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    沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖及IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA表達(dá)的影響

    2015-03-23 02:57:45薩茹麗木其爾王翠芳包玲玲敖長金王思珍
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:沙蔥增殖率免疫調(diào)節(jié)

    薩茹麗,木其爾,王翠芳,包玲玲,敖長金*,王思珍

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,通遼 028000)

    沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖及IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達(dá)的影響

    薩茹麗1,木其爾1,王翠芳1,包玲玲1,敖長金1*,王思珍2

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,通遼 028000)

    本試驗(yàn)以綿羊外周血淋巴細(xì)胞為研究對象,研究沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率,IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表達(dá)量的影響,為全面揭示沙蔥黃酮的免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。試驗(yàn)采用MTT法研究沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響,使用RT-PCR法研究沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γ基因mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示,沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用,對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用,可上調(diào)IFN-γmRNA表達(dá),下調(diào)IL-4 mRNA表達(dá)。綜上,沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖及免疫調(diào)節(jié)活性的作用。

    沙蔥黃酮;淋巴細(xì)胞增殖;IL-2;IL-4;IFN-γ

    沙蔥又名蒙古韭,主要生長于我國西北部荒漠化草原,是一種抗寒抗旱能力極強(qiáng)的百合科蔥屬植物[1]。研究表明,沙蔥及其提取物在抗氧化[2-3]、抗菌及提高畜產(chǎn)品品質(zhì)[4-5]、改善家畜免疫機(jī)能[6-7]等方面具有較好的生物功效。沙蔥黃酮(AlliumMongolicumRegelFlavonoids,AMF)是由沙蔥嫩葉中分離得到的一種天然植物提取物[8]。趙春艷等研究表明,沙蔥黃酮具有較好的抗氧化活性[9]及免疫調(diào)節(jié)活性[10]。

    本試驗(yàn)欲通過體外試驗(yàn)觀察沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響,并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γmRNA表達(dá)的影響,旨在為沙蔥黃酮類化合物的深入研究與相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 原料與試劑

    沙蔥黃酮參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法由本實(shí)驗(yàn)室自制。

    羊外周血淋巴細(xì)胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn);胎牛血清、RPMI-1640為Gibico公司生產(chǎn);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、β-巰基乙醇、刀豆蛋白A(ConA)等均為Sigma公司產(chǎn)品;磷酸鹽緩沖液(PBS)為Hyclone 公司生產(chǎn);RNA iso plus(D9108B)、SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(DRR820A)、Prime Script@RT Master Mix Perfect Real Time (DRR036S)、DL2000 DNA Marker(D501A)、DL500 DNA Marker(D525A)、pMD 19-T Vector(D102A)等均購自大連寶生物工程有限公司。

    1.2 主要儀器

    HEPA class 100 CO2培養(yǎng)箱;BIOTEK Synergy H4型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀;ESCO AC2-4S1生物安全柜;Olympus IX71倒置相差顯微鏡;Nikon YS100普通光學(xué)顯微鏡公司;Bio-Rad iQ5 Multicolor 熒光定量PCR儀;TGRADIENT梯度PCR儀等。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 綿羊外周血淋巴細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[11]的方法,無菌采集健康蒙古綿羊頸靜脈血,血液采用肝素鈉抗凝。1 500 r·min-1離心10 min后去除血清,將血漿與PBS等比例混勻,取5 mL緩慢鋪在分裝于玻璃離心管的羊淋巴細(xì)胞分離液(4 mL)上,3 000 r·min-1離心40 min,中間白色霧狀層即為綿羊外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)層,取PBMC用PBS洗滌兩次,加入含10% FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h,收集未貼壁細(xì)胞并重懸于RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中,即得到綿羊外周血淋巴細(xì)胞。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色,確定細(xì)胞存活率>95%后,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)·mL-1,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,用于后續(xù)試驗(yàn)。

    1.3.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響 試驗(yàn)分為對照組和試驗(yàn)組,對照組為50 μL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液;試驗(yàn)組分為高、中、低計(jì)量組,分別為50 μL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入50 μL含不同濃度沙蔥黃酮的細(xì)胞培養(yǎng)液(10 mg沙蔥黃酮溶于10 mL RPMI-1640中,0.22 μm濾器過濾除菌后分別稀釋至200、100、50 μg·mL-1)于96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)板中,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù),37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)6、12、24、48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL,培養(yǎng)結(jié)束后用平板離心機(jī)2 000 r·min-1離心10 min,棄上清液,每孔加入150 μL DMSO,震蕩搖勻后570 nm處測定各孔吸光度值。

    1.3.3 沙蔥總黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

    1.3.3.1 試驗(yàn)分組與細(xì)胞處理:試驗(yàn)分為對照組與試驗(yàn)組,對照組為1 mL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液;試驗(yàn)組分為高、中、低劑量組,分別為1 mL綿羊外周血淋巴細(xì)胞懸液加入1 mL不同濃度沙蔥黃酮的細(xì)胞培養(yǎng)液(10 mg沙蔥黃酮溶于10 mL RPMI-1640中,0.22 μm濾器過濾除菌后分別稀釋至200、100、50 μg·mL-1)。按試驗(yàn)分組要求將各組細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔2 mL,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù),于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無菌離心管中,1 500 r·min-1離心10 min,收集沉淀。在所得細(xì)胞沉淀中加入4 mL PBS反復(fù)吹打混勻后1 500 r·min-1離心10 min,去掉上清,收集沉淀(此步驟重復(fù)2~3次)。

    1.3.3.2 總RNA的提?。喊凑誖NA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行總RNA提取。提取所得細(xì)胞總RNA樣品使用Synergy H4多功能酶標(biāo)儀測定其 A260 nm/A280 nm值,選擇A260 nm/A280 nm值為1.8~2.2的樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

    1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書并結(jié)合趙飛艷等[12]報(bào)道方法進(jìn)行。

    1.3.3.4 引物合成:β-actin、IL-2、IL-4、IFN-γ基因引物序列同趙飛艷等[12]所報(bào)道引物序列一致,由大連寶生物公司合成(表1)。

    1.3.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):用iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System對綿羊外周血淋巴細(xì)胞的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)液的組分與配制見表2。β-actin、IL-2、IL-4與IFN-γ基因的反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。

    表1 引物序列及產(chǎn)物長度

    Table 1 Primers sequence and product size

    引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsizeβ-actinforwardβ-actinreverseIL-2forwardIL-2reverseIL-4forwardIL-4reverseIFN-γforwardIFN-γreverseCCCATTGAGCACGGCATTGCAGGGGTGTTGAAGGTCTCTGTCTTGCATTGCACTAACTCTTGTTCTTTCATTGTGTTCCCCGTAGAATTGAGCTTAGGCGTATCTACAGGTACTCGTCTTGGCTTCATTCACAAATCTAACCTCAGAAAGCGGAAGAGCAGGCAGGAGAACCATTAC1858012281

    表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)液的組分與配制

    Table 2 The component of quantitative PCR reaction solution

    試劑Reagents使用量/μLUsageamountSYBRPremixEXTaqTMⅡ(2×)12.5PCRForwardPrimer(10μmol·L-1)1.0PCRReversePrimer(10μmol·L-1)1.0cDNA2.0ddH2O8.5Total25.0

    1.3.3.6 基因 mRNA 表達(dá)水平相對定量與分析:本試驗(yàn)采用比較閾值法對目的基因進(jìn)行相對定量分析[13]。反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)自動(dòng)將熒光信號強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為基因的Ct值,統(tǒng)計(jì)時(shí)對每個(gè)基因的3個(gè)重復(fù)取平均值記為Ct 值。目的基因的相對表達(dá)量可以根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算:2-ΔΔCt=2-[(試驗(yàn)組目的基因Ct-試驗(yàn)組管家基因Ct)-(對照組目的基因Ct-對照組管家基因Ct)]

    其中,2-△△Ct表示目的基因的相對mRNA 表達(dá)量。將對照組的2-△△Ct值設(shè)為1,各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)同對照組進(jìn)行比較定量分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

    2 結(jié) 果

    2.1 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響

    表3所示,隨著沙蔥黃酮濃度的增加各試驗(yàn)組與對照組相比,淋巴細(xì)胞增殖率呈逐漸上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為6h時(shí)各試驗(yàn)組淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于對照組(P<0.01),同時(shí)高、中劑量組淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于低劑量組(P<0.01);當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間由6h延長至12h時(shí)各試驗(yàn)組淋巴細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.01)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間由12h繼續(xù)延長至24h時(shí),低劑量組淋巴細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.01),中劑量組與高劑量組淋巴細(xì)胞增殖率無顯著變化(P>0.05)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長至48h時(shí),各組淋巴細(xì)胞增殖率與24h時(shí)淋巴細(xì)胞增殖率無顯著改變(P>0.05)。由此可知,沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用,且混合培養(yǎng)時(shí)間為12h時(shí)此作用最為明顯,后隨著時(shí)間的延長無顯著變化;并且可以看出中劑量沙蔥黃酮即濃度為100μg·mL-1時(shí)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用最好。

    2.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

    2.2.1 綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IFN-γ及β-actin熒光定量PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞中各基因影響的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線和熔解曲線見圖1~3,圖中a為基因擴(kuò)增曲線,b為基因熔解曲線,其中A為目的基因,B為內(nèi)參基因β-actin。由圖可知,各基因擴(kuò)增情況良好,擴(kuò)增曲線平滑,呈現(xiàn)典型的S型,熔解曲線為單一峰型,并且峰型比較銳利,說明各擴(kuò)增的目的基因片段長度一致,不含引物二聚體及其他雙鏈DNA污染,可用于相對定量分析。

    表3 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響

    Table 3 The effects of AMF on proliferation of lymphocytes in sheep

    組別Group6h12h24h48h對照組Control0.284±0.019aA0.305±0.035bA0.302±0.035aA0.301±0.048bA低劑量組(50μg·mL-1)Lowdose0.328±0.016aB0.361±0.037cB0.354±0.034bB0.352±0.012bB中劑量組(100μg·mL-1)Moderatedose0.350±0.004aC0.386±0.021bD0.381±0.037bC0.385±0.023bD高劑量組(200μg·mL-1)Highdose0.352±0.071aC0.372±0.011bC0.377±0.078bC0.374±0.035bC

    同行數(shù)據(jù)后肩注小寫字母不同表示數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01),同列數(shù)據(jù)后肩注大寫字母不同表示數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)

    The different lower case letters in the same row indicate significant difference(P<0.01),the different uppercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.01)

    圖1 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2基因qPCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.1 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-2 gene

    圖2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-4基因qPCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.2 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IL-4 gene

    圖3 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IFN-γ基因qPCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線(a)和熔解曲線(b)Fig.3 The amplification curve and dissolution curve of AMF to sheep peripheral blood lymphocyte’s IFN-γ gene

    2.2.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響 由表4可知各劑量組沙蔥黃酮對IL-2 mRNA的表達(dá)無顯著影響;各試驗(yàn)組IL-4 mRNA的表達(dá)量均極顯著低于對照組(P<0.01),且各濃度組間比較差異均為極顯著(P<0.01)。說明沙蔥黃酮具有下調(diào)綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA表達(dá)的作用,且這種下調(diào)作用與濃度呈正相關(guān)。比較各試驗(yàn)組對IFN-γmRNA表達(dá)的結(jié)果可知,各濃度沙蔥黃酮均可上調(diào)IFN-γmRNA的基因表達(dá),與對照組比較差異極顯著(P<0.01),高劑量組與中、低劑量組比較差異極顯著(P<0.01),中劑量組與低劑量組比較有升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。說明沙蔥黃酮對IFN-γmRNA表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用,且這種促進(jìn)作用與劑量呈正相關(guān)。

    表4 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

    Table 4 Effects of the AMF on sheep peripheral blood lymphocyte’sIL-2,IL-4 andIFN-γmRNA expression

    組別GroupIL-2IL-4IFN-γ對照組Control11a1a低劑量組(50μg·mL-1)0.994±0.0150.752±0.044b2.237±0.045b中劑量組(100μg·mL-1)1.087±0.0130.554±0.003c2.484±0.021bc高劑量組(200μg·mL-1)1.100±0.0030.144±0.005d3.394±0.174d

    同列數(shù)據(jù)肩注小寫字母不同表示數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)

    The different lower case letters indicate significant difference(P<0.01)

    3 討 論

    3.1 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖率的影響作用

    淋巴細(xì)胞增殖能力是反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的重要指標(biāo)之一[14],且淋巴細(xì)胞的增殖狀態(tài)與機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)成正相關(guān)[15]。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)因其所需時(shí)間較短、試驗(yàn)條件穩(wěn)定等優(yōu)勢已經(jīng)成為免疫增強(qiáng)藥物的初步篩選、活性強(qiáng)弱評定以及作用機(jī)理研究的首選方法[16]。諸多研究報(bào)道顯示,黃酮類化合物具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性,如楊秀松等研究報(bào)道金花葵粗黃酮具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用,可有效促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖、增加單核細(xì)胞吞噬指數(shù)[17]。徐璐等研究報(bào)道表明,黃芪總黃酮能顯著增強(qiáng)小鼠的免疫功能,可顯著提高小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能、血清溶血素水平,促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)[18]。辛歡歡等研究白花蛇舌草黃酮注射液對小鼠淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性時(shí)發(fā)現(xiàn),在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)白花蛇舌草黃酮可以有效促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的分泌[19]。除此之外大量研究表明,沙蔥及其提取物可促進(jìn)機(jī)體免疫機(jī)能,沙蔥多糖可以顯著提高綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖、具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著沙蔥黃酮濃度的增加與共同培養(yǎng)時(shí)間的延長,淋巴細(xì)胞增殖率呈逐漸上升后趨于平穩(wěn)的趨勢,表明沙蔥黃酮具有促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用,且混合培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)、添加劑量為100 μg·mL-1時(shí)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用較好。這可能是因?yàn)樯呈[黃酮中含有3′,4′-環(huán)氧基-7-O-5-甲氧基黃酮醇與7-O-5,4′-二甲氧基-3′-羥基黃酮等黃酮類物質(zhì)[20],這些黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)與雌激素類同,參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。除此之外沙蔥黃酮分子結(jié)構(gòu)中C2=C3雙鍵也是沙蔥黃酮具有免疫調(diào)節(jié)活性的原因之一[20]。

    3.2 沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)的影響

    細(xì)胞因子是指生物機(jī)體在炎癥與免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的一系列具有免疫調(diào)節(jié)活性的小分子多肽或蛋白質(zhì),而這些細(xì)胞因子均由其特定的免疫細(xì)胞表達(dá)分泌[21]。當(dāng)機(jī)體受到外來因素如病毒、細(xì)菌或其他病原微生物的侵害時(shí)機(jī)體會(huì)啟動(dòng)其天然免疫和特異性免疫效應(yīng)機(jī)制,而細(xì)胞因子就是介導(dǎo)這些效應(yīng)機(jī)制的分子。T細(xì)胞分泌和轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞因子是特異性免疫應(yīng)答的激活階段,而IL-2、IL-4和IFN-γ等是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子,其中,IL-2主要來源于T細(xì)胞以及T細(xì)胞系,具有誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生多種淋巴因子,促進(jìn)B細(xì)胞和殺傷性NK細(xì)胞的增殖與分化,促進(jìn)抗體合成等生物功效[22]。IL-4主要來源于CD4+T細(xì)胞,具有促進(jìn)T細(xì)胞生長、B細(xì)胞分化以及參與單核吞噬細(xì)胞的活化與抑制作用。IFN-γ也稱為免疫干擾素,具有直接促進(jìn)T、B細(xì)胞分化,激活NK細(xì)胞,增強(qiáng)TNF對內(nèi)皮細(xì)胞的作用,還具有增強(qiáng)細(xì)胞核體液免疫應(yīng)答,激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力除去病原微生物與癌變細(xì)胞等作用。黃酮類化合物作為植物天然有效成分具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用,且其免疫調(diào)節(jié)活性已經(jīng)成為黃酮類化合物研究的熱點(diǎn)問題。唐浩國等研究報(bào)道,竹葉黃酮在0~80 μg·mL-1可顯著提高小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞增殖率并且促進(jìn)脾細(xì)胞IFN-γ基因mRNA表達(dá),促進(jìn)T和B淋巴細(xì)胞的增殖與分化,顯著增強(qiáng)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用[23]。徐波等研究報(bào)道稱地錦草總黃酮可有效提高機(jī)體免疫機(jī)能,并有效促進(jìn)免疫相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ等基因的mRNA表達(dá)[24]。朱兆榮等研究報(bào)道,復(fù)方苦芩可有效增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能,同時(shí)能夠降低犬血清細(xì)胞因子IL-4含量及其mRNA表達(dá),升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA表達(dá)[25]。楊曉航等研究報(bào)道,黃芪總黃酮具有調(diào)節(jié)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠外周血細(xì)胞因子表達(dá)水平的作用[26]?;诒驹囼?yàn)研究結(jié)果認(rèn)為,沙蔥黃酮對綿羊外周血淋巴細(xì)胞具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。這種生物活性可能與其獨(dú)特的生物分子結(jié)構(gòu)有關(guān),其所含的3′,4′-環(huán)氧基-7-O-5-甲氧基黃酮醇與7-O-5,4′-二甲氧基-3′-羥基黃酮等黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中C2=C3結(jié)構(gòu)和類雌激素結(jié)構(gòu)等均是免疫增強(qiáng)結(jié)構(gòu)基團(tuán),這些基團(tuán)作用于淋巴細(xì)胞后,通過上調(diào)綿羊外周血淋巴細(xì)胞中IFN-γmRNA的表達(dá),下調(diào)IL-4 mRNA的表達(dá)起到有一定的體外免疫調(diào)節(jié)作用,但其具體分子信號通路以及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

    4 結(jié) 論

    基于上述研究結(jié)果,推測沙蔥黃酮發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的部分機(jī)制:通過促進(jìn)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖,上調(diào)IFN-γmRNA表達(dá),下調(diào)IL-4 mRNA表達(dá),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對綿羊的免疫調(diào)節(jié)活性。

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    (編輯 郭云雁)

    Effect ofAlliumMongolicumRegelFlavonoidson Lymphocyte Proliferation,mRNA Expression ofIL-2,IL-4,IFN-γin Peripheral Blood Lymphocyte of Sheep

    SA Ru-li1,MU Qi-er1,WANG Cui-fang1,BAO Ling-ling1,AO Chang-jin1*,WANG Si-zhen2

    (1.CollegeofAnimalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,InnerMongoliaUniversityfortheNationalities,Tongliao028000,China)

    In order to study the action mechanism ofAlliumMongolicumRegelFlavonoids(AMF) on immunological enhancement activity,the effects of AMF on lymphocyte proliferation and mRNA expression ofIL-2,IL-4 andIFN-γwere determined by MTT method and real-time fluorescent quantitation PCR assay.The peripheral blood lymphocyte of sheep was used in this study.The results showed that AMF could significantly enhance lymphocyte proliferation.AMF could significantly up-regulate mRNA expression ofIFN-γ,down-regulate mRNA expression ofIL-4,and have no significantly effect onIL-2 mRNA expression.The result indicate that AMF has immunoregulatory activity and could enhance lymphocyte proliferation.

    AlliumMongolicumRegelFlavonoids;lymphocyte proliferation;IL-2;IL-4;IFN-γ

    10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.024

    2014-09-05

    國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(31260558;31160474);“十二五”國家科技支撐計(jì)劃(2013BAD10B04)

    薩茹麗(1986-),女,內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟人,博士生,主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與畜產(chǎn)品品質(zhì)研究,E-mail:qisaruli@126.com

    *通信作者:敖長金,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究,E-mail:changjinao@aliyun.com

    S826;S813.3

    A

    0366-6964(2015)06-1063-08

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