基因的克隆、序列特征及時(shí)間特異性表達(dá)

李小玉+張曉峰+杜偉+聶浩+唐壯+班月圓+杜小龍+程嘉翎

摘要：SAUR是生長素早期響應(yīng)基因，能夠被生長素快速誘導(dǎo)表達(dá)，本研究從桑樹綠枝扦插的插穗基部皮層中克隆得到個(gè)桑樹SAUR家族基因，命名為MaSAUR2（GenBank登錄號(hào)：KC85288）。該基因序列全長 86 bp，ORF全長549 bp，編碼82個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為20 700，無信號(hào)肽與跨膜區(qū)域，在第82 aa至38 aa之間有個(gè)保守的SAUR-specific結(jié)構(gòu)域。桑樹綠枝插穗基部經(jīng)吲哚-3-乙酸（IAA）誘導(dǎo)處理，插穗基部皮層[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)水平在5 min內(nèi)顯著上升；在綠枝扦插生根過程中，不定根長出皮層時(shí)[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)量顯著升高。推測 MaSAUR2 參與了桑樹扦插過程中不定根的形成。

關(guān)鍵詞：桑樹；MaSAUR2基因；基因克?。恍蛄刑卣?；實(shí)時(shí)定量CR

中圖分類號(hào)： S8882；Q9432文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：002-302（204）2-0034-04

植物激素在調(diào)控植物生長發(fā)育中具有十分重要的作用。而生長素普遍存在于高等植物中，在植物頂端優(yōu)勢的保持、植物的向光性、側(cè)根與不定根的形成與發(fā)育、組織和器官的形成與發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。由生長素在短時(shí)間內(nèi)快速誘導(dǎo)且表達(dá)上調(diào)的基因，稱為生長素早期響應(yīng)基因，包括AUX/IAA、[WTBX][STBX]GH3[WTBZ][STBZ]和SAUR等3類[2]。在這3類生長素早期響應(yīng)基因家族中，能夠被生長素快速、強(qiáng)烈地誘導(dǎo)表達(dá)的是SAUR基因家族成員中的大多數(shù)基因[2]。SAUR基因編碼的 mRNAs，分子量在9 000～2 000之間[3]。在生長素處理的 2～5 min 之內(nèi)，這些mRNAs就會(huì)被很快合成[4-6]，這表明生長素在SAUR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

第個(gè)SAUR基因由McClure等于987年在大豆中首次發(fā)現(xiàn)[5]，隨后陸續(xù)從綠豆[7]、豌豆[8]、擬南芥[9]、煙草[0]、蘿卜、蘋果[2]、玉米[3]、水稻[4]、高粱[5]、白菜[6]、番茄以及馬鈴薯[6]中鑒定出一系列SAUR基因。其中擬南芥、水稻、高粱、白菜、番茄、馬鈴薯中分別有72、58、7、43、99、34個(gè)SAUR基因家族成員[2，6，4-6]。這些基因中大多數(shù)不含內(nèi)含子[6，6]，這可能便于其對(duì)外界快速作出應(yīng)答。盡管已從不同物種中鑒定或預(yù)測出許多SAUR基因，但目前只有它們中的一小部分功能已知。在大豆和玉米中，SAUR基因主要表達(dá)于延伸組織中[7-9]，說明SAUR基因在細(xì)胞伸長過程中有著特殊功能。有報(bào)道稱SAUR蛋白會(huì)在鈣離子存在條件下與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，說明其可能作為第二信使介導(dǎo)生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與鈣/鈣調(diào)蛋白之間的聯(lián)系[3]。在擬南芥中過量表達(dá)SAUR9-24[2]會(huì)造成植株的根呈波浪狀，子葉下胚軸變長，葉片變大，為SAUR是植物細(xì)胞伸長過程中的重要調(diào)節(jié)劑提供直接證據(jù)[20]。目前關(guān)于桑樹SAUR家族基因的研究還沒有報(bào)道。本研究根據(jù)Solexa mRNA測序技術(shù)構(gòu)建的 cDNA 文庫中獲得的序列設(shè)計(jì)引物，在桑樹綠枝插穗基部皮層中克隆得到條SAUR家族基因的cDNA序列，依據(jù)與其他物種同源序列對(duì)比結(jié)果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。對(duì)該序列的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。根據(jù)SAUR是植物細(xì)胞伸長過程中的重要調(diào)節(jié)劑[20]，推測該基因在扦插生根過程中發(fā)揮作用，而IAA是苗木扦插繁育中常用的生根誘導(dǎo)劑，因此使用熒光實(shí)時(shí)定量CR技術(shù)（real-time qRT-CR）檢測[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]在桑樹綠枝插穗基部經(jīng)IAA誘導(dǎo)后的表達(dá)變化，及其在綠枝扦插生根過程中不同時(shí)期的表達(dá)情況，以期對(duì)該基因的功能研究提供依據(jù)。

材料與方法

材料及主要試劑

供試桑樹品種為育7-，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所試驗(yàn)桑園。[2]RNAiso lus、RNAiso-mate for lant Tissue、rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser、SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）均購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、dNT、Taq聚合酶、Sanrep柱式DNA膠回收試劑盒、T-載體CR產(chǎn)物克隆試劑盒、一步法制備高效感受態(tài)細(xì)胞試劑盒、Ecoli DH5α均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR22[WTBZ][STBZ]基因的克隆

2引物設(shè)計(jì)委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司通過Solexa mRNA測序技術(shù)構(gòu)建桑樹旺盛生長期綠枝扦插生根過程的cDNA文庫。從中獲得段序列，經(jīng)Blast同源對(duì)比推斷為SAUR家族基因。根據(jù)所得序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物：上游引物S2-F（5′-ATGGAAATGAATCAAATG-3′）和下游引物S2-R（5′-TTAGAACTGATTTATGGC-3′）。

22桑樹總DNA、RNA提取及CR擴(kuò)增取0 g桑樹莖部皮層，參照CTAB法[2]提取基因組DNA。取0 g桑樹莖部皮層，使用RNAiso lus和RNAiso-mate for lant Tissue提取總RNA。電泳檢測RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測定DNA與RNA的D260 /D280值計(jì)算DNA與總RNA的純度與濃度。以總RNA為模板，Oligo（dT）為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將模板與引物在RNase free ddH2O中混勻，65 ℃中溫浴 5 min，冰浴30 s。在上述溶液中加入5×Reaction buffer 4 μL、20 U/μL RNase Inhibitor μL、0 mmol/L dNT Mix 2 μL和200 U/μL M-MuLV RT μL，混勻后42 ℃溫浴 40 min，再經(jīng)70 ℃溫浴0 min，之后冰浴保存，得第鏈cDNA。分別以DNA和第鏈cDNA為模板進(jìn)行CR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。CR擴(kuò)增產(chǎn)物用%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

3桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因和編碼蛋白質(zhì)序列分析

使用BioEdit和ORF Finder分別分析cDNA的堿基組成、開放閱讀框（ORF）。利用rotaram（http：//wwwexpasyorg/protparam/）和rotScale（http：//wwwexpasyorg/protscale/）分別在線分析目的基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和疏水性。使用TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）、Signal 4 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/Signal/）、CELLO v25 Server

（http：//cellolifenctuedutw/）[22]和SMART（http：//smartembl-heidelbergde/）分別對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位以及結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行預(yù)測。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測分別使用ROTER（http：//distillucdie/proter/）[23]和HYRE2（http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index）[24]來完成。同源性比對(duì)使用NCBI網(wǎng)站及ClustalX8多序列對(duì)比分析軟件進(jìn)行。利用MEGA5的Neighbor-oining（N）距離法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

4桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)時(shí)定量CR檢測

選取桑樹品種育7-母株上生長健壯、無病蟲害的當(dāng)年生均一的半木質(zhì)化綠枝枝條，剪成5 cm長的插穗，用 500 mg/L IAA溶液浸泡插穗基部，浸泡0 s后取出分別于2、5、0、30、60 min時(shí)取插穗基部 cm內(nèi)的皮層作[2]為試驗(yàn)材料，以未浸泡IAA的插穗作為對(duì)照，試驗(yàn)材料置于液氮中速凍，再于-86 ℃保存。利用RNAisolus和RNAisolus-mate for [3]lant Tissue試劑盒提取各個(gè)材料的總RNA。使用rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA第鏈。應(yīng)用SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）及ABI 7300熒光定量CR儀（ABI公司）進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量CR檢測。根據(jù)[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量CR引物F（5′-AGCGATGCAAGTCCATAGGC-3′）和R（5′-CTTCTTCATGAGTTGCGGCG-3′）。以桑樹Maactin（GenBank登錄號(hào)為：DQ785808）為內(nèi)參照，引物為AC-F（5′-GTTCCTGCTCGTAGTCCAA-3′）和AC-R（5′-CCATGCTATTCTCCGTCTC-3′）。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min；95 ℃變性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 3 s，45個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次。使用2-ΔΔCT處理數(shù)據(jù)。

5桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中表達(dá)的熒光實(shí)時(shí)定量CR檢測

于7月下旬，選取育7-生長健壯、無病害的半木質(zhì)化枝條剪成長約5 cm的插穗，應(yīng)用程嘉翎等的發(fā)明專利技術(shù)[25]進(jìn)行扦插試驗(yàn)。每2 d取插穗基部 cm內(nèi)的皮層（不含愈傷組織和新根）為試驗(yàn)材料，對(duì)[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根發(fā)育過程中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的克隆

從cDNA文庫中得到的[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列包括個(gè) 549 bp 的開放閱讀框（ORF）以及597 bp的5′端與40 bp的3′端部分序列。使用設(shè)計(jì)的引物分別以DNA和cDNA為模板進(jìn)行CR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示均為一條約550 bp的片段，與預(yù)期相符（圖）。將目的片段切膠回收，與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，各挑選4個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果與拼接對(duì)比序列結(jié)果一致。將該基因命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]（GenBank登錄號(hào)：KC85288）。

[FK（W3][TLXYtif][FK）]

22[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因及其編碼蛋白質(zhì)的序列分析

對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）表明：該cDNA全長 86 bp。該cDNA含有個(gè)549 bp的完整的開放閱讀框，編碼82個(gè)氨基酸殘基。所編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為 20 700，理論等電點(diǎn)pI為939。SAUR2蛋白疏水性的最小值為-3733，最大值為344；親水區(qū)域?yàn)?～59 aa，3～27 aa，42～57 aa等，疏水區(qū)域?yàn)?2～89 aa，28～34 aa，36～4 aa等。預(yù)測分析顯示，該蛋白質(zhì)沒有信號(hào)肽與跨膜區(qū)域，蛋白位于細(xì)胞核中。通過SMART預(yù)測，該蛋白質(zhì)第82 aa至38 aa之間有個(gè)保守的結(jié)構(gòu)功能域—SAUR-specific domain（SSD）[3]。利用ROTER預(yù)測可知，該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，α-螺旋占379%，β-折疊占8%，無規(guī)則卷曲占538%，為混合型蛋白。應(yīng)用HYRE2對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，因沒有SAUR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模板，預(yù)測結(jié)果的覆蓋率與可信性都較低，因此不采納。

23桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼氨基酸的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸序列，從NCBI選取部分同源氨基酸序列，利用Clustal X 20軟件進(jìn)行同源性多序列比對(duì)分析（圖3）。結(jié)果表明，該基因與毛果楊（opulus trichocarpa，X_002303770）、可可（Theobroma cacao，EOX99720）、桃（runus[KG2]persica，EM28880）、草莓亞種Vesca（Fragaria vesca subsp Vesca，X_00430）、麻風(fēng)樹[2]（atropha curcas，ADU5697）、蒺藜苜蓿[3]（Medicago truncatula，[FL）]

[FK（W5][TLXY2tif][FK）]

[FK（W23][TLXY3tif][FK）]

[FL（2K2]X_003602327）、蓖麻（Ricinus communis，X_00254869）[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸的同源性分別為63%、62%、63%、59%、53%、57%、56%。同時(shí)表明參與對(duì)比的7條同源序列在結(jié)構(gòu)域附近保守性強(qiáng)。

根據(jù)[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因推導(dǎo)的氨基酸序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載其他6個(gè)物種的氨基酸同源序列，使用MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果（圖4）表明，桑樹與桃、草莓亞種Vesca的親緣關(guān)系最近，聚為一類。

24實(shí)時(shí)定量CR檢測桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的誘導(dǎo)表達(dá)

桑樹插穗經(jīng)IAA誘導(dǎo)處理后，莖部皮層中的[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因被迅速活化，表達(dá)量明顯增加，5 min后表達(dá)量達(dá)到最高，之后表達(dá)量下降（圖5）。

25實(shí)時(shí)定量CR分析[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中的表達(dá)變化

在插穗生根過程中，[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)在基部膨大期維持在一個(gè)較低的水平，而在不定根形成期，該基因的表達(dá)量顯著上升（圖6）。

3結(jié)論

本試驗(yàn)從桑樹中克隆得到SAUR基因的cDNA序列，該序列全長 86 bp，包括549 bp的開放閱讀框、597 bp的5′UTR和40 bp的3′UTR，沒有內(nèi)含子。根據(jù)用Blast軟件與其他物種基因相比對(duì)的結(jié)果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。該基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)與其他物種SAUR蛋白相似度不是很高，這與其他物種中SAUR蛋白的同源性普遍不高是一致的[7]。該蛋[CM（25]白沒有信號(hào)肽與跨膜區(qū)域，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中，在第

植物激素在調(diào)控植物生長發(fā)育中具有十分重要的作用。而生長素普遍存在于高等植物中，在植物頂端優(yōu)勢的保持、植物的向光性、側(cè)根與不定根的形成與發(fā)育、組織和器官的形成與發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。由生長素在短時(shí)間內(nèi)快速誘導(dǎo)且表達(dá)上調(diào)的基因，稱為生長素早期響應(yīng)基因，包括AUX/IAA、[WTBX][STBX]GH3[WTBZ][STBZ]和SAUR等3類[2]。在這3類生長素早期響應(yīng)基因家族中，能夠被生長素快速、強(qiáng)烈地誘導(dǎo)表達(dá)的是SAUR基因家族成員中的大多數(shù)基因[2]。SAUR基因編碼的 mRNAs，分子量在9 000～2 000之間[3]。在生長素處理的 2～5 min 之內(nèi)，這些mRNAs就會(huì)被很快合成[4-6]，這表明生長素在SAUR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

第個(gè)SAUR基因由McClure等于987年在大豆中首次發(fā)現(xiàn)[5]，隨后陸續(xù)從綠豆[7]、豌豆[8]、擬南芥[9]、煙草[0]、蘿卜、蘋果[2]、玉米[3]、水稻[4]、高粱[5]、白菜[6]、番茄以及馬鈴薯[6]中鑒定出一系列SAUR基因。其中擬南芥、水稻、高粱、白菜、番茄、馬鈴薯中分別有72、58、7、43、99、34個(gè)SAUR基因家族成員[2，6，4-6]。這些基因中大多數(shù)不含內(nèi)含子[6，6]，這可能便于其對(duì)外界快速作出應(yīng)答。盡管已從不同物種中鑒定或預(yù)測出許多SAUR基因，但目前只有它們中的一小部分功能已知。在大豆和玉米中，SAUR基因主要表達(dá)于延伸組織中[7-9]，說明SAUR基因在細(xì)胞伸長過程中有著特殊功能。有報(bào)道稱SAUR蛋白會(huì)在鈣離子存在條件下與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，說明其可能作為第二信使介導(dǎo)生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與鈣/鈣調(diào)蛋白之間的聯(lián)系[3]。在擬南芥中過量表達(dá)SAUR9-24[2]會(huì)造成植株的根呈波浪狀，子葉下胚軸變長，葉片變大，為SAUR是植物細(xì)胞伸長過程中的重要調(diào)節(jié)劑提供直接證據(jù)[20]。目前關(guān)于桑樹SAUR家族基因的研究還沒有報(bào)道。本研究根據(jù)Solexa mRNA測序技術(shù)構(gòu)建的 cDNA 文庫中獲得的序列設(shè)計(jì)引物，在桑樹綠枝插穗基部皮層中克隆得到條SAUR家族基因的cDNA序列，依據(jù)與其他物種同源序列對(duì)比結(jié)果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。對(duì)該序列的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。根據(jù)SAUR是植物細(xì)胞伸長過程中的重要調(diào)節(jié)劑[20]，推測該基因在扦插生根過程中發(fā)揮作用，而IAA是苗木扦插繁育中常用的生根誘導(dǎo)劑，因此使用熒光實(shí)時(shí)定量CR技術(shù)（real-time qRT-CR）檢測[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]在桑樹綠枝插穗基部經(jīng)IAA誘導(dǎo)后的表達(dá)變化，及其在綠枝扦插生根過程中不同時(shí)期的表達(dá)情況，以期對(duì)該基因的功能研究提供依據(jù)。

材料與方法

材料及主要試劑

供試桑樹品種為育7-，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所試驗(yàn)桑園。[2]RNAiso lus、RNAiso-mate for lant Tissue、rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser、SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）均購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒、dNT、Taq聚合酶、Sanrep柱式DNA膠回收試劑盒、T-載體CR產(chǎn)物克隆試劑盒、一步法制備高效感受態(tài)細(xì)胞試劑盒、Ecoli DH5α均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR22[WTBZ][STBZ]基因的克隆

2引物設(shè)計(jì)委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司通過Solexa mRNA測序技術(shù)構(gòu)建桑樹旺盛生長期綠枝扦插生根過程的cDNA文庫。從中獲得段序列，經(jīng)Blast同源對(duì)比推斷為SAUR家族基因。根據(jù)所得序列的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物：上游引物S2-F（5′-ATGGAAATGAATCAAATG-3′）和下游引物S2-R（5′-TTAGAACTGATTTATGGC-3′）。

22桑樹總DNA、RNA提取及CR擴(kuò)增取0 g桑樹莖部皮層，參照CTAB法[2]提取基因組DNA。取0 g桑樹莖部皮層，使用RNAiso lus和RNAiso-mate for lant Tissue提取總RNA。電泳檢測RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測定DNA與RNA的D260 /D280值計(jì)算DNA與總RNA的純度與濃度。以總RNA為模板，Oligo（dT）為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將模板與引物在RNase free ddH2O中混勻，65 ℃中溫浴 5 min，冰浴30 s。在上述溶液中加入5×Reaction buffer 4 μL、20 U/μL RNase Inhibitor μL、0 mmol/L dNT Mix 2 μL和200 U/μL M-MuLV RT μL，混勻后42 ℃溫浴 40 min，再經(jīng)70 ℃溫浴0 min，之后冰浴保存，得第鏈cDNA。分別以DNA和第鏈cDNA為模板進(jìn)行CR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。CR擴(kuò)增產(chǎn)物用%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

3桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因和編碼蛋白質(zhì)序列分析

使用BioEdit和ORF Finder分別分析cDNA的堿基組成、開放閱讀框（ORF）。利用rotaram（http：//wwwexpasyorg/protparam/）和rotScale（http：//wwwexpasyorg/protscale/）分別在線分析目的基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和疏水性。使用TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）、Signal 4 Server（http：//wwwcbsdtudk/services/Signal/）、CELLO v25 Server

（http：//cellolifenctuedutw/）[22]和SMART（http：//smartembl-heidelbergde/）分別對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位以及結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行預(yù)測。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測分別使用ROTER（http：//distillucdie/proter/）[23]和HYRE2（http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index）[24]來完成。同源性比對(duì)使用NCBI網(wǎng)站及ClustalX8多序列對(duì)比分析軟件進(jìn)行。利用MEGA5的Neighbor-oining（N）距離法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

4桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)時(shí)定量CR檢測

選取桑樹品種育7-母株上生長健壯、無病蟲害的當(dāng)年生均一的半木質(zhì)化綠枝枝條，剪成5 cm長的插穗，用 500 mg/L IAA溶液浸泡插穗基部，浸泡0 s后取出分別于2、5、0、30、60 min時(shí)取插穗基部 cm內(nèi)的皮層作[2]為試驗(yàn)材料，以未浸泡IAA的插穗作為對(duì)照，試驗(yàn)材料置于液氮中速凍，再于-86 ℃保存。利用RNAisolus和RNAisolus-mate for [3]lant Tissue試劑盒提取各個(gè)材料的總RNA。使用rimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA第鏈。應(yīng)用SYBR remix Ex TaqTM（erfect Real Time）及ABI 7300熒光定量CR儀（ABI公司）進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量CR檢測。根據(jù)[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量CR引物F（5′-AGCGATGCAAGTCCATAGGC-3′）和R（5′-CTTCTTCATGAGTTGCGGCG-3′）。以桑樹Maactin（GenBank登錄號(hào)為：DQ785808）為內(nèi)參照，引物為AC-F（5′-GTTCCTGCTCGTAGTCCAA-3′）和AC-R（5′-CCATGCTATTCTCCGTCTC-3′）。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min；95 ℃變性5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 3 s，45個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次。使用2-ΔΔCT處理數(shù)據(jù)。

5桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中表達(dá)的熒光實(shí)時(shí)定量CR檢測

于7月下旬，選取育7-生長健壯、無病害的半木質(zhì)化枝條剪成長約5 cm的插穗，應(yīng)用程嘉翎等的發(fā)明專利技術(shù)[25]進(jìn)行扦插試驗(yàn)。每2 d取插穗基部 cm內(nèi)的皮層（不含愈傷組織和新根）為試驗(yàn)材料，對(duì)[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根發(fā)育過程中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的克隆

從cDNA文庫中得到的[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因序列包括個(gè) 549 bp 的開放閱讀框（ORF）以及597 bp的5′端與40 bp的3′端部分序列。使用設(shè)計(jì)的引物分別以DNA和cDNA為模板進(jìn)行CR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示均為一條約550 bp的片段，與預(yù)期相符（圖）。將目的片段切膠回收，與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，各挑選4個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果與拼接對(duì)比序列結(jié)果一致。將該基因命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]（GenBank登錄號(hào)：KC85288）。

[FK（W3][TLXYtif][FK）]

22[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因及其編碼蛋白質(zhì)的序列分析

對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）表明：該cDNA全長 86 bp。該cDNA含有個(gè)549 bp的完整的開放閱讀框，編碼82個(gè)氨基酸殘基。所編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為 20 700，理論等電點(diǎn)pI為939。SAUR2蛋白疏水性的最小值為-3733，最大值為344；親水區(qū)域?yàn)?～59 aa，3～27 aa，42～57 aa等，疏水區(qū)域?yàn)?2～89 aa，28～34 aa，36～4 aa等。預(yù)測分析顯示，該蛋白質(zhì)沒有信號(hào)肽與跨膜區(qū)域，蛋白位于細(xì)胞核中。通過SMART預(yù)測，該蛋白質(zhì)第82 aa至38 aa之間有個(gè)保守的結(jié)構(gòu)功能域—SAUR-specific domain（SSD）[3]。利用ROTER預(yù)測可知，該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，α-螺旋占379%，β-折疊占8%，無規(guī)則卷曲占538%，為混合型蛋白。應(yīng)用HYRE2對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，因沒有SAUR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模板，預(yù)測結(jié)果的覆蓋率與可信性都較低，因此不采納。

23桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼氨基酸的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸序列，從NCBI選取部分同源氨基酸序列，利用Clustal X 20軟件進(jìn)行同源性多序列比對(duì)分析（圖3）。結(jié)果表明，該基因與毛果楊（opulus trichocarpa，X_002303770）、可可（Theobroma cacao，EOX99720）、桃（runus[KG2]persica，EM28880）、草莓亞種Vesca（Fragaria vesca subsp Vesca，X_00430）、麻風(fēng)樹[2]（atropha curcas，ADU5697）、蒺藜苜蓿[3]（Medicago truncatula，[FL）]

[FK（W5][TLXY2tif][FK）]

[FK（W23][TLXY3tif][FK）]

[FL（2K2]X_003602327）、蓖麻（Ricinus communis，X_00254869）[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因編碼的氨基酸的同源性分別為63%、62%、63%、59%、53%、57%、56%。同時(shí)表明參與對(duì)比的7條同源序列在結(jié)構(gòu)域附近保守性強(qiáng)。

根據(jù)[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因推導(dǎo)的氨基酸序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載其他6個(gè)物種的氨基酸同源序列，使用MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果（圖4）表明，桑樹與桃、草莓亞種Vesca的親緣關(guān)系最近，聚為一類。

24實(shí)時(shí)定量CR檢測桑樹[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因的誘導(dǎo)表達(dá)

桑樹插穗經(jīng)IAA誘導(dǎo)處理后，莖部皮層中的[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因被迅速活化，表達(dá)量明顯增加，5 min后表達(dá)量達(dá)到最高，之后表達(dá)量下降（圖5）。

25實(shí)時(shí)定量CR分析[WTBX][STBX]SAUR2[WTBZ][STBZ]基因在綠枝扦插生根過程中的表達(dá)變化

在插穗生根過程中，[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]基因的表達(dá)在基部膨大期維持在一個(gè)較低的水平，而在不定根形成期，該基因的表達(dá)量顯著上升（圖6）。

3結(jié)論

本試驗(yàn)從桑樹中克隆得到SAUR基因的cDNA序列，該序列全長 86 bp，包括549 bp的開放閱讀框、597 bp的5′UTR和40 bp的3′UTR，沒有內(nèi)含子。根據(jù)用Blast軟件與其他物種基因相比對(duì)的結(jié)果，將其命名為[WTBX][STBX]MaSAUR2[WTBZ][STBZ]。該基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)與其他物種SAUR蛋白相似度不是很高，這與其他物種中SAUR蛋白的同源性普遍不高是一致的[7]。該蛋[CM（25]白沒有信號(hào)肽與跨膜區(qū)域，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中，在第