復(fù)方頭孢泊肟酯納米乳的研制及其藥效與安全性研究

劉 岳，李夢(mèng)云，鄭 寅，高 嫻，歐陽(yáng)五慶，楊鳴琦

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

復(fù)方頭孢泊肟酯納米乳的研制及其藥效與安全性研究

劉 岳，李夢(mèng)云，鄭 寅，高 嫻，歐陽(yáng)五慶*，楊鳴琦*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

為研究頭孢泊肟酯與牛至油在納米水平的聯(lián)合藥效，首次制備復(fù)方頭孢泊肟酯納米乳并進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)及急性毒性研究。在傳統(tǒng)納米乳制備方法篩選初步處方基礎(chǔ)上，采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)法確定最優(yōu)處方。以L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以抑菌圈直徑和納米乳穩(wěn)定常數(shù)Ke為考察指標(biāo)，選擇頭孢泊肟酯和牛至油質(zhì)量分?jǐn)?shù)比(A)、納米乳水相pH(B)、乳化溫度(C)作為考察因素；體外抑菌試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法；急性毒性試驗(yàn)采用最大耐受劑量法并進(jìn)行了組織病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示：針對(duì)致病性大腸桿菌、沙門菌最優(yōu)處方為頭孢泊肟酯0.33%、牛至油2.67%、1，2-丙二醇1.13%、EL-40 22.51%、蒸餾水73.36%，納米乳pH值為6.17；與原料藥相比，受試藥物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度差異顯著(P<0.05)；小鼠經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量大于1 800 mg·kg-1，為低毒級(jí)藥物，無腎、腸毒性，但可引起肝輕微病理?yè)p傷。結(jié)果表明，牛至油在納米水平提高了致病性大腸桿菌、沙門菌、奇異變形桿菌、巴氏桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌對(duì)頭孢泊肟酯敏感性。

頭孢泊肟酯；牛至油；納米乳

頭孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil，CFP)作為口服，廣譜，第三代頭孢菌素類抗生素被廣泛應(yīng)用于治療上呼吸道及尿路感染。130 mg頭孢泊肟酯片劑口服(相當(dāng)于100 mg頭孢泊肟)在人體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度僅為50%。糞便中頭孢泊肟酯僅為口服劑量的0.5%，這表明CFP作為酯類前體藥物在腸腔發(fā)生了水解。研究表明CFP被腸壁酯酶水解為親脂性差的活性代謝產(chǎn)物頭孢泊肟，后者無法穿過生物膜，不利于腸道吸收，這被認(rèn)為是CFP生物利用度較低主要原因之一；另外，頭孢泊肟酯在水中極微溶解(400 μg·mL-1)，這嚴(yán)重影響了腸腔對(duì)藥物的吸收[1-2]。

P.D.Preshita等[3]指出納米技術(shù)為口服給藥領(lǐng)域帶來革命性變化，尤其對(duì)水溶性差和酶穩(wěn)定性弱的口服藥物效果顯著。為有效阻止腸壁酯酶水解CFP并增加CFP在水中的溶解度，本試驗(yàn)綜合納米乳和頭孢泊肟酯優(yōu)勢(shì)，采用傳統(tǒng)納米乳制備方法篩選出初步處方，采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到抑菌效果好且穩(wěn)定性高的最優(yōu)納米乳處方，通過比較發(fā)現(xiàn)牛至油(Origanum oil，OR)顯著降低了CFP對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌(G+)和革蘭陰性菌(G-)的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)，故本研究擬將CFP和OR制備成復(fù)方納米乳，以提高其抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 儀器

BS214S電子天平，德國(guó)Satorius公司生產(chǎn)；JEM-1230型電子透射顯微鏡，日本JEOL公司生產(chǎn)；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì)，島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司生產(chǎn)。 Zetasizer Nano ZS型激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑和藥品

頭孢泊肟酯原料藥，湖北恒碩化工有限公司，純度99%；牛至油原料藥，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%；吐溫-80(Tween-80)，天津市登封化學(xué)試劑廠，化學(xué)純，批號(hào)：20121008；聚氧乙烯蓖麻油-40(EL-40)，批號(hào)：12120416；聚氧乙烯氫化蓖麻油-40(RH-40)，上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司，化學(xué)純，批號(hào)：210033；1，2-丙二醇(批號(hào)：3101885)，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純。

1.3 菌種

致病性大腸桿菌、沙門菌、奇異變形桿菌、巴氏桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 CFP-OR-NE處方初步篩選及確定

油相：預(yù)試驗(yàn)參照參考文獻(xiàn)[4]方法確定CFP在OR中的溶解度；表面活性劑：參考文獻(xiàn)[5]篩選最優(yōu)表面活性劑；增溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定：為進(jìn)一步提高納米乳對(duì)頭孢泊肟酯的載藥量，根據(jù)頭孢泊肟酯的性質(zhì)，選用1，2-丙二醇作為增溶劑，考察在體系中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1，2-丙二醇(1%、5%、10%)對(duì)納米乳形成的影響。

根據(jù)上述篩選結(jié)果，將配方量的OR、1，2-丙二醇充分混合后，加入配方量的CFP，不斷攪拌，待CFP完全溶解后，加入配方量的最佳表面活性劑，混合均勻后，逐滴加入配方量蒸餾水，直至體系經(jīng)相變后最終稀薄且流動(dòng)性如水一樣時(shí)即篩選出CFP-OR-NE初步處方。

1.5 多指標(biāo)正交試驗(yàn)篩選CFP-OR-NE最優(yōu)處方

由預(yù)試驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[1，6]可知影響納米乳抑菌效果和穩(wěn)定性的因素有CFP與OR質(zhì)量分?jǐn)?shù)比(A)、水相pH(B)、乳化溫度(C)，因素水平見表1。依據(jù)表1制備9個(gè)樣品，編為試驗(yàn)號(hào)1～9，以9個(gè)納米乳分別對(duì)雞大腸桿菌和賽鴿仙臺(tái)沙門菌抑菌圈直徑、各納米乳穩(wěn)定常數(shù)Ke為評(píng)價(jià)指標(biāo)；參照文獻(xiàn)[7]，采用活菌平板計(jì)數(shù)法對(duì)菌液濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)。各所配菌液用生理鹽水稀釋為105cfu·mL-1備用。

1.5.1 抑菌圈直徑測(cè)量 取100 μL稀釋好的菌液(105cfu·mL-1)在普通平板上均勻涂布后，在平板上均勻打3個(gè)孔，每次取200 μL納米乳打入孔內(nèi)，置于4 ℃冰箱待藥液擴(kuò)散24 h，次日取出平板置于37 ℃下培養(yǎng)24 h用直尺量取抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3次。藥物對(duì)照為3%頭孢克肟(cefixime，CFM)，后者與CFP同為第三代口服頭孢菌素類，劑量及步驟同上。

表1 因素水平

Table1 Orthogonal factors and levels

水平Levels因素FactorsCFP∶OR(A)水相pH(B)pHofaqueousphase乳化溫度/℃(C)Emulsionizingtemperature11∶11.22521∶43.03031∶86.835

1.5.2 納米乳穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定 乳劑物理穩(wěn)定性常數(shù)計(jì)算公式如下：Ke=|A0-A|/A×100%。取2 mL納米乳，4 000 r·min-1離心10 min，取最下層液體100 μL，試驗(yàn)號(hào)1～3稀釋至含CFP/OR 20 μg·mL-1，試驗(yàn)號(hào)4～9稀釋至含OR 30 μg·mL-1，以水為空白在納米乳最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A；同法不經(jīng)離心直接測(cè)定A0值。重復(fù)3次。

1.6 MIC和MBC測(cè)定

根據(jù)1.5篩選出的最優(yōu)處方制備CFP-OR-NE，用蒸餾水稀釋至含CFP 512 μg·mL-1備用；參考文獻(xiàn)[8]方法用60%無水乙醇溶解并稀釋CFP、OR及藥物對(duì)照頭孢克肟至512 μg·mL-1備用。采用二倍稀釋法：在96微孔板第1孔加200 μL培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，第2孔至第12孔依次加100 μL培養(yǎng)基后，在第2孔加100 μL藥液反復(fù)吹打混勻后移取100 μL至第3孔依次倍比稀釋至第11孔，從第11孔取出100 μL藥液棄去，第12孔再加100 μL菌液作陽(yáng)性對(duì)照。各藥液各菌種重復(fù)3次；將所有完全清晰無細(xì)菌生長(zhǎng)孔培養(yǎng)液分別接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)不超過5個(gè)的最后一個(gè)平板對(duì)應(yīng)的96孔板藥液濃度為該藥的MBC。

1.7 CFP-OR-NE質(zhì)量評(píng)價(jià)

將CFP-OR-NE于4 000 r·min-1離心30 min，觀察是否有渾濁、分層及藥物析出等現(xiàn)象；將CFP-OR-NE分別于-20 ℃、4 ℃、室溫和60 ℃下保存，于1、3、6個(gè)月后取樣觀察是否存在上述現(xiàn)象；納米乳類型鑒別參照文獻(xiàn)[7]方法；光穩(wěn)定性、形態(tài)觀察、粒徑分析及Zeta電位測(cè)定試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9]；長(zhǎng)期試驗(yàn)，將CFP-OR-NE在(25±2) ℃相對(duì)濕度為60%±5%條件下放置12個(gè)月，于0、3、6、9、12個(gè)月觀察和取樣，觀察性狀并監(jiān)測(cè)CFP和OR含量，分別建立兩者含量—時(shí)間回歸方程，計(jì)算藥物有效期。

1.8 安全性評(píng)價(jià)

1.8.1 預(yù)試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康小鼠，設(shè)10、100、1 000 mg·kg-13個(gè)劑量組，各以2只健康小鼠預(yù)試，雌雄各半。根據(jù)24 h內(nèi)死亡情況，估計(jì)LD50的可能范圍，確定正式試驗(yàn)的劑量組。

1.8.2 最大耐受劑量法(MTD試驗(yàn)) 健康小鼠20只，雌雄各半，觀察3～5 d后，給予各小鼠最大灌胃容量0.4 mL·20 g-1，1日3次，連續(xù)觀察14 d。

1.8.3 組織病理學(xué)檢查 14 d后迅速解剖1.8.2給藥小鼠，取其肝、腎、腸等組織塊，10%中性福爾馬林溶液(3.7%～4%中性甲醛)固定，4 ℃保存，常規(guī)制石蠟切片，HE染色。

1.9 納米乳測(cè)定方法的建立

1.9.1 試驗(yàn)原理及測(cè)定波長(zhǎng)的確定 參照文獻(xiàn)[10]以雙波長(zhǎng)紫外分光光度法為基本原理，采用等吸收點(diǎn)法確定CFP的測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)；參照文獻(xiàn)[11]以三波長(zhǎng)紫外分光光度法為基本原理，以計(jì)算法確定OR測(cè)定組合波長(zhǎng)。

1.9.2 供試液的制備 準(zhǔn)確稱取CFP原料藥50 mg，加入1 mL乙腈，再用0.1 mol·L-1稀鹽酸稀釋至100 mL，得到500 μg·mL-1CFP儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取1 g OR，加入100 mL無水乙醇溶解即制得500 μg·mL-1OR儲(chǔ)備液；制備CFP、OR空白輔料供試液。

1.9.3 方法專屬性試驗(yàn) CFP原料藥供試液用0.1 mol·L-1稀鹽酸稀釋至含CFP 20 μg·mL-1，CFP-OR-NE供試液用蒸餾水稀釋至含CFP 20 μg·mL-1，CFP空白輔料稀釋倍數(shù)同CFP-OR-NE即750倍；OR原料藥、CFP-OR-NE分別用無水乙醇和蒸餾水稀釋至含OR 20 μg·mL-1，OR空白輔料稀釋倍數(shù)同CFP-OR-NE即750倍。采用紫外分光光度法在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，比較分析各紫外掃描圖譜。

1.9.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將CFP儲(chǔ)備液用0.1 mol·L-1稀鹽酸稀釋成梯度濃度，用UV2450紫外-可見分光光度計(jì)在263和289.8 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，將兩波長(zhǎng)下吸光度差值(△A)作為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程；同法在261.6 、273.2 、284.4 nm波長(zhǎng)處測(cè)定梯度稀釋的OR儲(chǔ)備液吸光度，獲得回歸方程。

1.9.5 回收率試驗(yàn) 用蒸餾水分別稀釋試驗(yàn)號(hào)1～9至含CFP濃度為20、30、40 μg·mL-1，OR濃度為30、40、50 μg·mL-1并測(cè)量吸收值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得出平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.9.6 進(jìn)樣重復(fù)性試驗(yàn)與精密度試驗(yàn) 用蒸餾水分別稀釋試驗(yàn)號(hào)1～9至含CFP質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1，OR質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1，重復(fù)6次，計(jì)算平均質(zhì)量濃度和平均回收率及RSD；分別制備含CFP為2.5、7.5、12.5 μg·mL-1的CFP-OR-NE及含OR為30、40、50 μg·mL-1的CFP-OR-NE，在1、5、10、15、20、24 h進(jìn)行日內(nèi)精密度試驗(yàn)。選擇一個(gè)固定時(shí)間每天測(cè)定，連續(xù)測(cè)定5 d進(jìn)行日間精密度試驗(yàn)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

1.5中評(píng)價(jià)指標(biāo)數(shù)據(jù)用PASW Statistics 18 軟件進(jìn)行極差分析，確定影響各指標(biāo)主次因素，確定CFP-OR-NE最優(yōu)處方；1.5數(shù)據(jù)用PASW Statistics 18 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 CFP-OR-NE處方篩選

2.1.1 油相確定 試驗(yàn)表明CFP在OR中溶解度達(dá)到500 mg·mL-1。

2.1.2 表面活性劑的確定 表面活性劑初選時(shí)Tween-80不能成乳，故在EL-40、RH-40、EL-40/RH-40質(zhì)量比1∶1混合表面活性劑三者中選擇。由圖1可知，3種表面活性劑形成的納米乳區(qū)的大小順序：EL-40>RH-40>EL-40/RH-40(圖1)。故選擇EL-40作為CFP-OR-NE的表面活性劑。

2.1.3 增溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定 當(dāng)1，2-丙二醇為10%時(shí)，不能形成納米乳，當(dāng)1，2-丙二醇為5%時(shí)，形成的納米乳不穩(wěn)定，因此選擇增溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，經(jīng)進(jìn)一步精確試驗(yàn)確定1，2-丙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.13%。

圖1 表面活性劑對(duì)納米乳形成的影響Fig.1 Effect of surfactant agents on nanoemulsion region

2.1.4 初步處方的確定 CFP-OR-NE初步處方各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)：CP 1.5%、牛至油1.5%、EL-40 22.51%、1，2-丙二醇1.13%、蒸餾水73.36%。按上述配方結(jié)合1.4方法制備初步CFP-OR-NE。

2.2 確定CFP-OR-NE最優(yōu)處方

試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。篩選抑制大腸桿菌最優(yōu)處方：對(duì)于因素A，其對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑影響大小排第1位，取A1；其對(duì)Ke影響大小也排第1位，取A3，因此A可取A1或A3，但取A3時(shí)納米乳穩(wěn)定性比取A1提高82.86%，而抑菌圈直徑僅縮小50.01%，故A取A3，B對(duì)抑菌圈直徑影響大小排第2位，在Ke中排第3位，故以抑菌圈直徑為主B取B2，同理C取C2；篩選抑制沙門菌最優(yōu)處方分析方法同上，確定A取A3，B取B2，C取C2，故抑制兩種細(xì)菌優(yōu)組合同為A3B2C2，據(jù)此制備CFP-OR-NE。

2.3 MIC和MBC測(cè)定

CFP-OR-NE體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.4 質(zhì)量評(píng)價(jià)

各溫度下保存的CFP-OR-NE在1、3、6月均為澄清透明且無分層現(xiàn)象；離心試驗(yàn)和光照試驗(yàn)CFP-OR-NE穩(wěn)定，無分層、絮凝、轉(zhuǎn)型、破乳、酸敗等現(xiàn)象；染色結(jié)果顯示CFP-OR-NE為O/W型；經(jīng)透射電鏡觀察CFP-OR-NE乳滴呈圓球形，分布均勻，見圖2；粒徑分析結(jié)果表明，CFP-OR-NE平均粒徑為18.94 nm，多分散系數(shù)(PDI)為0.258，見圖3；在環(huán)境溫度25 ℃條件下，Zeta電位為-9.96±6.35 mv(pH為6.39)。

表2 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 The test scheme and test results

試驗(yàn)號(hào)Testnumber因素Factors評(píng)價(jià)指標(biāo)(x-±s)Evaluationindex(x-±s)A(CFP∶OR)B(水相pH)B(pHofaqueousphase)C(乳化溫度/℃)C(Emulsifytemperature)D(空列)D(Nullcolumn)抑菌圈直徑/mmInhibitoryzonediameter致病性大腸桿菌EnteropathogenicE.coli沙門菌Salmonella穩(wěn)定常數(shù)Ke11 (1∶1)1 (1.2)1 (25)139.67±2.8932.33±0.5815.32±0.5621 (1∶1)2 (3.0)2 (30)238.67±0.5828.33±0.589.20±0.4831 (1∶1)3 (6.8)3 (35)339.67±2.0831.00±1.0036.20±2.3642 (1∶4)1 (1.2)2 (30)331.00±1.0025.00±1.006.17±0.9052 (1∶4)2 (3.0)3 (35)129.67±1.5321.67±1.533.05±0.6962 (1∶4)3 (6.8)1 (25)229.33±0.5827.67±0.582.12±0.6273 (1∶8)1 (1.2)3 (35)225.67±0.5817.33±0.581.48±0.2783 (1∶8)2 (3.0)1 (25)328.67±0.5824.33±0.586.79±0.4893 (1∶8)3 (6.8)2 (30)126.00±1.0021.33±1.162.14±0.27致病性大腸桿菌抑菌圈直徑InhibitoryzonediameterofenteropathogenicE.coli沙門菌抑菌圈直徑InhibitoryzonediameterofSalmonella穩(wěn)定常數(shù)KeK1118.0196.3495.0091.6674.6684.3360.7222.9724.23K290.0097.0195.6774.3474.3374.6611.3419.0417.51K378.6795.0095.0162.9980.0070.0010.4140.4640.73k139.3432.1131.6730.5524.8928.1120.247.668.08k230.0032.3431.8924.7824.7824.893.786.355.84k326.2231.6731.6721.0026.6723.333.4713.4913.58R13.120.670.229.551.894.7816.777.147.74因素主次水平PrimaryandsecondarylevelfactorsA>B>CA>C>BA>C>B優(yōu)水平OptimumlevelsA1B2C2A1B3C1A3B2C2優(yōu)組合OptimumcombinationA1B2C2A1B3C1A3B2C2

試驗(yàn)號(hào)1～9 CFP和OR質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和均為納米乳體系的3%；藥物對(duì)照2：3%頭孢克肟，對(duì)致病性大腸桿菌抑菌圈直徑(27.33±2.52)mm，對(duì)沙門菌抑菌圈直徑(27.67±1.16)mm

The sum of CFP and OR in test No.1-9 all account for 3% of system of nanoemulsion；Inhibitory zone diameters of 3% of cefixime as positive control of drug are 27.33±2.52 mm for enteropathogenicE.coliand 27.67±1.16 mm forSalmonella，respectively

長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果(表4)，各時(shí)間點(diǎn)納米乳均為澄清透明淡黃色液體。CFP含量—時(shí)間回歸方程為y=-0.428x+100.04(R2=0.989)，CFP的時(shí)間有效期為23.45個(gè)月；OR含量—時(shí)間回歸方程為y=-0.467x+100.05(R2=0.982)，OR的時(shí)間有效期為21.52個(gè)月；故CFP-OR-NE的有效期為21個(gè)月。

圖2 透射電鏡下CFP-OR-NE的形態(tài)(50 000×)Fig.2 Shape of CFP-OR-NE under the transmission electron microscope(50 000×)

2.5 安全性評(píng)價(jià)

2.5.1 急性毒性試驗(yàn) 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果：各試驗(yàn)組小鼠24 h內(nèi)均未死亡，CFP-OR-NE的LD50不可測(cè)，因此對(duì)CFP-OR-NE采取MTD試驗(yàn)；MTD試驗(yàn)結(jié)果：連續(xù)觀察7～14 d，灌胃后2 d小鼠出現(xiàn)不同程度精神萎靡，食欲不振等現(xiàn)象，灌胃后3 d均恢復(fù)正常，小鼠未出現(xiàn)死亡，CFP-OR-NE對(duì)小鼠經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量大于1 800 mg·kg-1。

圖3 CFP-OR-NE粒徑分布Fig.3 Droplet size distribution of CFP-OR-NE

2.5.2 組織病理學(xué)檢查 與對(duì)照組相比，給予小鼠最大耐受劑量CFP-OR-NE時(shí)，試驗(yàn)組腎及小腸組織結(jié)構(gòu)無明顯變化(圖4d和圖4f)，可初步認(rèn)為CFP-OR-NE沒有腎毒性及腸毒性；試驗(yàn)組肝，輕微出血，少許細(xì)胞變性壞死，分界不清(圖4e)，但未引起小鼠死亡。

a.對(duì)照組腎；b.對(duì)照組肝；c.對(duì)照組小腸；d.試驗(yàn)組腎，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，管腔清晰可見；e.試驗(yàn)組肝，輕微出血，少許細(xì)胞變性壞死，分界不清；f.試驗(yàn)組小腸，上皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，小腸腺發(fā)達(dá)a.The kidney of control group；b.The liver of control group；c.The small intestine of control group；d.The epithelial cells of renal tubule arrange neatly and the cavity of renal tubule show visibility in the kidney of test group；e.A small amount of liver cells show minor bleeding，degeneration，necrosis，and unclear boundaries in test group；f.The small intestine epithelial cells arrange neatly，showing structural integrity and developed intestinal glands圖4 56日齡小鼠腎、肝和小腸(HE，400×)Fig.4 The kidney，liver and small intestine of mouses at 56 days of age(HE，400×)

2.6 方法專屬性試驗(yàn)

由圖5、6可見，CFP和空白乳的最大吸收峰分別為263和234.8 nm，空白乳在CFP最大吸收峰處有一定的吸收。用UV2450 選點(diǎn)檢測(cè)功能確定空白乳等吸收點(diǎn)波長(zhǎng)為289.8 nm。選擇263 nm為CFP檢測(cè)波長(zhǎng)，289.8 nm為參比波長(zhǎng)。確定OR測(cè)定組合波長(zhǎng)為261.6、273.2、284.4 nm。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

CFP和OR分別在各自含量測(cè)定線性范圍線性良好(表5)。

2.8 回收率試驗(yàn)

平均回收率符合70%～110%[12]的要求(表6)，證明運(yùn)用多波長(zhǎng)紫外分光光度法建立CFP-OR-NE有效成分含量分析方法準(zhǔn)確度高，適用于該藥質(zhì)量控制。

2.9 進(jìn)樣重復(fù)性試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)

各試驗(yàn)號(hào)CFP及OR測(cè)定的RSD均小于0.6%，進(jìn)樣重復(fù)性良好，見表7。CFP-OR-NE中CFP和OR測(cè)定的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于5%，日內(nèi)日間精密度良好，見表8。

1.CFP原料藥；2.CFP-OR-NE；3.CFP空白輔料1.CFP drug;2.CFP-OR-NE;3.Blank excipients of CFP圖5 CFP相關(guān)紫外吸收?qǐng)D譜Fig.5 The UV absorbance spectrum on CFP

1.OR原料藥；2.CFP-OR-NE；3.OR空白輔料1.OR drug;2.CFP-OR-NE;3.Blank excipients of OR圖6 OR相關(guān)紫外吸收?qǐng)D譜Fig.6 The UV absorbance spectrum on OR

表5 CFP和OR含量測(cè)定線性方程

Table 5 Linear equations of measurement of CFP and OR concentrations

藥物Drug線性方程Linearequation相關(guān)系數(shù)(r2)Correlationcoefficient線性范圍/(μg·mL-1)LinearrangeCFPA=0.01041C+0.002730.999221～100ORA=0.00746C+0.000470.999701～100

%

%

組別Group質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)Concentration日內(nèi)精密度Intra-dayprecision日間精密度Inter-dayprecisionx-±sRSDx-±sRSD2.52.37±0.020.972.37±0.031.39CFP7.57.52±0.070.967.47±0.121.6112.512.88±0.060.4712.78±0.161.253030.64±0.180.5929.59±1.254.22OR4040.83±0.210.5139.39±1.624.115050.65±0.340.6749.76±1.412.83

3 討 論

試驗(yàn)選擇的水相pH、CFP載藥量、乳化溫度三個(gè)因素對(duì)CFP-OR-NE穩(wěn)定性影響存在內(nèi)在聯(lián)系，推測(cè)三者均通過調(diào)整表面活性劑有效濃度影響納米乳穩(wěn)定性。A.A.Date等[1]報(bào)道的CFP自乳化釋藥系統(tǒng)在pH1.2緩沖液中最為穩(wěn)定，本試驗(yàn)分別用pH3.0和pH1.2水相制備納米乳，發(fā)現(xiàn)前者穩(wěn)定性高于后者。說明CFP在中強(qiáng)酸度水相酸性條件下所形成的納米乳理化性質(zhì)最為穩(wěn)定，CFP-OR-NE的最終pH為6.17，符合口服乳劑相關(guān)要求；本試驗(yàn)表明CFP載藥量越高，納米乳越不穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果與A.A.Date等[1]報(bào)道一致，分析原因?yàn)椴糠諧FP定位在油相與表面活性劑界面干擾了OR與表面活性劑的充分作用，降低了表面活性劑有效濃度。值得注意的是水相pH和CFP載藥量對(duì)納米乳穩(wěn)定性影響可能并不是孤立的，由于CFP在酸性條件下溶解度增加，水相pH為3.0時(shí)位于混合界面的CFP可能向水相移動(dòng)，相對(duì)增加了表面活性劑的有效濃度，使納米乳趨于更加穩(wěn)定；試驗(yàn)表明最適乳化溫度為30 ℃，25 ℃溫度偏低，界面張力降低效果有限，而35 ℃溫度偏高部分EL-40聚氧乙烯鏈與水之間的氫鍵可能發(fā)生斷裂，降低了表面活性劑有效濃度，納米乳穩(wěn)定性亦不高。

研究表明某些表面活性劑如Tween-20膠束溶液具有阻止腸壁酯酶水解CFP作用，機(jī)制為CFP進(jìn)入Tween-20膠團(tuán)核心，且聚山梨醇酯類表面活性劑本身對(duì)腸壁酯酶有抑制作用[2，15]。本試驗(yàn)制備的CFP-OR-NE從膠束增溶理論分析可認(rèn)為是EL-40膠束溶液增溶之后形成的，即CFP溶解在OR中作為油相增溶于EL-40膠束溶液，推測(cè)EL-40和OR的雙重保護(hù)可有效阻止腸壁酯酶將CFP水解為親脂性差的CPD，有效促進(jìn)腸腔對(duì)CFP的吸收。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各受試菌對(duì)CFP-OR-NE的敏感性與對(duì)CFP和OR的敏感性相比相差顯著(P<0.05)，推測(cè)EL-40和OR的表面活性和脂溶性增加了CFP對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透作用，從而極大地降低了各受試菌對(duì)CFP的MIC及MBC。CFP-OR-NE的抗菌譜廣泛，且CFP質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.33%，將OR與CFP聯(lián)合應(yīng)用極大地減少了CFP用量，對(duì)于減少各受試細(xì)菌臨床耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義。ORI為天然植物抗生素具有單藥不產(chǎn)生耐藥性、與目前使用的抗生素和合成抗菌藥無交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。本試驗(yàn)為CFP與OR在臨床上的聯(lián)合應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。測(cè)定了CFP-OR-NE對(duì)常見致病性細(xì)菌的MIC和MBC，為CFP-OR-NE的藥效學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

組織病理學(xué)檢查給予小鼠最大給藥劑量未見腎、腸毒性，雖可引起肝輕微病理?yè)p傷，但未致小鼠死亡。本試驗(yàn)制備的CFP-OR-NE對(duì)小鼠的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量大于1 800 mg·kg-1，CFP-OR-NE為低毒級(jí)藥物[16-18]，肝輕微出血可能為脫頸致死小鼠未放血引起，少許肝細(xì)胞變性的原因可能為藥物的首過效應(yīng)。本試驗(yàn)首次運(yùn)用多波長(zhǎng)紫外分光光度法，針對(duì)自制CFP-OR-NE中CFP和OR的含量測(cè)定建立了分析方法，CFP和OR平均回收率均在70%～110%的一般要求范圍內(nèi)[12]，通過此法對(duì)CFP-OR-NE進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)得出有效期為21個(gè)月，結(jié)合質(zhì)量評(píng)價(jià)其他試驗(yàn)結(jié)果說明CFP-OR-NE穩(wěn)定性高。

4 結(jié) 論

首次制備出CFP-OR-NE，且質(zhì)量評(píng)價(jià)符合規(guī)定要求；體外抑菌試驗(yàn)表明OR顯著降低CFP對(duì)各受試菌的MIC及MBC；MTD試驗(yàn)表明CFP-OR-NE為低毒藥物，組織病理學(xué)檢查無腎、腸毒性；采用多波長(zhǎng)紫外分光光度法成功建立了納米乳中有效成分含量分析方法，實(shí)現(xiàn)了CFP-OR-NE的質(zhì)量監(jiān)測(cè)，計(jì)算出其有效期為21個(gè)月。

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(編輯 白永平)

Preparation，Efficacy and Safety Evaluation of Compound Nanoemulsion of Cefpodoxime Proxetil

LIU Yue，LI Meng-yun，ZHENG Yin，GAO Xian，OUYANG Wu-qing*，YANG Ming-qi*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

To study the efficacy of combined application of cefpodoxime proxetil and Origanum oil in nanoscale level，compound nanoemulsion of cefpodoxime proxetil was innovatively prepared.Furthermore，antibacterial activity tests in vitro and acute toxicity tests were conducted.Preliminary prescription was sieved on the base of traditional method of preparation of nanoemulsion.Then the multi-index orthogonal experiment was proceeded with L9(34) orthogonal test table，regarding bacteriostatic circle diameter and nanoemulsion stability constantKeas examining index.Three elements，ratio of the mass fraction of cefpodoxime proxetil and Origanum oil，pH of aqueous phase and emulsifying temperature are selected as factors.Antibacterial activity testsinvitroand acute toxicity tests were done through trace broth dilution method and maximal tolerance dose test.Then histopathological examination was measured.The optimal prescription is composed of 0.33% of cefpodoxime proxetil，2.67% of Origanum oil，1.13% of 1，2-propylene glycol，22.51% of EL-40，73.36% of distilled water for enteropathogenicE.coliandSalmonellaand pH value of nanoemulsion is 6.17.Compared with the active pharmaceutical ingredients，both of the minimum inhibitory concentrations and minimum bactericidal concentrations of test drug were significantly different(P<0.05)；the maximum tolerated dose of the oral acute toxicity of mice is higher than 1 800 mg·kg-1，showing low toxicity.Histopathological examinations show no toxicity of kidney and small intestine，but can do pathological damage to the liver.When in the presence of Origanum oil，enteropathogenicE.coli，Salmonella，Proteusmirabilis，Pasteurella，Shigelladysenteriae，Staphylococcus，Streptococcusagalactiaeare more sensitive to CFP-OR-NE than cefpodoxime proxetil.

cefpodoxime proxetil；Origanum oil；nanoemulsion

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.020

2014-09-09

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2013GB2G000475)

劉 岳(1989-)，男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士生，主要從事動(dòng)物病理學(xué)研究，E-mail：aizaidangxia@yeah.net

*通信作者：歐陽(yáng)五慶，E-mail：oywq506@sina.com；楊鳴琦，E-mail：xbndymq@163.com

S859.5

A

0366-6964(2015)06-1026-11