單核細(xì)胞增生李斯特菌非編碼RNA rli87基因缺失株的構(gòu)建、鑒定及其生長特性初步研究

謝 堃，喬 軍*，孟慶玲，彭葉龍，趙海龍，馬 玉，陳 誠，才學(xué)鵬，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，動物疾病防控兵團(tuán)重點實驗室，石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046 )

單核細(xì)胞增生李斯特菌非編碼RNArli87基因缺失株的構(gòu)建、鑒定及其生長特性初步研究

謝 堃1，喬 軍1*，孟慶玲1，彭葉龍1，趙海龍1，馬 玉1，陳 誠1，才學(xué)鵬2，陳創(chuàng)夫1

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，動物疾病防控兵團(tuán)重點實驗室，石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046 )

擬構(gòu)建單核細(xì)胞增生李斯特菌(LM)非編碼RNArli87基因缺失株，對其進(jìn)行分子鑒定，分析rli87基因缺失對LM生長的影響。用融合PCR方法構(gòu)建LM-SB5rli87基因缺失突變體，并構(gòu)建pKSV7-Δrli87穿梭載體，將其轉(zhuǎn)化入LM-SB5感受態(tài)細(xì)胞，利用溫度(42 ℃)和氯霉素(10 μg·mL-1)的抗性雙重壓力來實現(xiàn)同源重組，篩選同源重組菌進(jìn)行分子鑒定，測定缺失株與母源野毒株37 ℃條件下生長曲線。結(jié)果顯示：PCR和測序結(jié)果證實成功獲得了LM-Δrli87重組菌。通過25代的連續(xù)傳代，PCR鑒定結(jié)果顯示，該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。與野毒株進(jìn)行對比，在37 ℃條件下缺失株與野毒株的生長差異不顯著(P>0.05)。非編碼RNArli87基因在37 ℃條件下對LM生長沒有明顯的調(diào)控作用。

rli87基因；LM感受態(tài)細(xì)胞；缺失株；生長特性；同源重組

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陽性致病菌，生存能力強，存在范圍廣[1]。LM主要通過消化道引起動物和人的急性感染，對畜牧業(yè)和人類健康造成了巨大的威脅，因此，LM被WHO列為四大食源性致病菌之一[2-3]。

在LM感染宿主的過程中需要眾多的毒力因子參與。參與LM侵染和胞內(nèi)寄生生活相關(guān)的毒力基因主要集中在LM致病島1(LIPI-1)和致病島2(LIPI-2) 2個區(qū)域中。LIPI-1含有6個基因，依次為prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB；LIP-2又稱為內(nèi)化素小島，主要編碼一些小分子的內(nèi)化素[4-5]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，LM非編碼ncRNA在調(diào)控其生長、基因表達(dá)、糖代謝、金屬離子轉(zhuǎn)運、生物膜形成、胞內(nèi)寄生及環(huán)境應(yīng)激過程中也扮演著重要的角色，其調(diào)控模式已經(jīng)成為LM調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的最重要作用方式之一[6]。根據(jù)ncRNAs的調(diào)控機制，LM ncRNAs可以分為3種：順式作用RNA(cis-acting RNAs，如核糖開關(guān))、反義RNA(anti-sense RNAs，asRNAs)和反式編碼的小RNA(trans-encoded small RNAs，sRNAs)。順式作用RNA位于mRNA的5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)或 3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)，既可以影響細(xì)菌的翻譯，也可影響轉(zhuǎn)錄，還可以影響到mRNA的穩(wěn)定性和折疊結(jié)構(gòu)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，sRNA通過與目的mRNA上短的、不連續(xù)的、互補的區(qū)域堿基互補配對來發(fā)揮作用，并且一種sRNA可以與多種mRNA相互作用。sRNA能夠抑制也能夠激活目的mRNA的翻譯，同時sRNA與目的mRNA頻繁的結(jié)合會導(dǎo)致mRNA被RNases快速的降解[9]。本研究用RNAStructure5.0生物信息學(xué)軟件對rli87二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其二級結(jié)構(gòu)中存在三個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，通過進(jìn)一步對比分析發(fā)現(xiàn)環(huán)上的序列與LM毒力島Ⅰ、毒力島Ⅱ上的獨立基因及環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因具有多個位點的非連續(xù)互補配對序列，因此推測rli87可能通過調(diào)節(jié)環(huán)境應(yīng)激基因的表達(dá)在LM毒力及環(huán)境應(yīng)激過程中發(fā)揮著調(diào)控作用。rli87基因?qū)儆趕RNA，然而目前有關(guān)rli87基因的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究應(yīng)用同源重組技術(shù)構(gòu)建rli87基因缺失株LM-Δrli87，研究rli87缺失對LM生長的影響，以期為進(jìn)一步揭示rli87在LM致病性和環(huán)境應(yīng)激能力的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及試劑

LM-SB5野毒株由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院分離，分離自發(fā)病綿羊腦組織，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后由石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室保存。TaqplusDNA聚合酶、Pfu DNA Polymerase、dNTPs、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自上海生物工程公司。T4 DNA連接酶、DNA Marker、pMD19-T載體購自大連TaKaRa公司。細(xì)菌基因組提取試劑盒購自諾維森公司。限制性核酸內(nèi)切酶(KpnⅠ、PstⅠ)購自Promega公司，pKSV7穿梭質(zhì)粒由揚州大學(xué)朱國強博士饋贈。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank登錄的LM-EGD基因組序列(登錄號：AL591824)，用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，選擇保守區(qū)域，用Primer 5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增上游同源臂引物P1-P2，下游同源臂引物P3-P4。融合PCR的引物為P1-P4，全長1 095 bp。在P1-P4 引物的5′端加酶切位點和保護(hù)性堿基。設(shè)計檢測引物P5-P6，全長584 bp(表1)。引物由上海生物工程公司合成。

1.3Δrli87基因缺失融合片段的構(gòu)建

提取LM-SB5株基因組，先用引物P1-P2 和P3-P4分別擴(kuò)增上、下游同源臂，然后以P1-P4為引物，用SOE-PCR技術(shù)融合上、下游同源臂。先用Pfu DNA Polymerase對上、下游同源臂互補延伸10個循環(huán)，再加入P1-P4引物各0.4 μL擴(kuò)增融合片段的全長。采用20 μL反應(yīng)體系(上、下游同源臂各2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 dNTPs 2 μL，水11.2 μL，Pfu DNA Polymerase 0.3 μL)。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，得到Δrli87基因缺失的融合片段。回收融合片段，與pMD19-T載體連接，用PCR和酶切方法篩選pMD19-T-Δrli87重組質(zhì)粒。

1.4 pKSV7-Δrli87穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

將pMD19-T-Δrli87和pKSV7質(zhì)粒分別用KpnⅠ、PstⅠ雙酶切，酶切后分別回收條帶。將酶切回收的融合片段與pKSV7質(zhì)粒于4 ℃冰箱連接過夜，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，用PCR和酶切方法驗證pKSV7-Δrli87質(zhì)粒。

表1 本研究中用到的PCR引物

Table 1 PCR primers used in this study

引物Primers序列(5'-3')Sequence產(chǎn)物/bpAmplifiedlengthsP1P2GGGGTACCAACTTAGACAAGATGACGCAGCCAACATTTATTAACAAAATCTGTTATAGTTCTTCTGCAACCC518P3P4GGGTTGCAGAAGAACTATAACAGATTTTGTTAATAAATGTTGGAACTGCAGACTCTATCTCGCAATGTAAGC577P5P6AGAACTAGTGGTTTTCCCCAAATAAATACGCACATC584

1.5 LM-Δrli87缺失株的構(gòu)建、篩選與鑒定

按文獻(xiàn)[6]制備LM感受態(tài)細(xì)胞。取100 μL感受態(tài)細(xì)胞加入8 μL pKSV7-Δrli87質(zhì)粒，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)條件：2.5 kV·cm-1、0.5 ms。電轉(zhuǎn)化后，冰浴10 min，向電擊杯中加入800 μL BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)(200 r·min-1)3 h。將電轉(zhuǎn)后的菌液涂在含有氯霉素(10 μg·mL-1)的BHI固體培養(yǎng)基上，通過PCR鑒定獲得的陽性菌；在氯霉素抗性(10 μg·mL-1)的BHI液體培養(yǎng)基、42 ℃條件下傳代，以P5-P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行測序。

1.6 LM-Δrli87缺失株遺傳穩(wěn)定性的檢測

將構(gòu)建的LM-Δrli87接種在BHI液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫?fù)u床連續(xù)培養(yǎng)傳25代，提取缺失株的基因組DNA，用引物P5-P6做PCR擴(kuò)增，檢測LM-Δrli87缺失株遺傳穩(wěn)定性。

1.7 LM-Δrli87缺失株生長特性初步研究

將野毒株SB5和缺失株LM-Δrli87在平板上劃線培養(yǎng)，然后挑取單菌落分別接種在10 mL BHI液體培養(yǎng)基中，在37 ℃ 180 r·min-1條件下培養(yǎng)12 h，OD600 nm≈0.6時，將野毒株和缺失株菌液以1∶100的比例接入BHI液體培養(yǎng)基，于37 ℃ 180 r·min-1條件下培養(yǎng)，每2 h從培養(yǎng)液中吸取菌液200 μL，測定不同時間點OD600 nm值，繪制生長曲線，進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以LM SB5基因組為模板，P1-P2引物擴(kuò)增得到了大小與預(yù)期518 bp相符的上游同源臂；P3-P4 引物擴(kuò)增得到了大小與預(yù)期577 bp相符的下游同源臂(圖1)。用P1-P4引物對上、下游同源臂進(jìn)行融合擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增的融合片段與預(yù)期的1 095 bp相符(圖2)。pMD19-T-Δrli87重組質(zhì)粒PCR和酶切鑒定均正確，目的條帶為1 095 bp(圖3)。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.上、下游同源臂產(chǎn)物；2.陰性對照；3.下游同源臂產(chǎn)物;4.上游同源臂產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker;1.The product of upstream and downstream homologous arms;2.Negative control;3.The downstream homologous arm products;4.The upstream homologous arm products圖1 同源臂基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 Homology arm gene amplified by PCR

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、4、5、7、8.擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker；1,2,4,5,7,8.The amplification products圖2 重疊延伸PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Amplification products by overlap extension

M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4.酶切產(chǎn)物M.DL5000 DNA marker；1-4.The products from pMD19-T-Δrli87圖3 pMD19-T-Δrli87的酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD19-T-Δrli87 by enzyme digestion

2.2 pKSV7-Δrli87質(zhì)粒的鑒定

pKSV7-Δrli87質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性菌，做菌液PCR檢測，提取陽性菌的質(zhì)粒，PstⅠ、KpnⅠ對質(zhì)粒同步雙酶切。酶切產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果與預(yù)期片段1 095 bp相符(圖4)。

M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3～7.雙酶切產(chǎn)物M.DL5000 DNA marker；3-7.The products from pKSV7-Δrli87圖4 pKSV7-Δrli87的酶切鑒定Fig.4 Identification of pKSV7-Δrli87 by enzyme digestion

2.3 LM-Δrli87缺失株的PCR鑒定

用引物P5和P6對疑為重組缺失菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。未重組的LM擴(kuò)增的產(chǎn)物為783 bp，而重組的為584 bp，電泳結(jié)果顯示與預(yù)期結(jié)果相符(圖5)。584 bp片段測序后發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)缺失了rli87基因，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了重組LM-Δrli87菌株。

2.4 LM-Δrli87缺失株遺傳穩(wěn)定性鑒定

連續(xù)傳代25代后的缺失株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，缺失菌株產(chǎn)物為584 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，說明缺失株在BHI中穩(wěn)定傳代，缺失株具有很好的遺傳穩(wěn)定性。(圖6)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～5.重組菌的PCR產(chǎn)物;6.SB5陰性對照.M.DL2000 DNA marker;1-5.PCR products;6.Negative control圖5 LM-Δrli87重組菌的PCR鑒定Fig.5 PCR identification of recombinant LM-Δrli87

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～10.重組菌PCR產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker;1-10.The PCR products圖6 LM-Δrli87重組菌遺傳穩(wěn)定性PCR鑒定Fig.6 Identification of genetic stability of recombinant LM-Δrli87 by PCR

2.5 LM-Δrli87缺失株生長特性

圖7是野毒株和缺失株在37 ℃溫度條件下的生長情況。在37 ℃條件下，野毒株和缺失株培養(yǎng)差異不顯著(P>0.05)，表明rli87基因在37 ℃條件下對LM的生長速度沒有明顯的調(diào)控作用。

圖7 LM-Δrli87和LM-EGD菌株在37 ℃條件下的生長曲線Fig.7 Growth curves of LM-Δrli87 and LM-EGD at 37 ℃

3 討 論

迄今為止，在李斯特菌中已被證實的sRNA有113個，其中有88個同時存在于致病性李斯特菌與非致病性李斯特菌，25個只存在于LM中。S.Sievers等對依賴于伴侶分子蛋白Hfq的ncRNA LhrC 進(jìn)行了研究，構(gòu)建了LhrC基因缺失株，通過與母源株比較，證實LM ncRNA LhrC在0.07%膽酸鹽環(huán)境應(yīng)激中扮演了重要角色[10]。雖然對于sRNAs功能的研究數(shù)據(jù)有限，最近一些sRNAs，包括rliB、rli31、rli33-1和rli50被證明在細(xì)菌毒力和細(xì)菌生長的過程中發(fā)揮了調(diào)控作用[11]。越來越多的研究還發(fā)現(xiàn)，ncRNA 在LM生長、蔗糖代謝、群體感應(yīng)和毒力等方面可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[12]，其調(diào)控模式已經(jīng)成為LM調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中最重要的作用方式之一。

同源重組(homologous recombination)是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞染色體上的方法，因為在該座位有與導(dǎo)入基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換有缺陷的基因片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的[13-14]。位點特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列(即特異性位點，又稱附著點，attachment site，att)和位點特異性的蛋白因子(即重組酶)參與催化[15]。重組酶僅能催化特異性位點間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。研究證實，在同源重組的染色體整合中，同源片段越長，整合頻率越高，通常情況下，大于300 bp的同源片段可有效實現(xiàn)同源重組[16]。因此，本研究擴(kuò)增了rli87基因上游和下游共584 bp的基因序列作為同源片段，從而提高外源基因在LM染色體中的整合效率。同時在引物序列中引入2個酶切位點(KpnⅠ、PstⅠ)，作為同源重組載體的多克隆位點，可根據(jù)研究的需要插入目的基因在LM染色體上進(jìn)行同源重組。

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌胞內(nèi)是構(gòu)建缺失株的重要環(huán)節(jié)之一。目前，實驗室中最常用的轉(zhuǎn)化方法有熱擊法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電穿孔法。對于LM這樣的革蘭陽性菌，由于細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，熱擊法很難對其起作用，因此轉(zhuǎn)化常用電穿孔法，且電穿孔法便于使用[17-18]。然而，質(zhì)粒的濃度、電壓、感受態(tài)細(xì)胞的特性、緩沖液的濃度等都是影響電轉(zhuǎn)化效率的重要因素。感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)菌濃度在一定規(guī)范內(nèi)，細(xì)菌濃度越高，轉(zhuǎn)化效率就越高，兩者呈正相關(guān)。電場強度是影響電轉(zhuǎn)化效率的主要因素，時間太短或太長均會使轉(zhuǎn)化效率降低[6，19]。在本研究的電轉(zhuǎn)試驗中，對于電轉(zhuǎn)的條件進(jìn)行了大量的摸索，獲得具有良好遺傳穩(wěn)定性的LM-Δrli87。

本研究運用RNAStructure 5.0生物信息學(xué)軟件對rli87二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其二級結(jié)構(gòu)中存在三個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，通過進(jìn)一步對比分析發(fā)現(xiàn)環(huán)上的序列與LM毒力島Ⅰ、毒力島Ⅱ上的毒力基因及環(huán)境適應(yīng)因子具有多個位點的非連續(xù)互補配對序列，因此推測rli87可能通過調(diào)控環(huán)境適應(yīng)因子相關(guān)基因的表達(dá)在LM不同環(huán)境應(yīng)激過程有著調(diào)控影響。通過對比缺失株和野毒株的生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在37 ℃條件下，兩株菌的生長情況沒有顯著差異，提示rli87基因在37 ℃條件下對LM的生長情況沒有明顯的調(diào)控作用。有關(guān)rli87在LM環(huán)境適應(yīng)及毒力調(diào)控中的作用，尚需進(jìn)一步研究。

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(編輯 白永平)

Construction，Identification of ncRNArli87 Gene Deletion StrainsListeriamonocytogenesand Its Growth Characteristics

XIE Kun1，QIAO Jun1*，MENG Qing-ling1，PENG Ye-long1，ZHAO Hai-long1，MA Yu1，CHEN Cheng1，CAI Xue-peng2，CHEN Chuang-fu1

(1.KeyLaboratoryofPreventionandControlofAnimalDisease，CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832003，China；2.KeyLaboratoryofNationalVeterinaryEtiologicalBiology，LanzhouVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Lanzhou730046，China)

In this study，non-coding RNArli87 gene deletion strain of LM was constructed and identified，and growth characteristics of deletion strain was studied.Therli87 gene deletion mutant was constructed by fusion PCR method，and then pKSV7-Δrli87 shuttle vector was constructed，which was transformed into competent cells LM-SB5.Homologous recombination was conducted using temperature (42 ℃) and chloramphenicol (10 μg·mL-1) resistance to achieve therli87 gene deletion strain，and growth curves of wild strain and deletion strain were assayed at 37 ℃.The PCR and sequencing results confirmed that LM-Δrli87 was successfully obtained.PCR identification results showed that the deletion strain has good genetic stability through 25 generations of continuous passage.Comparison with the wild strain，there was no significant difference (P>0.05) in growth between deletion mutant and wild strain at 37 ℃.The results suggest thatrli87 gene did not play significant role in regulatory growth under the conditions of 37 ℃.

rli87 gene；Listeriamonocytogenes；deletion strain；growth characteristics；homologous recombination

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.016

2014-09-01

國家國際科技合作專項(2014DFR31310)；國家自然科學(xué)基金(30960274；31360596)

謝 堃(1990-)，女，碩士生，主要從事病原分子生物學(xué)研究，E-mail：xiekuns@gmail.com

*通信作者：喬 軍，Tel：+86-993-2055036；E-mail：qj710625@163.com

S852.61

A

0366-6964(2015)06-0998-06