正交設(shè)計(jì)優(yōu)化荷花品種ISSR—PCR反應(yīng)體系

桂騰琴　伍偉　盧鵬

摘要：以東方明珠荷花為試驗(yàn)材料，應(yīng)用L9（34）正交設(shè)計(jì)，探討反應(yīng)體系中引物、Taq DNA聚合酶等4個(gè)不同因素的3個(gè)水平對(duì)荷花品種反應(yīng)體系的影響，正交設(shè)計(jì)所用引物為UBC843，PCR結(jié)果應(yīng)用MINITAB軟件進(jìn)行方差分析和極差分析。結(jié)果表明，荷花最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性高、重復(fù)性較好，為從分子水平對(duì)荷花品種進(jìn)行各項(xiàng)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：荷花；正交設(shè)計(jì)；ISSR-PCR；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S188；Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0071-03

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）為睡蓮科蓮屬植物，是中國傳統(tǒng)的十大名花之一，素有“活化石”之稱[1]。安龍荷花種質(zhì)資源豐富，但優(yōu)良品種較少，在長期自然雜交過程中，不僅形成了類型多樣的品種，而且品種間的親緣關(guān)系也較為復(fù)雜，給荷花種質(zhì)資源的收集、保存、研究等帶來了不便。傳統(tǒng)的形態(tài)指標(biāo)容易受到生態(tài)環(huán)境及基因顯隱性影響，不能客觀地估計(jì)遺傳變異性。因此，從分子水平對(duì)荷花品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行研究是非常必要的。1994年Zietkiewicz等創(chuàng)建了簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，ISSR）技術(shù)[2]，它具有穩(wěn)定性、可操作性、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)[3]，但是ISSR-PCR易受諸多因素如Taq DNA聚合酶、引物、退火溫度等干擾，而且不同物種 ISSR-PCR 最佳反應(yīng)體系的差別也很大[4-5]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以克服傳統(tǒng)單因素試驗(yàn)的不足，考慮各因子的相互作用，具有齊整可比、均衡分散等優(yōu)點(diǎn)[6]，能通過較少的試驗(yàn)組合快速找到最佳反應(yīng)體系[7]。黃宇等以6份荷花品種的葉片為材料，采用單因素方法優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系[8]；孫祖霞等以荷花品種新紅的葉片為材料，采用L16（45）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化荷花相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性PCR（SRAP-PCR）反應(yīng)體系[9]；徐君等也是采用單因素方法優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系[10]。迄今為止，關(guān)于荷花品種ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化的報(bào)道較少，本研究擬用L9（34）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化反應(yīng)體系，以期為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為東方明珠，其花瓣采于貴州省安龍縣招堤荷花池，花瓣采集后用硅膠干燥，正交設(shè)計(jì)過程中用到的引物為UBC 843（CT）8RA。

1.2 DNA的提取

東方明珠花瓣DNA的提取參考桂騰琴等方法[11]；DNA純度、濃度用UV-4501S紫外分光光度計(jì)測定；DNA質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，各因素-水平組合見表1。每個(gè)處理重復(fù)2次，反應(yīng)總體積為25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50.6 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，擴(kuò)增結(jié)束后于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.4 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色電泳后，在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和分析。

1.4 退火溫度的確定

設(shè)定6 個(gè)退火溫度：47.6、48.6、49.6、50.6、51.6、53.6 ℃，選用正交設(shè)計(jì)確定的最佳反應(yīng)體系對(duì)引物UBC 843（CT）8RA退火溫度進(jìn)行篩選試驗(yàn)，其余參數(shù)不變。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計(jì)分析

計(jì)分參照何正文等方法[12]，根據(jù)條帶的多少、特異性與清晰程度依次打分：條帶多而亮、清晰，記9分；最低分記1分；2次重復(fù)獨(dú)立計(jì)分。9個(gè)組合的分?jǐn)?shù)（2次重復(fù)）依次為：3、3；8、7；4、6；9、9；6、5；7、1；1、4；5、8；2、2。由圖1可見：第7號(hào)、第9號(hào)、第6號(hào)、第9號(hào)處理效果較差，背景深、條帶少，且條帶不整齊；第4號(hào)處理最好，2次重復(fù)擴(kuò)增條帶比較穩(wěn)定，條帶多且清晰。

2.2 各因素不同水平對(duì)PCR的影響

為確定最佳的PCR反應(yīng)體系，需要對(duì)各因素不同水平進(jìn)行多重比較。極差的大小表明該因素對(duì)PCR擴(kuò)增影響的強(qiáng)弱。由表2可以看出：引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響最強(qiáng)，其次是TaqDNA聚合酶，影響最弱的是dNTPs。正交試驗(yàn)擴(kuò)增的結(jié)果用MINITAB軟件進(jìn)行方差分析，由表3可知：方差分析與極差分析的結(jié)果比較一致；引物不同水平間差異在方差分析中達(dá)到顯著水平（P<0.05），其余因素在水平間差異不顯著。

2.2.1 Taq DNA聚合酶濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響 由表2可知，Taq DNA聚合酶濃度在該試驗(yàn)中是影響PCR擴(kuò)增的次要因素。由圖2可以看出：Taq DNA聚合酶在 1.00 U/25 μL 水平差異明顯，而在0.75 U/25 μL（1、4、7號(hào)處理）、1.50 U/25 μL（3、6、9號(hào)處理）2個(gè)水平差異不明顯；Taq 酶量為1.00 U/25 μL（2、5、8號(hào)處理）擴(kuò)增的條帶清晰，條帶豐富。綜合結(jié)果可知，1.00 U/25 μL為Taq酶最佳濃度，與劉藝平等的研究結(jié)果[13-14]一致。

2.2.2 Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響 圖2顯示：Mg2+濃度3個(gè)水平對(duì)PCR擴(kuò)增影響不明顯，Mg2+濃度為 2.0 mmol/L 時(shí)均分最大；Mg2+濃度為2.5 mmol/L時(shí)，均分呈下降趨勢。最終確定Mg2+的最佳濃度為2.0 mmol/L。

2.2.3 dNTPs濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響 從圖2可以看出：dNTPs濃度為0.15 mmol/L（1、6、8號(hào)處理）、0.25 mmol/L（3、5、7號(hào)處理）時(shí)，擴(kuò)增條帶少且不穩(wěn)定；dNTPs 濃度為 0.20 mmol/L 時(shí)，PCR擴(kuò)增均分最高，確定其為最佳dNTPs 濃度。

2.2.4 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響 本試驗(yàn)中影響PCR擴(kuò)增的主要因素是引物濃度（表2）。引物濃度為0.20、0.30 μmol/L時(shí)，均值差異不明顯；當(dāng)濃度為0.40 μmol/L（3、4、8號(hào)處理）時(shí)，均值達(dá)到最大（圖2）。因此，選擇引物最佳濃度為0.40 μmol/L，與李立升等研究結(jié)果[15-16]相同。

2.3 PCR擴(kuò)增退火溫度的確定

ISSR引物退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果影響很大。由圖3可見：當(dāng)退火溫度為47.6、48.6、49.6 ℃時(shí)，擴(kuò)增不穩(wěn)定且條帶少；當(dāng)退火溫度為50.6、51.6 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰且數(shù)量多、穩(wěn)定?？梢?，在ISSR-PCR擴(kuò)增中適當(dāng)提高退火溫度可

以增加特異性條帶，因此引物UBC 843的最適退火溫度為51.6 ℃。

2.4 最優(yōu)體系的確定和穩(wěn)定性驗(yàn)證

綜上所述，荷花品種最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。利用引物UBC 827在退火溫度為51.6 ℃的條件下進(jìn)行體系穩(wěn)定性檢測，圖4表明：體系穩(wěn)定、效果好，可用于荷花品種親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究。

3 討論與結(jié)論

正交設(shè)計(jì)可以克服傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)和完全組合設(shè)計(jì)不足，從復(fù)因子試驗(yàn)中挑選出有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn)，節(jié)約了成本、時(shí)間，具有齊整可比、均衡分散等優(yōu)點(diǎn)[6，17]。但是對(duì)正交設(shè)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行直觀分析有一定的主觀性和隨意性[18-19]，要么可以適當(dāng)增加試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，從而增加對(duì)PCR擴(kuò)增的評(píng)判次數(shù)，來減少打分誤差，使試驗(yàn)數(shù)據(jù)更可靠[4]，要么也可以借助分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

PCR擴(kuò)增結(jié)果受物種[4-5，7]、擴(kuò)增程序、多因子等綜合影響，退火溫度很小的變動(dòng)就會(huì)引起擴(kuò)增結(jié)果很大的變化。本試驗(yàn)中各因素對(duì)PCR擴(kuò)增的影響由強(qiáng)到弱為：引物濃度﹥Taq DNA聚合酶濃度﹥Mg2+濃度﹥dNTPs濃度，結(jié)果與任風(fēng)鳴等的研究結(jié)果[20]相似。而梨的正交試驗(yàn)[21]和李偉等對(duì)鎖陽的ISSR-PCR優(yōu)化研究[5]認(rèn)為，對(duì)PCR影響最關(guān)鍵的是Taq DNA聚合酶，其次是引物濃度。孫清信等研究表明，模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增影響最小[22-23]，對(duì)荷花品種模板DNA濃度進(jìn)行單因素優(yōu)化時(shí)也得到相似的結(jié)果，模板DNA濃度在20～80 ng/25 μL均能擴(kuò)增出條帶，且條帶清晰；但是如果模板DNA不純，則導(dǎo)致擴(kuò)增條帶少或無擴(kuò)增條帶[21，24]。出現(xiàn)這些差異要么與物種、引物特異性有關(guān)，要么與主觀評(píng)價(jià)有關(guān)。因此，為了更好地將正交設(shè)計(jì)廣泛應(yīng)用于研究中，既可以建立客觀的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，也可以提高分析結(jié)果的可信度。

綜合考慮后得出荷花品種最佳反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L Mg2+，0.20 mmol/L dNTPs，0.40 μmol/L 引物，20～80 ng 模板DNA，1.00 U Taq DNA聚合酶。該反應(yīng)體系在其他引物中擴(kuò)增獲得了清晰的條帶，為后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張行言. 中國荷花新品種圖志I[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2011：1-2.

[2]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[3]Syamkumar S，Sasikumar B. Molecular marker based genetic diversity analysis of Curcuma species from India[J]. Scientia Horticulturae，2007，112（2）：235-241.

[4]唐 輝，陳宗游，史艷財(cái)，等. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化地楓皮ISSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 中草藥，2013，44（5）：610-615.

[5]李 偉，劉廣達(dá)，陳 青，等. 鎖陽ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012（8）：135-140.

[6]明道緒. 生物統(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：286-287.

[7]王 軍，楊榮萍，洪明偉，等. 石榴SPAR-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化及驗(yàn)證[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28（3）：376-379.

[8]黃 宇，何天友，榮俊冬，等. 荷花ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2009，5（4）：284-288.

[9]孫祖霞，劉兆磊，陳素梅，等. 荷花SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與確立[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（6）：53-58.

[10]徐 君，李靜會(huì)，李 欣，等. 荷花ISSR引物篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：42-44.

[11]桂騰琴，喬愛民，孫 敏，等. 果梅基因組DNA提取方法的比較及ISSR分析[J]. 北方園藝，2008（4）： 212-215.

[12]何正文，劉運(yùn)生，陳立華，等. 正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J]. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：76-77.

[13]劉藝平，李 創(chuàng)，李 娜，等. 荷花遺傳多樣性的ISSR標(biāo)記分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，41（4）：139-146.

[14]孔德政. 荷花的民族植物學(xué)及河南地區(qū)品種資源研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：100-101.

[15]李立升. 21個(gè)荷花品種遺傳多樣性的ISSR分析[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：20-20.

[16]刁松鋒，邵文豪，姜景民，等. 多用途樹種無患子 ISSR-PCR 體系建立與檢測[J]. 廣西植物，2015，35（6）：899-904.

[17]桂騰琴，孫 敏，喬愛民. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化果梅ISSR反應(yīng)體系[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2009，26（1）：108-112.

[18]王彥華，侯喜林，徐明宇. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化不結(jié)球白菜ISSR反應(yīng)體系研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（5）：899-902.

[19]謝運(yùn)海，夏德安，姜 靜，等. 利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化水曲柳ISSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 分子植物育種，2005，3（3）：445-450.

[20]任風(fēng)鳴，胡開治，劉燕琴，等. 傳統(tǒng)中藥金錢草ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化研究[J]. 中國中藥雜志，2014，39（12）：2233-2238.

[21]桂騰琴，孫 敏，陸春連，等. 梨ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化研究[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，39（12）：37-42.

[22]孫清信，陳 堅(jiān)，張 輝，等. 紫云英ISSR引物的篩選及PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，13（5）：870-878.

[23]姜 靜，楊傳平，劉桂豐，等. 樺樹ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2003，22（3）：91-93.

[24]范海艷，曹福祥，彭繼慶，等. 博白大果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（4）：97-103.