楊梅iPBS—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

郭志?！⊥貔i凱　郄紅麗等

摘要：利用已報道的iPBS引物2249 和3個楊梅品種的DNA為模板進行iPBS-PCR擴增，采用單因素法對楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系的4個組分（dNTP、Mg2+、引物、模板）用量進行優(yōu)化，確定了楊梅iPBS-PCR 20 μL反應(yīng)體系：2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA。梯度PCR試驗表明可以參考iPBS引物Tm值確定退火溫度。利用上述體系對隨機取樣的10個品種用4條iPBS引物進行擴增，得到了條帶清晰、多態(tài)性好的iPBS譜帶。

關(guān)鍵詞：楊梅；iPBS-PCR；體系優(yōu)化

中圖分類號： S667.601文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0051-04

收稿日期：2015-05-13

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（12）2011]；江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012361）；國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：20120389）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程[編號：SXGC（2014）076]。

作者簡介：郭志海（1965—），男，江蘇江陰人，高級農(nóng)藝師、副教授，主要從事園藝種質(zhì)資源研究。E-mail：Gzh8115@163.com。

通信作者：王鵬凱，講師，主要從植物分子生物學(xué)研究。E-mail：mengxiao02181@hotmail.com。楊梅（Myrica rubra） 是楊梅科楊梅屬常綠小喬木，原產(chǎn)于我國，主要生長在長江流域以南的丘陵山地。楊梅果實營養(yǎng)豐富，具有較強的保健功能，是南方經(jīng)濟效益較高的水果之一[1]。我國楊梅栽培歷史悠久，生態(tài)環(huán)境的多樣性產(chǎn)生了性狀多樣的品種、品系和類型，形成了豐富的種質(zhì)資源。利用形態(tài)學(xué)、同工酶等方法鑒定楊梅種質(zhì)資源局限性大、效率低。因此，常利用分子標記對楊梅種質(zhì)資源進行分析，包括遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、品（雜）種鑒別等方面。目前，RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR、iPBS、ScoT等技術(shù)[2-7]在楊梅中都已得到應(yīng)用[8]。

iPBS是以LTR類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守位點設(shè)計引物進行擴增的一種分子標記技術(shù)，針對LTR類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中2個PBS（引物結(jié)合位點）區(qū)間進行擴增[9]。該方法簡單、有效，可節(jié)約大量人力、物力，不用預(yù)先獲知LTR序列，直接進行引物篩選。目前，該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于亞麻[10]、大麥、小麥、蘋果、玉米[9]、葡萄[11]等的研究。當(dāng)材料、方法不同時，需對擴增條件進行優(yōu)化才能得出更科學(xué)的標記譜帶。本研究利用單因素試驗對楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，通過對電泳結(jié)果的分析建立了楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系。同時利用該反應(yīng)體系對已有的iPBS引物進行初步篩選，研究結(jié)果將為使用iPBS標記評價、鑒定楊梅種質(zhì)資源提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用的楊梅種質(zhì)資源材料均采自江蘇省太湖常綠果樹技術(shù)推廣中心國家楊梅種質(zhì)資源圃，楊梅品種為晚稻（浙江舟山）、狗色頭（江蘇常熟）、浪蕩子（江蘇蘇州東山）。PCR試劑購于TaKaRa公司（10×rTaq buffer，2.5 μmol/L dNTP，25 μmol/L MgCl2，5 U/μL rTaq ），引物由上海生工合成（溶解至10 μmol/L）。

1.2試驗方法

1.2.1楊梅DNA提取與檢測楊梅基因組DNA提取采用改良CTAB快速提取法[12]。將楊梅嫩葉直接在CTAB提取液中勻漿，經(jīng)過抽提、沉淀、溶解等步驟得到基因組DNA溶液。獲得的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測。通過紫外分光光度計測定260、280 nm 處的吸光度，用于測算DNA純度（D260 nm/D280 nm）、濃度（D260 nm）。完成濃度測定的DNA溶液進一步稀釋成10 ng/μL的工作液，用于后續(xù)PCR反應(yīng)。

1.2.2楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化楊梅iPBS-PCR擴增反應(yīng)總體積為20 μL，選擇在葡萄iPBS-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化中使用的2249引物（5′-AACCGACCTCTGATACCA-3′）進行PCR擴增（預(yù)試驗結(jié)果顯示該引物在楊梅中擴增效果較好）[11]。采用單因素法對2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L Mg2+、10 μmol/L引物、模板用量進行試驗，其中包括：（1）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，0.2 μL Taq酶，1.6 μL dNTP，Mg2+用量設(shè)為1.2、1.4、1.6、1.8 μL，DNA模板用量設(shè)為5、10、15、20、25、30、50 ng，用以確定最佳Mg2+和模板DNA用量。（2）2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL dNTP，1.6 μL Mg2+，0.2 μL Taq酶，2 249引物用量設(shè)為1、2 μL，DNA模板用量設(shè)為10、20、30、40 ng，用以確定引物與模板的最佳比例和用量；（3）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，30 ng DNA模板，0.2 μL Taq酶，1.6 μL Mg2+，dNTP用量設(shè)為1.2、1.6、2.0 μL，用以確定dNTP的最佳用量。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳方法進行檢測，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)對不同反應(yīng)體系進行評價，篩選出適合楊梅iPBS-PCR最佳反應(yīng)體系。

1.2.3楊梅iPBS-PCR反應(yīng)程序本試驗中楊梅iPBS-PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，49～59 ℃（2 ℃/梯度，共6個梯度）退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物評價方法與“1.2.2”節(jié)相同，顯示出退火溫度對楊梅iPBS-PCR反應(yīng)的影響，用以確定最佳退火溫度。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取與質(zhì)量控制

電泳檢測結(jié)果（圖1）表明得到的楊梅基因組DNA主帶明亮，無明顯拖尾，經(jīng)RNA酶處理后RNA降解較好。分光光度計檢測結(jié)果表明70 mg新鮮葉片可以得到2～3 μg基因組DNA，經(jīng)RNA酶處理后D260 nm/D280 nm在1.65～1.90之間，純度較好。

2.2PCR反應(yīng)各因素對iPBS-PCR擴增反應(yīng)的影響

選用3個品種的楊梅基因DNA進行iPBS-PCR反應(yīng)，測試不同反應(yīng)體系下的擴增效果，篩選PCR反應(yīng)各因素的優(yōu)化組合。

2.2.1Mg2+濃度對iPBS-PCR的影響PCR反應(yīng)中的Mg2+對擴增的特異性和Taq酶活性有明顯的影響。隨著Mg2+用量的增加，擴增出的譜帶逐漸增多且亮度也逐步增加，彌散情況基本良好，有利于譜帶的判讀；但Mg2+用量增至1.8 μL時，部分譜帶的彌散程度有所增加，可能增加差異較小的譜帶判讀難度，進而影響后續(xù)的結(jié)果分析。為了結(jié)果的一致性，在測試時設(shè)置了7個模板用量（5、10、15、20、25、30、50 ng），發(fā)現(xiàn)Mg2+用量對iPBS-PCR的影響在不同模板量的情況下是一致的（圖2）。因此，在本研究中1.2～1.8 μL Mg2+用量均適宜楊梅的iPBS-PCR反應(yīng)，但是為了平衡譜帶數(shù)量和判讀質(zhì)量，在后續(xù)試驗中Mg2+用量固定為1.6 μL。

2.2.2模板DNA用量對iPBS-PCR的影響模板用量是PCR體系的重要影響因素，楊梅iPBS-PCR的預(yù)試驗中就發(fā)現(xiàn)100 ng以上的模板用量會導(dǎo)致擴增失敗。當(dāng)Mg2+用量固定為1.6 μL時在5～50 ng模板量范圍內(nèi)，模板量的改變對iPBS-PCR影響較大（圖3）。當(dāng)模板量增加時，擴增出的譜帶逐漸增多、亮度也有所增加，并且這種影響在3個楊梅品種中具有一致性；對于得到譜帶較多的品種，當(dāng)模板量增至50 ng時彌散程度增加，影響了結(jié)果分析。因此 綜合考慮以上結(jié)果，確定后續(xù)試驗中模板DNA用量為30 ng。

2.2.3引物用量對iPBS-PCR的影響引物用量對擴增的特異性和譜帶的清晰度有明顯影響。當(dāng)引物用量由1 μL增加至2 μL后，譜帶數(shù)量減少且彌散情況比較嚴重， 譜帶的特

征性也發(fā)生變化；本試驗中同時使用3個品種、4個模板梯度，電泳結(jié)果顯示引物用量增加對楊梅iPBS-PCR的影響是一致的（圖4）。因此，綜合分析電泳結(jié)果，確定后續(xù)試驗中引物用量為1 μL。

2.2.4dNTP用量對iPBS-PCR的影響dNTP用量與PCR反應(yīng)的擴增效率關(guān)系密切。當(dāng)dNTP用量為1.2 μL時，擴增效率低、譜帶亮度不足；隨著dNTP用量增加，條帶逐漸變亮，但是過多的dNTP（2.0 μL）會使譜帶中的主帶亮度大大增加，從而影響其它條帶的判讀（圖5）。因此，后續(xù)試驗中dNTP用量確定為1.6 μL。

2.2.5楊梅iPBS-PCR最優(yōu)化體系通過一系列的單因素測試，綜合分析電泳結(jié)果，建立20 μL楊梅iPBS-PCR擴增體系（表1）。

表1楊梅iPBS-PCR優(yōu)化體系

成分加入量（μL）10×Taq buffer2.025 mmol/L Mg2+1.62.5 mmol/L dNTP1.610 μmol/L 引物1.05 U/μL Taq酶0.210 ng/μL 模板DNA1.0滅菌ddH2O12.6

2.3退火溫度對擴增反應(yīng)的影響及楊梅iPBS-PCR優(yōu)化體系驗證

2.3.1退火溫度對iPBS擴增反應(yīng)的影響PCR程序中的退火溫度直接決定了引物擴增的效果，對產(chǎn)物的特異性有重要的影響。在分子標記中，退火溫度可以直接影響譜帶特征。報道的引物2249理論退火溫度為51 ℃，合成報告Tm值為53 ℃，為檢測不同退火溫度對擴增反應(yīng)的影響，以浪蕩子為材料，在“2.2.5”節(jié)優(yōu)化體系的基礎(chǔ)上設(shè)置49～59 ℃（2 ℃/梯度）共6個退火溫度進行擴增反應(yīng)；電泳結(jié)果顯示隨著退火溫度的升高，得到的譜帶逐漸減少，譜帶特征發(fā)生很大變化（圖6）；比較發(fā)現(xiàn)以Tm值（53 ℃）為退火溫度得到的譜帶數(shù)目較多且比較清晰， 因此在選擇不同引物退火溫度時推薦使用Tm值作為參考進行上下調(diào)節(jié)。

2.3.2優(yōu)化體系下的擴增效果從楊梅資源圃中隨機挑選10個品種提取DNA，并在已報道的iPBS引物中隨機選擇4條引物，以優(yōu)化后的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)、引物Tm值作為退火溫度，進行iPBS-PCR擴增反應(yīng)，驗證優(yōu)化體系和退火溫度設(shè)置的有效性。結(jié)果（圖7）顯示，4條引物均擴增出清晰的譜帶且多態(tài)性明顯，說明上述優(yōu)化體系的確適用于楊梅iPBS分子標記。

3結(jié)論與討論

高等植物中過半的重復(fù)DNA由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子組成，它們散布于各染色體上，是動態(tài)的基因組組件，有能力整合新的拷貝，促進內(nèi)部染色體重組[13]。用其開發(fā)分子標記，信息量高，多態(tài)性好，但是iPBS分子標記也是基于PCR反應(yīng)的分子標記，雖然多態(tài)性非常豐富，但是與其他分子標記一樣受到多種因素的影響。試驗的穩(wěn)定性和可靠性與PCR反應(yīng)體系和條件關(guān)系很大，因此在使用前需要對反應(yīng)體系進行優(yōu)化。PCR體系中的各個組分不僅在絕對用量方面決定反應(yīng)的擴增效果，各個組分之間的比例也會對反應(yīng)造成影響。除此以外，擴增程序尤其是退火溫度對iPBS分子標記的譜帶特征影響非常大，本試驗的測試結(jié)果同樣支持此觀點。綜合本試驗的擴增結(jié)果，可以看出楊梅iPBS-PCR反應(yīng)體系中的各個組分在一定的用量范圍內(nèi)均可以得到較好的擴增效果， 因此在實際試驗過程中應(yīng)該根據(jù)引物和模板的實際情況進行調(diào)整，最終得到最佳效果的分子標記譜帶信息。本研究利用單因素法獲得了適用于楊梅iPBS標記檢測的PCR體系，即在20 μL反應(yīng)體系中：2 μL 10 × Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA，滅菌ddH2O補足20 μL。該反應(yīng)體系重復(fù)性好，多態(tài)性高，有利于譜帶的判讀。本試驗結(jié)果將為利用iPBS-PCR技術(shù)進行楊梅種質(zhì)遺傳多樣性評價及鑒定提供技術(shù)支持，也將為應(yīng)用于其他植物的研究提供借鑒。

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