)良新品種的選育等提供技術(shù)參考。

    影響SRA-CR反應(yīng)的因素相對(duì)復(fù)雜,不同植物適應(yīng)的SRA 反應(yīng)體系不同,且各因素之間存在著相互效應(yīng),只有各因子之間的濃度配比達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)才能得到穩(wěn)定、可重復(fù)的擴(kuò)增結(jié)果。因此,SRA標(biāo)記應(yīng)用到不同物種上時(shí)需要優(yōu)化反應(yīng)體系和條件。在芒果SRA 體系優(yōu)化的過程中,發(fā)現(xiàn)DNA模板含量、2×Taq CR Master Mix含量及引物濃度等均會(huì)影響SRA擴(kuò)增效果,但模板DNA含量對(duì)擴(kuò)增無(wú)明顯影響(20~60 ng 之間均有穩(wěn)定的擴(kuò)增),這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[2,8-0]。可見,對(duì)芒果SRA 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化是非常必要的。

    [HS2][HT85H]參考文獻(xiàn):[HT8SS]

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    [3]邱文武,孫偉生,竇美安 菠蘿SRA反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 生物技術(shù),2008,8():39-42

    [4]韋金菊,何凡,范鴻雁,等 番木瓜DNA提取與SRA反應(yīng)體系優(yōu)化 中國(guó)南方果樹,200,39():33-36

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    [0][ZK(#]路娟,張紹鈴,劉慶忠,等 櫻桃SRA-CR體系優(yōu)化及其遺傳多樣性分析 果樹學(xué)報(bào),2009,26(2):63-69

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