• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    正交設(shè)計(jì)優(yōu)化芒果SRA—CR反應(yīng)體系及引物篩選

    2015-04-02 00:47:44趙英付海天周俊岸李日旺莫永龍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
    關(guān)鍵詞:體系優(yōu)化芒果

    趙英 付海天 周俊岸 李日旺 莫永龍 張宇 黃國(guó)弟

    摘要:以芒果基因組DNA為模板,采用正交試驗(yàn)對(duì)模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進(jìn)行3因素5水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性CR(sequence related amplified polymorphism,SRA-CR)最佳反應(yīng)體系為:30 ng 模板DNA、03 μmol/L 引物、0 μL 2×Taq CR Master Mix,總體積為25 μL。運(yùn)用該體系對(duì)0份芒果種質(zhì)材料進(jìn)行驗(yàn)證,證明該體系穩(wěn)定可靠,并從00對(duì)引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的36對(duì)引物組合。

    關(guān)鍵詞:芒果;SRA標(biāo)記;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);體系優(yōu)化;引物篩選

    中圖分類號(hào): Q9432;S667703文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):002-302(204)2-004-03

    芒果(Mangifera indica L)為漆樹科常綠果樹,是著名的熱帶亞熱帶水果,享有“熱帶果王”之美譽(yù),為世界五大名果之一。近年來(lái)由于我國(guó)芒果種質(zhì)資源的深入挖掘利用以及芒果育種的進(jìn)步,特別是國(guó)外引進(jìn)品種的增多,芒果種質(zhì)資源日益豐富,為芒果的品種創(chuàng)新奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),同時(shí)也對(duì)芒果遺傳多樣性鑒定和新品種測(cè)試與保護(hù)工作提出了新的挑戰(zhàn)。

    相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphism,SRA)是Li等于200年發(fā)明的一種新的標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)集隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAD)和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFL)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一體,具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、在基因組中分布均勻等優(yōu)點(diǎn)。目前已應(yīng)用于蘋果、柑橘類果樹、櫻桃、大蒜、棉花、水稻、澳洲堅(jiān)果[2]、菠蘿、桃、花生[3]、番木瓜[4]等,但至今尚未見SRA分子標(biāo)記應(yīng)用于我國(guó)芒果遺傳多樣性分析、分類鑒定等方面的報(bào)道。[3]筆者在開展芒果遺傳多樣性及其親緣關(guān)系研究的過程中發(fā)現(xiàn),SRA-CR條件的變化會(huì)得到不同的結(jié)果,影響芒果的遺傳多樣性評(píng)價(jià),因此構(gòu)建適用于芒果的SRA-CR體系至關(guān)重要。

    [3]本試驗(yàn)以0份芒果種質(zhì)為材料,借鑒其他作物的研究成果,就影響芒果SRA-CR反應(yīng)的因素進(jìn)行探索,建立了適合芒果SRA分析的反應(yīng)條件及體系,旨在為芒果種質(zhì)資源鑒定和創(chuàng)新、分子標(biāo)記輔助育種等提供技術(shù)幫助,為近一步開展芒果種質(zhì)資源遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

    材料與方法

    試驗(yàn)材料

    參試芒果種質(zhì)共0份,均采自廣西亞熱帶作物研究所芒果種質(zhì)資源圃。選取芒果健康植株上的無(wú)病蟲嫩葉,采摘洗凈后于-70 ℃保存,反應(yīng)體系的優(yōu)化以金煌芒DNA為模板完成,供試品種見表。

    2試驗(yàn)方法

    2DNA的提取和檢測(cè)芒果基因組DNA的提取參照何新華等的CTAB法[5],并稍加改良,利用0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性,根據(jù)樣品D260 nm/D280 nm計(jì)算DNA純度,根據(jù)D260 nm值計(jì)算樣品DNA的濃度,并稀釋至0 ng/μL,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    22SRA-CR反應(yīng)條件參考Li等所用引物[,6],設(shè)計(jì)0條正向引物和0條反向引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。選用引物Me9與Em9進(jìn)行體系優(yōu)化,試驗(yàn)重復(fù)2次。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性 min,35 ℃退火 min,72 ℃延伸5 min,5個(gè)循環(huán);94 ℃預(yù)變性 min,50 ℃ 退火 min,72 ℃ 延伸 5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸0 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩R產(chǎn)物用20%瓊脂糖凝膠在 05×TBE 電泳緩沖液中、85 W條件下電泳5 h,采用核酸染料染色法進(jìn)行條帶檢測(cè)。電泳結(jié)束后,于凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照,依照擴(kuò)增條帶的敏感性與特異性,即條帶的強(qiáng)弱及雜帶的多少來(lái)判斷各體系的優(yōu)劣。

    24優(yōu)化體系的穩(wěn)定性檢測(cè)及引物篩選隨機(jī)選擇6對(duì)SRA引物組合對(duì)優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證,確定芒果SRA-CR的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件,并對(duì)00條引物組合進(jìn)行CR擴(kuò)增,篩選多態(tài)性引物。

    2結(jié)果與分析

    2芒果基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果

    DNA的提取質(zhì)量是決定SRA-CR擴(kuò)增效果的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)以芒果嫩葉為材料,對(duì)0份芒果種質(zhì)材料的基因組DNA 進(jìn)行提取,最后得到的DNA呈透明絮狀,電泳后條帶清晰,無(wú)拖尾現(xiàn)象(圖)。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定,所用DNA樣品的D260 nm/D230 nm值均在20~25之間,D260 nm/D280 nm 值均在7~9之間,表明所提取的DNA質(zhì)量較高,符合試驗(yàn)要求。

    [FK(W0][TZYtif][FK)]

    22正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的SRA-CR擴(kuò)增結(jié)果分析

    由圖2可見,25個(gè)芒果正交試驗(yàn)處理的SRA-CR擴(kuò)增結(jié)果存在著一定的差異。從2次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看,、6、0、4、5、22號(hào)處理譜帶少且不清晰,4、5、8、9、2、3與7號(hào)組合的譜[2]帶清晰,亮度、重復(fù)性好。綜合擴(kuò)增條帶的數(shù)目、強(qiáng)弱、清晰度、可分辯率與節(jié)約成本等指標(biāo),確定組合8號(hào)是比較理想的擴(kuò)增模式體系,即25 μL反應(yīng)體系中含30 ng DNA,03 μmol/L 引物,25 μL 2×Taq CR Master Mix。

    23引物篩選

    以隨機(jī)選取的芒果DNA作模板,用00對(duì)引物進(jìn)行CR擴(kuò)增,從中選擇擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性高的適合芒果種質(zhì)鑒定的引物進(jìn)行正式擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增條帶的多少、清晰度、穩(wěn)定性和多態(tài)性高低,最終從所合成的00對(duì)引物中篩選出36對(duì)引物用于SRA擴(kuò)增(表5)。

    24SRA 優(yōu)化體系在不同芒果種間的擴(kuò)增

    根據(jù)上述試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果,隨機(jī)選取Me6與Em引物組合來(lái)對(duì)0份芒果種質(zhì)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,以進(jìn)一步驗(yàn)證該擴(kuò)增反應(yīng)體系的效果。由圖3可以看出,引物Me6與Em不

    但對(duì)0份芒果種質(zhì)均能擴(kuò)增出較好的條帶,而且也存在著很明顯[CM(25]的多態(tài)性條帶,由此說(shuō)明所優(yōu)化的擴(kuò)增體系比較可靠,適合芒果種質(zhì)的SRA分析研究。

    3結(jié)論與討論

    CR反應(yīng)體系的優(yōu)化方法主要有3種:?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)、均勻試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相對(duì)單因素試驗(yàn)而言具有試驗(yàn)次數(shù)較少、效用明確且能較快地獲得極佳的試驗(yàn)結(jié)果的特點(diǎn),避免了單一因素試驗(yàn)結(jié)果的不足。目前,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)已成功應(yīng)用于棗、價(jià)廉草、花生、番石榴等植物的 SRA-CR 反應(yīng)體系優(yōu)化[7],但在芒果上還未曾見報(bào)道。本試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì),對(duì)影響芒果SRA 反應(yīng)體系的模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進(jìn)行了優(yōu)化,建立了適用于芒果的最優(yōu)SRA反應(yīng)體系,即25μL反應(yīng)體系中包含30 ng 模板DNA、03μmol/L 引物、0μL 2×Taq CR Master Mix。同時(shí),在00個(gè)引物組合中,共得到多態(tài)性引物組合36個(gè)。該反應(yīng)體系及36個(gè)多態(tài)性引物組合可用于芒果種質(zhì)遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育和育種應(yīng)用等方面,同時(shí)也為芒果品種鑒定、親緣關(guān)系分析及優(yōu)良新品種的選育等提供技術(shù)參考。

    影響SRA-CR反應(yīng)的因素相對(duì)復(fù)雜,不同植物適應(yīng)的SRA 反應(yīng)體系不同,且各因素之間存在著相互效應(yīng),只有各因子之間的濃度配比達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)才能得到穩(wěn)定、可重復(fù)的擴(kuò)增結(jié)果。因此,SRA標(biāo)記應(yīng)用到不同物種上時(shí)需要優(yōu)化反應(yīng)體系和條件。在芒果SRA 體系優(yōu)化的過程中,發(fā)現(xiàn)DNA模板含量、2×Taq CR Master Mix含量及引物濃度等均會(huì)影響SRA擴(kuò)增效果,但模板DNA含量對(duì)擴(kuò)增無(wú)明顯影響(20~60 ng 之間均有穩(wěn)定的擴(kuò)增),這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[2,8-0]。可見,對(duì)芒果SRA 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化是非常必要的。

    [HS2][HT85H]參考文獻(xiàn):[HT8SS]

    [ZK(#]Li G,Quiros C F Sequence-related amplified polymorpgism (SRA) a new marker system based on a simple CR reaction:its application to mapping and gene tagging in BrassicaTheoretical and Applied Genetics,200,03(2/3):455-46

    [2]郭凌飛,鄒明宏,杜麗清,等 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化澳洲堅(jiān)果SRA反應(yīng)體系 果樹學(xué)報(bào),2008,25(2):250-253

    [3]邱文武,孫偉生,竇美安 菠蘿SRA反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 生物技術(shù),2008,8():39-42

    [4]韋金菊,何凡,范鴻雁,等 番木瓜DNA提取與SRA反應(yīng)體系優(yōu)化 中國(guó)南方果樹,200,39():33-36

    [5]何新華,李楊瑞,郭永澤,等 23個(gè)廣西本地芒果品種的ISSR分析 分子植物育種,2005,3(6):829-834

    [6][2]Ahmad R,otter D,Southwick S M Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRA molecular markers ournal of the American Society for Horticultural Science,2004,29(2):204-20

    [7]楊祥燕,蔡元保,陳豪軍,等 番石榴SRA反應(yīng)體系的建立與正交優(yōu)化 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),20,27(22):29-223

    [8]Budak H,Shearman R C,armaksiz I,et al Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs,SSRs,RADs,and SRAs Theoretical and Applied Genetics,2004,09(2):280-288

    [9]劉沖,葛才林,任云英,等 SRA、ISSR技術(shù)的優(yōu)化及在甘藍(lán)類植物種子鑒別中的應(yīng)用 生物工程學(xué)報(bào),2006,22(4):657-66[ZK)]

    [0][ZK(#]路娟,張紹鈴,劉慶忠,等 櫻桃SRA-CR體系優(yōu)化及其遺傳多樣性分析 果樹學(xué)報(bào),2009,26(2):63-69

    猜你喜歡
    體系優(yōu)化芒果
    我愛刷牙
    我愛刷牙
    我才不要穿
    小洞會(huì)“咬”人
    小洞會(huì)“咬”人
    供電公司人力資源培訓(xùn)與開發(fā)體系優(yōu)化
    正交設(shè)計(jì)優(yōu)化荷花品種ISSR—PCR反應(yīng)體系
    楊梅iPBS—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化
    綠水集團(tuán)公司融資戰(zhàn)略體系優(yōu)化研究
    材料加工實(shí)驗(yàn)課程體系優(yōu)化分析
    日本黄色片子视频| 中国美女看黄片| 亚洲成人久久爱视频| 日日夜夜操网爽| bbb黄色大片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久精品国产亚洲精品| 国产探花极品一区二区| 久久这里只有精品中国| 一边摸一边抽搐一进一小说| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久精品影院6| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲中文字幕日韩| 国产三级黄色录像| 精品日产1卡2卡| 精品一区二区三区人妻视频| 极品教师在线免费播放| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产免费av片在线观看野外av| 俺也久久电影网| 精品乱码久久久久久99久播| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩欧美在线二视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 99热只有精品国产| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产真实乱freesex| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美+日韩+精品| 国产伦人伦偷精品视频| 在线播放无遮挡| 欧美乱妇无乱码| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲内射少妇av| 日本三级黄在线观看| 午夜影院日韩av| 51国产日韩欧美| 一个人免费在线观看电影| 九色成人免费人妻av| 久久久久久久久大av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 好男人电影高清在线观看| 黄色一级大片看看| 老司机午夜福利在线观看视频| 波野结衣二区三区在线| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久久国内视频| 亚洲成av人片在线播放无| 宅男免费午夜| 亚洲avbb在线观看| 91字幕亚洲| 最近中文字幕高清免费大全6 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日日夜夜操网爽| 长腿黑丝高跟| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲精品一区av在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久久久国内视频| 亚洲精品成人久久久久久| 精品无人区乱码1区二区| 嫩草影院新地址| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美潮喷喷水| aaaaa片日本免费| 午夜精品一区二区三区免费看| 男女床上黄色一级片免费看| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲av.av天堂| 一本综合久久免费| 久久午夜亚洲精品久久| 国产高清视频在线观看网站| 免费av观看视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 91狼人影院| 丁香六月欧美| 亚洲专区国产一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 极品教师在线免费播放| 久99久视频精品免费| 婷婷丁香在线五月| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看免费视频日本深夜| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产一区二区在线av高清观看| 天美传媒精品一区二区| 青草久久国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 性色avwww在线观看| 久久久久久久久久黄片| 熟女电影av网| 少妇的逼水好多| 桃色一区二区三区在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 一a级毛片在线观看| 在线天堂最新版资源| 怎么达到女性高潮| 一进一出抽搐动态| 欧美一区二区亚洲| 国产高清激情床上av| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲av不卡在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 夜夜爽天天搞| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲国产精品999在线| 日韩免费av在线播放| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品一区二区三区人妻视频| 日本黄大片高清| 亚洲av二区三区四区| 国产老妇女一区| 熟女电影av网| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 在线观看免费视频日本深夜| 熟女电影av网| 国产极品精品免费视频能看的| 99视频精品全部免费 在线| 日韩国内少妇激情av| 国产精品亚洲美女久久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 人妻久久中文字幕网| 欧美3d第一页| 又爽又黄无遮挡网站| 婷婷丁香在线五月| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 欧美国产日韩亚洲一区| bbb黄色大片| 一区二区三区免费毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜福利欧美成人| 色在线成人网| 精品国产亚洲在线| 亚洲av二区三区四区| 91在线观看av| 国产色爽女视频免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本三级黄在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 高清在线国产一区| 国产精品1区2区在线观看.| 少妇丰满av| 97超视频在线观看视频| 一a级毛片在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 免费看a级黄色片| 免费观看人在逋| 久久午夜福利片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 精品午夜福利在线看| 久久久久久大精品| 国产精品女同一区二区软件 | 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲国产精品999在线| avwww免费| 哪里可以看免费的av片| 极品教师在线免费播放| 51午夜福利影视在线观看| 日韩欧美免费精品| 亚洲五月天丁香| 一本一本综合久久| 国产日本99.免费观看| 久久草成人影院| 99热这里只有是精品50| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费av不卡在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 午夜a级毛片| 亚洲国产欧美人成| av视频在线观看入口| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲av不卡在线观看| 内地一区二区视频在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 久久人妻av系列| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 精品一区二区三区视频在线| 欧美色视频一区免费| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 色尼玛亚洲综合影院| 看免费av毛片| 赤兔流量卡办理| 亚洲色图av天堂| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品午夜福利在线看| 简卡轻食公司| 欧美潮喷喷水| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 九色成人免费人妻av| 精品熟女少妇八av免费久了| 色5月婷婷丁香| 最好的美女福利视频网| 精品久久久久久久末码| 十八禁国产超污无遮挡网站| 大型黄色视频在线免费观看| 90打野战视频偷拍视频| 老司机福利观看| 国产午夜精品论理片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 免费无遮挡裸体视频| 欧美bdsm另类| 欧美zozozo另类| 91麻豆av在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av美国av| 午夜激情欧美在线| 国产亚洲精品av在线| 波多野结衣高清无吗| 偷拍熟女少妇极品色| aaaaa片日本免费| 亚洲成av人片在线播放无| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美zozozo另类| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 欧美在线一区亚洲| 精品久久久久久成人av| 国产精品1区2区在线观看.| 五月玫瑰六月丁香| 欧美乱妇无乱码| av专区在线播放| 2021天堂中文幕一二区在线观| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国内精品久久久久久久电影| 99国产精品一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 久久久成人免费电影| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲av不卡在线观看| 欧美区成人在线视频| 久久久久久久久久黄片| 女人被狂操c到高潮| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲内射少妇av| 免费在线观看亚洲国产| 免费av不卡在线播放| 免费高清视频大片| 久久久久久大精品| 如何舔出高潮| 久久欧美精品欧美久久欧美| 99国产精品一区二区蜜桃av| 九色国产91popny在线| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久久久国产a免费观看| 久久久国产成人精品二区| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久久大精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 无遮挡黄片免费观看| 在线观看午夜福利视频| av专区在线播放| 美女大奶头视频| 国产精品久久视频播放| 国产午夜精品论理片| 久久99热这里只有精品18| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美一区二区精品小视频在线| 观看美女的网站| 国产久久久一区二区三区| 麻豆成人av在线观看| 亚洲av美国av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产老妇女一区| 国产精品日韩av在线免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产av不卡久久| 欧美3d第一页| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美性感艳星| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人美女网站在线观看视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲成人久久性| 我要看日韩黄色一级片| 天堂影院成人在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产麻豆成人av免费视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲精品456在线播放app | 两个人视频免费观看高清| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 一a级毛片在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲av熟女| 国产 一区 欧美 日韩| 中文字幕av成人在线电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 午夜久久久久精精品| 日韩人妻高清精品专区| 日韩欧美免费精品| 天堂影院成人在线观看| 国产乱人视频| 天美传媒精品一区二区| 国产av一区在线观看免费| 搞女人的毛片| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲av成人av| 免费观看的影片在线观看| 国产在视频线在精品| 欧美最新免费一区二区三区 | 搡老岳熟女国产| 免费观看人在逋| 免费在线观看成人毛片| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲专区中文字幕在线| 九色成人免费人妻av| 麻豆国产av国片精品| 亚洲在线自拍视频| 精品不卡国产一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产高清激情床上av| av视频在线观看入口| 热99re8久久精品国产| 人妻久久中文字幕网| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久国产精品影院| 国产三级在线视频| 在线免费观看的www视频| 嫩草影院精品99| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产熟女xx| 一个人免费在线观看电影| 啪啪无遮挡十八禁网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 少妇的逼水好多| 日韩免费av在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 18+在线观看网站| 此物有八面人人有两片| 90打野战视频偷拍视频| 美女高潮的动态| 一本综合久久免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 在线看三级毛片| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲国产精品999在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲成av人片在线播放无| 国产野战对白在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲欧美日韩东京热| 午夜免费成人在线视频| 天美传媒精品一区二区| 内地一区二区视频在线| 国产毛片a区久久久久| 一a级毛片在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品伦人一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲国产精品999在线| 淫秽高清视频在线观看| 性色avwww在线观看| xxxwww97欧美| 日本黄色片子视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产亚洲精品av在线| 国产男靠女视频免费网站| 国产一区二区在线av高清观看| 一进一出抽搐动态| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩精品青青久久久久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费在线观看成人毛片| 日韩国内少妇激情av| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 在线观看66精品国产| 宅男免费午夜| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩大尺度精品在线看网址| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 天美传媒精品一区二区| 校园春色视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲男人的天堂狠狠| 婷婷亚洲欧美| 亚洲成人免费电影在线观看| 热99在线观看视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久人妻av系列| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av美国av| 亚洲成a人片在线一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 少妇的逼好多水| 亚洲精品456在线播放app | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 精品乱码久久久久久99久播| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| www.熟女人妻精品国产| 中文亚洲av片在线观看爽| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 成年人黄色毛片网站| 伦理电影大哥的女人| 人人妻人人看人人澡| www日本黄色视频网| 亚洲人成伊人成综合网2020| 1000部很黄的大片| 最近最新免费中文字幕在线| 国产熟女xx| 国产精品三级大全| 老女人水多毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 成年免费大片在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 老司机深夜福利视频在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 天堂网av新在线| 国产私拍福利视频在线观看| 99热这里只有精品一区| 精品人妻视频免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 色哟哟哟哟哟哟| 美女cb高潮喷水在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 可以在线观看的亚洲视频| 嫩草影院入口| 欧美激情久久久久久爽电影| 69人妻影院| 特级一级黄色大片| 性色av乱码一区二区三区2| 免费观看精品视频网站| 精品久久久久久久久av| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品三级大全| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久久久久久久黄片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 香蕉av资源在线| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美在线黄色| 最新在线观看一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 很黄的视频免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久99热6这里只有精品| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久国产成人精品二区| 久久国产乱子免费精品| 如何舔出高潮| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费看日本二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久草成人影院| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品日产1卡2卡| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲精华国产精华精| 国产精品1区2区在线观看.| 成人午夜高清在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久6这里有精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品女同一区二区软件 | 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产 一区 欧美 日韩| 黄片小视频在线播放| 日本一本二区三区精品| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久99久视频精品免费| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 精品一区二区三区av网在线观看| 草草在线视频免费看| 老司机福利观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 中文字幕精品亚洲无线码一区| ponron亚洲| 麻豆国产av国片精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日韩亚洲欧美综合| 男人的好看免费观看在线视频| 国产老妇女一区| 日韩欧美精品免费久久 | 毛片一级片免费看久久久久 | 露出奶头的视频| 男女那种视频在线观看| 美女大奶头视频| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲成人久久性| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲乱码一区二区免费版| 很黄的视频免费| av天堂在线播放| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 午夜激情福利司机影院| 国内精品美女久久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 日本黄大片高清| 久9热在线精品视频| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品久久视频播放| 国产视频一区二区在线看| 美女cb高潮喷水在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久色成人| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美在线黄色| 国产av一区在线观看免费| 亚洲精品色激情综合| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av一区综合| 在线观看66精品国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久久久久久久黄片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 99久久精品热视频| 亚洲成av人片在线播放无| 男插女下体视频免费在线播放| 国产真实伦视频高清在线观看 | 悠悠久久av| 欧美高清性xxxxhd video| 综合色av麻豆| 九九在线视频观看精品| 色视频www国产| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲国产精品合色在线| 无人区码免费观看不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成人av在线播放网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲中文日韩欧美视频| 在线观看午夜福利视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 一区二区三区免费毛片| 午夜福利18| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日韩大尺度精品在线看网址| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av在线老鸭窝| 日韩av在线大香蕉| 午夜免费成人在线视频| 亚洲在线观看片| 夜夜爽天天搞| 国产av在哪里看| 成人美女网站在线观看视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产探花在线观看一区二区| 一区二区三区免费毛片| 久久国产乱子免费精品| 波多野结衣巨乳人妻| 青草久久国产| 热99在线观看视频| 国产伦在线观看视频一区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 内射极品少妇av片p| 久99久视频精品免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美激情久久久久久爽电影| aaaaa片日本免费| 久久精品影院6|