新疆阿拉山口口岸地區(qū)鼠類棘球蚴感染情況調(diào)查

肖云霞，徐新龍，尹小平，王安東，閆遵祥，段成任，徐 軍*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.阿拉山口出入境檢驗檢疫局，阿拉山口 833418；3.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

新疆阿拉山口口岸地區(qū)鼠類棘球蚴感染情況調(diào)查

肖云霞1，徐新龍2，尹小平2，王安東1，閆遵祥1，段成任3，徐 軍2*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.阿拉山口出入境檢驗檢疫局，阿拉山口 833418；3.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

對新疆阿拉山口口岸地區(qū)鼠類棘球蚴感染情況進行系統(tǒng)調(diào)查。選擇阿拉山口口岸三個不同區(qū)域(野外區(qū)、城郊綜合區(qū)和城區(qū))，2013—2014年連續(xù)2年采集鼠類樣本；剖檢、分離肝，對所有樣本提取肝基因組DNA，利用聚合酶鏈式反應擴增棘球蚴線粒體細胞色素C氧化酶亞單位1(Cox1)、NADH脫氫酶(ND1)等基因并測序。剖檢發(fā)現(xiàn)8份樣品具有包囊，感染率為2.08%；分子鑒定發(fā)現(xiàn)有10份樣品呈PCR陽性，感染率為2.60%，Cox1基因Blast分析中有8份樣品與青海檢測的蘇俄多房棘球絳蟲的相似性最高(登錄號：JQ 690286.1)，為85%；ND1基因Blast分析，另2份樣品與多房棘球蚴相似性最高(登錄號：AB 720065.1)，為100%；統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)野外區(qū)、城郊綜合區(qū)鼠類感染率分別為2.74%和2.38%，而城區(qū)未檢測到病原體。阿拉山口口岸野外區(qū)野鼠棘球蚴感染率最高，易感鼠種為大沙鼠。

棘球蚴??；野鼠；阿拉山口口岸

棘球蚴病(echinococcosis)又稱包蟲病，是一類由棘球?qū)俳{蟲的幼蟲棘球蚴寄生于人畜體內(nèi)而引起的嚴重人畜共患疾病 ，呈世界性分布[1-2]。全球超過100萬人患有此病，其中很多人會患有嚴重的致命性臨床綜合征[3]。它主要影響發(fā)展中國家和地區(qū)的貧困人群，同時對動物及動物性產(chǎn)品的國際貿(mào)易也產(chǎn)生一定的阻礙[4-5]。我國是世界棘球蚴病高發(fā)的國家之一，其中又以新疆、西藏、寧夏、甘肅等7省(區(qū))最為嚴重[6]。目前，在我國分布有三種棘球絳蟲，分別為多房棘球絳蟲(E.multilocularis)、細粒棘球絳蟲(E.granulosus)和石渠棘球絳蟲(E.shiquicus)[7]。棘球絳蟲的生活史復雜，需要經(jīng)歷不同的中間宿主和終末宿主才能完成其生活史，中間宿主除牛、羊等反芻動物和人以外，還包括多種嚙齒類野生動物如田鼠、褐家鼠等[8]。野生動物之間以及與家養(yǎng)動物之間的聯(lián)系促進了棘球蚴病的傳播與流行。

阿拉山口口岸位于我國西部，是目前唯一集鐵路、公路、管道原油運輸為一體的國家一類陸路口岸，整個口岸毗鄰哈薩克斯坦塔爾迪—庫爾干州，是中亞荒漠和準噶爾荒漠間唯一的通道。阿拉山口口岸所處環(huán)境適宜多種荒漠嚙齒動物生存，包括大沙鼠(Rhombomysopimus)、紅尾沙鼠(Merioneserythrourus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)等多種鼠類[9-10]。隨著經(jīng)濟貿(mào)易發(fā)展，頻繁的交通增加了鼠類的活動范圍及頻率，同時也為棘球蚴的傳播提供了便利。

為了預防棘球蚴通過鼠類的傳播，作者對該區(qū)鼠類攜帶棘球蚴的基本概況開展了診斷調(diào)查。將傳統(tǒng)的形態(tài)學診斷方法及PCR分子生物學診斷方法相結(jié)合，對阿拉山口口岸地區(qū)鼠類所攜帶的棘球蚴進行病理組織學觀察，同時根據(jù)病原線粒體Cox1基因保守序列設計特異性引物進行擴增。然后參照OIE陸生動物手冊對疑似陽性樣品進行多房棘球蚴及細粒棘球蚴兩種常見棘球蚴病種屬鑒別；最終Blast比對分析總結(jié)，以期了解阿拉山口口岸地區(qū)鼠類攜帶棘球蚴基本狀況，為新疆邊境口岸地區(qū)采取相應疾病防控措施提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

自2013年至2014上半年采集于城區(qū)(13只)、城郊綜合區(qū)(42只)及野外區(qū)(329只)三大區(qū)域，共384只鼠樣。由阿拉山口出入境檢驗檢疫局醫(yī)學媒介生物實驗室鑒定完畢后提供。剖檢鼠樣，肉眼觀察有無包囊，肝是否存在病變。將部分肝包囊于10%福爾馬林溶液(3.4%～4%甲醛)固定，余樣放入凍存管中標記，液氮速凍后于-70 ℃保存。

1.2 主要試劑

總DNA提取試劑盒(DNeasy?Blood & Tissue kit)，購自德國QIAGEN公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、T-載克隆試劑盒(pMDTM19-T Vector cloning kit)均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，購自北京TIANGEN生物工程有限公司；PCR引物合成、測序均由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司完成。

1.3 病理組織學觀察

將常規(guī)制備石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察病理組織形態(tài)。

1.4 樣品DNA制備

分別對所有鼠樣的肝及包囊剪取約25 mg檢測樣品，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，按照總DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR檢測

1.5.1 棘球蚴的PCR檢測 PCR以線粒體中細胞色素C氧化酶(Cox1)基因序列設計的特異性引物Cox1-F與Cox1-R序列為目的片段，以樣品基因組DNA為擴增模板。PCR擴增反應體系50 μL：其中dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL、10×PCR Buffer 5 μL、Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL、引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O補至50 μL混勻。擴增參數(shù)：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.5.2 多房棘球蚴與細粒棘球蚴PCR檢測方法 將以上檢測到疑似陽性樣品為模板進行兩種常見棘球蚴種型鑒定，多房棘球蚴與細粒棘球蚴PCR引物參照OIE陸生動物手冊(2008)中序列(表1)[11]。1.5.2.1 多房棘球蚴：引物選擇Cest1與Cest2。擴增體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL、 MgCl25 μL(2.5 mmol·L-1)、dNTP 4 μL(0.2 mmol·L-1)、引物各2 μL(10 μmol·L-1)、Taq酶1 U、DNA模板2 μL、ddH2O補至50 μL混勻。擴增參數(shù)：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[12]。

1.5.2.2 細粒棘球蚴：引物選擇Eg1121a與Eg1122a。擴增體系為50 μL：10×PCR Buffer 5 μL、MgCl23 μL(1.5 mmol·L-1)、dNTP 4 μL(0.2 mmol·L-1)、引物各2 μL(20 μmol·L-1)、Taq聚合酶2.5 U、DNA模板2 μL、ddH2O補至50 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[13]。

1.5.3 電泳檢測 取6 μL PCR擴增產(chǎn)物和2 μL Loading Buffer混合液及DNA標準Marker對照，于1.5%瓊脂糖(含GenGreen核酸染料)凝膠中100 V電泳45 min，于凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

表1 引物序列

Table1 Primer sequences

目標物種Targetspecies基因Gene引物名稱Primerdesignation序列Sequences擴增片段/bpAmpliconsize棘球蚴EchinococcusCox1Cox1-FCox1-R5'-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3'5'-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3'450多房棘球蚴E.multilocularisND1Cest1Cest25'-TGCTGATTTGTTAAAGTTAGTGATC-3'5'-CATAAATCAATGGAAACAACAACAAG-3'395細粒棘球蚴E.granulosusEgG1HaeⅢEg1121aEg1122a5'-GAATGCAAGCAGCAGATG-3'5'-GAGATGAGTGAGAAGGAGTG-3'133

1.6 PCR產(chǎn)物回收

將以上所得目標片段PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，在紫外燈下切割所需片段，利用膠回收試劑盒進行純化回收。

1.7 目的基因的克隆與測序

取適量純化回收產(chǎn)物與pMD19-T Vector進行連接，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌。挑取陽性克隆菌落接入少量LB培養(yǎng)基(Amp+，100 mg·mL-1)中，150 r·min-1，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。參照質(zhì)粒提取試劑盒說明提取質(zhì)粒，送北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行測序。

1.8 結(jié)果處理

序列分析：測序結(jié)果利用DNAStar、DNAman等軟件進行序列拼接分析，運用Blast進行相似性比對。

數(shù)據(jù)處理：運用Excel統(tǒng)計軟件分析感染率。

2 結(jié) 果

2.1 樣本鼠的分類鑒定

本研究共捕獲384只樣本鼠，由阿拉山口出入境檢驗檢疫局醫(yī)學媒介生物實驗室采用形態(tài)學法鑒定，其中大沙鼠(Rhombomysopimus)230只、紅尾沙鼠(Merioneserythrourus)45只、褐家鼠(Rattusnorvegicus)54只、小家鼠(Musmusculus)19只、小倉鼠(Cricetulusbarabensis)16只、子午沙鼠(Merionesmeridianus)9只、西伯利亞五趾跳鼠(Allactagasibirica)9只、小五趾跳鼠(Allactaga.elater)1只以及怪柳沙鼠(Merionestamariscinus)1只。

2.2 剖檢結(jié)果

剖檢384只樣本鼠，有8只攜帶包囊，包囊泡形狀及大小不等，多呈乳白色、灰白色或微帶些淡黃色的圓形或橢圓形串泡樣結(jié)節(jié)。其中6只包囊游離于腹腔或附著于腸系膜上，其長直徑為0.736 cm±0.012 cm、短直徑為0.406 cm±0.005 cm；2只包囊附著或嵌于肝上，則剖檢感染率為2.08%(8/384)，其直徑為2.120 cm±0.146 cm(圖1)。

2.3 組織切片觀察

對肝、囊泡內(nèi)部及囊泡壁等結(jié)構(gòu)的病理組織切片進行顯微鏡觀察并拍照(圖2)，可觀察到包囊壁由上皮樣細胞和成纖維細胞構(gòu)成，囊內(nèi)含大量原頭蚴，肝間質(zhì)結(jié)締組織增生，部分肝細胞呈水泡變性，有炎性滲出物浸潤。

2.4Cox1片段PCR檢測

以阿拉山口口岸地區(qū)鼠類肝或包囊DNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增，得到Cox1基因450 bp的擴增條帶，有10份樣品呈PCR陽性，與預期大小相符(圖3)。PCR產(chǎn)物純化后進行雙向測序，經(jīng)DNAman軟件序列拼接及NCBI/Blast分析：(1)其中8份樣品(6份為附著于腸系膜或游離于腹腔內(nèi)的包囊、2份為未觀察到包囊的肝)測得片段長度為432 bp，Blast分析與青海檢測的蘇俄多房棘球絳蟲(Echinococcussp.，JQ 690286.1)相似性為(361/424)85%，與Taenialaticollis(AB 731727.1)相似性為(355/419)85%，與Taeniamadoquae(AB 731726.1)相似性為(356/422)84%；(2)其余2份樣品(為附著或嵌于肝的包囊)測得片段大小為435 bp，Blast分析與多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，AB 777915.1)的相似性可達(433/435)99%。

A、C.嵌于鼠肝內(nèi)包囊；B.游離于鼠腹腔內(nèi)包囊A，C.Cyst in the liver of rodents；B.Cyst free in the abdomen of rodents圖1 鼠肝及腹腔中包囊Fig.1 Cyst in the liver and abdomen from rodents

A.肝組織及包囊壁結(jié)構(gòu)；B.部分肝細胞水泡變性并有炎性滲出物浸潤；C.充滿原頭節(jié)的包囊；D.包囊內(nèi)原頭節(jié)結(jié)構(gòu)A.Histology structure of liver and hydatid cyst wall；B.Vacuolar degeneration of hepatic cells with inflammatory exudate infiltrates；C.Hydatid cyst with protoscoleces；D.Histology structure of protoscoleces in cyst圖2 鼠體內(nèi)包囊病理組織切片(HE)Fig.2 Cyst pathologic tissue section of rat (HE)

2.5ND1片段PCR檢測

將所得10份疑似陽性結(jié)果樣品再進行多房棘球蚴和細粒棘球蚴分型鑒別檢測，其中2份樣品經(jīng)多房棘球蚴PCR得到目的片段，基因大小為395 bp(圖4)，未檢到細粒棘球蚴。PCR產(chǎn)物測序、Blast分析表明：該序列與GenBank中多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，AB 720065.1)的ND1基因序列相似性達到100%。

M．DNA相對分子質(zhì)量標準；1、2.Cox1基因目的條帶；3.ddH2O陰性對照M.DL1000 DNA marker；1，2.PCR product of Cox1 gene；3.ddH2O as negative control圖3 Cox1基因PCR結(jié)果Fig.3 The PCR result of Cox1 gene

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1、2.ND1基因目的條帶；3.ddH2O陰性對照M.DL2000 DNA marker；1，2.PCR product of ND1 gene；3.ddH2O as negative control圖4 多房棘球蚴ND1基因PCR結(jié)果Fig.4 The PCR result of ND1 gene

2.6 統(tǒng)計學分析感染情況

經(jīng)分子檢測有10份樣品為陽性，其中有8只攜帶包囊，總感染率達到2.60%。9只感染鼠樣(8只大沙鼠、1只紅尾沙鼠)均來自野外區(qū)感染率為2.74%(9/329)，1只感染鼠樣(褐家鼠)來自城郊綜合區(qū)感染率為2.38%(1/42)，城區(qū)感染率為0。10只陽性樣本鼠：2只為多房棘球蚴(1只大沙鼠捕自野外區(qū)，1只褐家鼠捕自城郊綜合區(qū))；其余8只(7只大沙鼠及1只紅尾沙鼠均為野外區(qū)捕獲)與蘇俄多房棘球蚴相似性為85%。不同鼠種感染率不同，其中大沙鼠感染率最高，較為易感，詳見表2。

表2 感染率統(tǒng)計

Table 2 Infection rate statistics

鼠種Theratspecies數(shù)量Quantity感染數(shù)Numberofinfections感染率/%Infectionrate大沙鼠23083.48紅尾沙鼠4512.22褐家鼠5411.85小家鼠1900灰倉鼠1600其他2000合計Total384102.60

3 討 論

棘球蚴病由于流行范圍廣、危害大而備受關注。新疆作為棘球蚴病的重災區(qū)，對該病的預防控制就顯得尤為重要[6，14]。目前，臨床上獸醫(yī)對棘球蚴病傳統(tǒng)常規(guī)診斷方法多為病理學診斷及血清學診斷。但病理學診斷在臨床操作上往往參照病史、眼觀、觸診、剖檢、影像學等方法進行診斷，較為主觀且易與腫瘤相混淆，不適用于早期和群體的診斷?，F(xiàn)場剖檢不但受調(diào)查者主觀因素影響外，且包囊在不同發(fā)育狀態(tài)下，某些包囊較小難以以肉眼與其他病變等分辨；而血清學診斷方法所用抗原主要來源于棘球蚴囊液(CF)，由于其成分復雜，與其他蠕蟲病患畜的血清有交叉反應和非特異性反應，因此假陽性問題難以克服，診斷的特異性不理想[15]。在分子診斷中，PCR方法以其特異性強、可擴增病原靶標基因、靈敏度高等特點作為一種準確有效的病原學診斷方法逐漸運用于實踐中[15-16]。本文結(jié)合剖檢、病理組織學鑒定及分子生物學方法對病原體多方面進行判定。由于線粒體基因組已經(jīng)在研究動物物種分類及蟲種的鑒定等方面得到運用，通過PCR方法有效的對臨床上易于混淆的帶科絳蟲的種、基因型等作出確切的鑒別和診斷[17]。本文選取棘球絳蟲線粒體Cox1基因保守序列進行擴增測序，可擴增出棘球?qū)贄l帶。而后通過ND1等特異性基因序列對兩種常見棘球絳蟲基因序列進行擴增以期對其進行種屬鑒別，來確定包囊病原體性質(zhì)。

在本研究中，野鼠樣品采集于口岸設立的城區(qū)、城郊綜合區(qū)、野外區(qū)三大監(jiān)測區(qū)域，對于口岸地區(qū)鼠類分布情況較具有代表性。由結(jié)果可得野外區(qū)、城郊綜合區(qū)感染率分別為2.74%和2.38%，而城區(qū)未檢測到病原體，可見野外區(qū)感染率較高，感染數(shù)量最多，占檢測到感染數(shù)的90%，城郊綜合區(qū)感染率次之。其中感染宿主多為大沙鼠，在本次檢測中大沙鼠感染率可達3.48%。大沙鼠為口岸邊境野外地區(qū)優(yōu)勢種，據(jù)尹小平等2011年對中哈邊境地區(qū)進行的調(diào)查[18]，大沙鼠占該地區(qū)嚙齒動物的60%～70%，且具有高繁殖力的特點，在疾病的傳播過程中具有顯著影響。本文中檢測到10只感染鼠樣，其中80%測序結(jié)果與2012年中國科學院西北高原生物研究所提交的蘇俄多房棘球絳蟲(Echinococcussp.)序列相似性最高，為85%，由于有多種帶科絳蟲以鼠類作為中間宿主[19]，則與Taenialaticollis、Taeniamadoquae進行比較其相似性均較次之。但目前除唐崇惕等1985—2007年報道過多次在內(nèi)蒙古大興安嶺北麓開展鼠類和沙狐多房棘球絳蟲感染調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)蘇俄多房棘球絳蟲外，尚未有對大沙鼠攜帶蘇俄多房棘球絳蟲相關研究的具體報道，亦沒有在新疆發(fā)現(xiàn)蘇俄多房棘球蚴的相關報道[20]。大沙鼠是否為蘇俄多房棘球絳蟲的天然宿主還有待于研究證明。但為防止鼠類由野外區(qū)將攜帶的病原體傳入城區(qū)，應持續(xù)對不同區(qū)域進行監(jiān)測，并采取相應防控措施預防棘球蚴病的傳播。

4 結(jié) 論

野生動物在棘球絳蟲傳播流行中起著重要的作用[7]，本研究通過PCR檢測技術并結(jié)合病理組織形態(tài)學對阿拉山口口岸地區(qū)野鼠攜帶棘球蚴進行診斷調(diào)查和分析，顯示野外區(qū)感染率最高，多數(shù)陽性野鼠樣本可能感染泡狀棘球蚴。而大沙鼠為口岸邊境野外地區(qū)優(yōu)勢種，且感染率相對較高，需采取相應防控措施防止棘球蚴疾病的傳播。

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(編輯 白永平)

Investigation on Echinococcosis in Wild Rodents at Ala-shankou Port

XIAO Yun-xia1，XU Xin-long2，YIN Xiao-ping2，WANG An-dong1，YAN Zun-xiang1，DUAN Cheng-ren3，XU Jun2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China；2.Ala-shankouEntry-exitInspectionandQuarantineBureauoftheP.R.China，Alashankou833418，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumchi830052，China)

The infectious status of echinococcosis in wild rodents was investigated at different areas of Alashankou Port.The wild rodent samples were collected from rural，suburb and urban area of Ala-shankou Port during 2013-2014.Then，pathological sections of liver were prepared and stained with H&E；the genomic DNA of livers and cysts were extracted.Cytochrome C oxidase 1 (Cox1)，NADH dehydrogenase subunit 1 (ND1) inEchinococcusmitochondria were amplified from the DNA and sequenced.Results were as follows：eight samples with cyst were found in the process of autopsy，and the positive rate was 2.08%.Ten positive samples were detected positive by PCR，and the positive rate was 2.60%.The analysis of Blast showed that 8 samples of our sequences were clustered with that ofEchinococcussp. (Accession No.JQ 690286.1)，and their identities were 85%.The remaining 2 samples of our sequences were clustered with that ofEchinococcusmultilocularis(Accession NO：AB 720065.1)，and their identities were 100%.The results of statitical analysis conveyed us the infection rates ofechinococcosisat rural and suburb area were 2.74% and 2.38%，respectively，while no positive sample was detected at urban area.The results presented here demonstrate that the wild rodents at rural area of Ala-shankou Port showed the highest infection rate，and its susceptible host was theRhombomysopimus.

echinococcosis；wild rodent；Ala-shankou Port

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.017

2014-10-28

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2014IK239)

肖云霞(1990-)，女，新疆烏魯木齊人，碩士生，主要從事獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督與管理研究，E-mail：18675016094@163.com

*通信作者：徐 軍，高級獸醫(yī)師，主要從事動物檢疫研究，E-maill：alskxj@sina.com

S853.734

A

0366-6964(2015)06-1004-07