銀杏苦內(nèi)酯B對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的機(jī)制

陳凱 曹衛(wèi)麗 夏時(shí)海

·論著·

銀杏苦內(nèi)酯B對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的機(jī)制

陳凱 曹衛(wèi)麗 夏時(shí)海

目的觀察銀杏苦內(nèi)酯B(BN52021)對(duì)胰腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MS1細(xì)胞)的作用，探討其分子機(jī)制。方法 采用MTT法確定脂多糖(LPS)抑制MS1細(xì)胞存活的最佳濃度和時(shí)間，同法確定BN52021增加LPS誘導(dǎo)后MS1細(xì)胞存活的最佳濃度。通過實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測血小板活化因子受體(PAFR)信號(hào)通路中腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLCβ)、酪氨酸蛋白激酶(PTK)和G蛋白耦聯(lián)受體激酶(GRK)mRNA和蛋白表達(dá)量。結(jié)果 10 μg/ml LPS作用24 h為抑制MS1細(xì)胞存活的最佳濃度和作用時(shí)間。50 mmol/L BN52021是最佳干預(yù)濃度。LPS誘導(dǎo)后MS1細(xì)胞株AC、GRK、PLA2、PLCβ、PTK mRNA表達(dá)量分別為4.02±0.14、2.63±0.03、3.31±0.12、2.09±0.08、1.85±0.07，較對(duì)照組(均為1)明顯上調(diào)；BN52021干預(yù)后MS1細(xì)胞AC、GRK、PLA2、PLCβ mRNA表達(dá)量分別為2.35±0.13、1.17±0.14、1.87±0.11、1.65±0.10，較LPS誘導(dǎo)組顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，PTK mRNA表達(dá)量為1.83±0.13，與LPS誘導(dǎo)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛋白印跡法顯示各基因的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)的變化一致。結(jié)論 BN52021能有效地下調(diào)LPS誘導(dǎo)MS1細(xì)胞后PAFR信號(hào)通路中被上調(diào)的AC、GRK、PLA2和PLCβ基因表達(dá)。

胰腺炎，急性壞死性； 銀杏苦內(nèi)酯類； 脂多糖類； 微血管； 內(nèi)皮細(xì)胞

大量證據(jù)表明，重癥急性胰腺炎(SAP)的許多并發(fā)癥是微循環(huán)紊亂的放大效應(yīng)[1-3]導(dǎo)致的。血小板活化因子(PAF)是包括胰腺腺泡和微血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞合成和分泌的生物活性磷脂，它與血小板活化因子受體(PAFR)結(jié)合，通過G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化磷脂酶C(PLC)、磷脂酶A2(PLA2)、腺苷酸環(huán)化酶(AC)和酪氨酸蛋白激酶(PTK)等，導(dǎo)致SAP的發(fā)生和發(fā)展[4]。本課題組既往研究結(jié)果顯示，PAF表達(dá)于大鼠的胰腺組織，在SAP的炎癥應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[5-6]。PAFR拮抗劑能夠阻斷PAF引起的炎癥和損傷。銀杏苦內(nèi)酯B(BN52021)是從銀杏葉中提取的，作為一種潛在的PAFR拮抗劑可抑制PAF誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7-9]。本研究應(yīng)用BN52021干預(yù)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的胰腺微小血管內(nèi)皮細(xì)胞(MS1細(xì)胞)，觀察PAF受體(PAFR)信號(hào)通路中AC、PLA2、PLC β、PTK和G蛋白耦聯(lián)受體激酶(GRK)的表達(dá)變化，探討B(tài)N52021作用的分子機(jī)制。

材料與方法

一、LPS誘導(dǎo)MS1細(xì)胞的最佳濃度、作用時(shí)間及最佳BN52021干預(yù)濃度確定

小鼠胰腺微小血管內(nèi)皮細(xì)胞株(MS1)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種96孔板，每孔103細(xì)胞，200 μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)至細(xì)胞密度75%時(shí)分為4組：不加LPS的對(duì)照組,0.1、1、10 μg/ml LPS組，分別繼續(xù)培養(yǎng)3、6、12、24 h，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。到培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)時(shí)加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μl DMSO，震蕩10 min，上酶標(biāo)儀測各孔在波長490 nm處的吸光度值(A490值)。LPS及MTT均為Sigma公司產(chǎn)品。

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種96孔板，每孔103個(gè)細(xì)胞，200 μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)至細(xì)胞密度75%時(shí)分為6組：對(duì)照組、LPS組、LPS+DMSO組、LPS+10mmol/L BN52021組、LPS+50 mmol/L BN52021組、LPS+100 mmol/L BN52021組，每組3個(gè)復(fù)孔。參考De Kimpe等[10]的方法，先在相應(yīng)孔分別加入10、50、100 mmol/L BN52021，同時(shí)加入2 μl DMSO(因BN52021需要用DMSO溶解)，干預(yù)20 min后再在相應(yīng)組分別加入最佳的LPS誘導(dǎo)濃度，取最佳作用時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。同樣采用MTT法測定成活細(xì)胞的A490值。BN52021購自Sigma公司。

二、MS1細(xì)胞AC、PLA2、PLCβ、PTK、GRK mRNA表達(dá)檢測

取對(duì)照組、LPS組、LPS+DMSO組、LPS+50 mmol/L BN52021組MS1細(xì)胞，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA。Trizol購自invitrogen公司，按說明書操作。取2 μl(1 μg)總RNA加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒MIX體系中行逆轉(zhuǎn)錄。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl在Applied Biosystems公司StepOnePCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。AC上游引物5′-GACTTTGTTCTCCGAGTTG-3′，下游引物5′-GTGCTATCCATCCGACTG-3′，產(chǎn)物122 bp，退火溫度49℃；PLA2上游引物5′-GAATAAAGGCTCTACAATGG-3′，下游引物5′-GTTGTCGCTTTGGTACTC-3′，產(chǎn)物149 bp，退火溫度49℃；PLC β上游引物5′-CCTCAACTTCAACCGAGTT-3′，下游引物5′-CAGAGTGAGGTACGGCTTG-3′，產(chǎn)物148 bp，退火溫度49℃；PTK上游引物5′-CACTGCGATGTCACATTG-3′，下游引物5′-CACTATGTTCGGGACTGG-3′，產(chǎn)物147 bp，退火溫度49℃；GRK上游引物5′-AAGCCAGCCAACATTCTC-3′，下游引物5′-CCCTTCTGTAGGACTTCG-3′，產(chǎn)物140 bp，退火溫度51℃；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CATCTTCCAGGAGCGAGAC-3′，下游引物5′-GGCTAAGCAGTTGGTGGTG-3′，產(chǎn)物250 bp，退火溫度50℃。引物均由北京奧克鼎盛公司合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)PCR試劑盒購自北京全式金公司。使用PCR儀自帶的stepone software v2.1軟件獲取與內(nèi)參的相對(duì)定量值。

三、細(xì)胞中磷酸化AC(p-AC)、p-PLA2、PLCβ、p-PTK、GRK蛋白表達(dá)檢測

取上述各組細(xì)胞，應(yīng)用碧云天細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30 min，再超聲裂解1 min，4℃離心取上清即為細(xì)胞蛋白，應(yīng)用碧云天BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。 取60 μg蛋白行蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞p-AC、p-PLA2、PLCβ、p-PTK、GRK蛋白表達(dá)。兔抗小鼠p-PTK、p-AC多抗購自abcam公司，GRK多抗購自Epitomics公司，p-PLA2多抗購自cell signaling公司，β-actin多抗購自abmart公司，羊抗兔IgG購自ProteinTech公司。最后ECL發(fā)光，X膠片曝光、顯影、定影。應(yīng)用Quantity One4.6.2凝膠分析軟件計(jì)算目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比，表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、LPS誘導(dǎo)MS1細(xì)胞的最佳作用濃度、時(shí)間及BN52021干預(yù)的最佳濃度

0.1 μg/ml LPS誘導(dǎo)12 h以上以及1、10 μg/ml LPS誘導(dǎo)6 h以上均能顯著減少成活的MS1細(xì)胞數(shù)量，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01，表1)，其中以10 μg/ml LPS誘導(dǎo)24 h的作用效果最佳。

對(duì)照組、LPS組、LPS+DMSO組、LPS+10mmol/L BN52021組、LPS+50mmol/L BN52021組、LPS+100 mmol/L BN52021組的A490值分別為0.20±0.01、0．14±0.02、0.16±0.03、0.14±0.02、0.20±0.03、0.17±0.02。應(yīng)用50 mmol/L BN52021干預(yù)MS1細(xì)胞20 min后，再用10 μg/ml LPS誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，MS1細(xì)胞的成活數(shù)量最多，較10 μg/ml LPS組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與未用LPS誘導(dǎo)的對(duì)照組細(xì)胞成活數(shù)量相近，為最佳干預(yù)濃度。

二、MS1細(xì)胞AC、PLA2、PLCβ、PTK、GRK mRNA表達(dá)變化

LPS組、LPS+DMSO組、LPS+50mmol/L BN52021組MS1細(xì)胞AC、PLA2、PLCβ、PTK GRK、mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。BN52021干預(yù)后MS1細(xì)胞AC、PLA2、PLCβ、GRK mRNA表達(dá)量較LPS誘導(dǎo)后的表達(dá)量顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)，PTK mRNA表達(dá)量在BN52021干預(yù)前后無顯著變化(表2)。

三、MS1細(xì)胞p-AC、p-PLA2、p-PTK、GRK、PLCβ蛋白表達(dá)變化

LPS誘導(dǎo)的MS1細(xì)胞p-AC、p-PLA2、GRK、PLC β蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)，BN52021干預(yù)后p-AC、p-PLA2、GRK、PLCβ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，與LPS誘導(dǎo)組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。MS1細(xì)胞p-PTK蛋白表達(dá)在各組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3、圖1)。

表1 不同LPS濃度及時(shí)間誘導(dǎo)后成活的MS1細(xì)胞(A490值

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05,bP<0.01

表2 各組細(xì)胞AC、PLA2、PLCβ、PTK、GRK mRNA表達(dá)量變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05,cP<0.01

表3 各組MS1細(xì)胞p-AC、p-PLA2、p-PTK、GRK、PLCβ蛋白表達(dá)變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與LPS組比較，bP<0.05

圖1 對(duì)照組(1)、LPS組(2)、LPS+DMSO組(3)、LPS+50 mmol/L BN52021組(4)MS1細(xì)胞p-AC、p-PLA2、p-PTK、GRK、PLCβ蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

PAFR屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族[11],PAF與受體結(jié)合后的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能途徑[12-13]：(1)通過G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)激活PLCβ后通過第二信使激活NF-κB將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入核。(2)通過G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)激活A(yù)C經(jīng)由cAMP依賴蛋白激酶A(PKA)將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入核。(3)經(jīng)由直接或者間接途徑激活PTK。此外， PLA2可以通過再修飾途徑經(jīng)乙酰輔酶A合成PAF激活PAFR通路。

近年來人們?cè)絹碓疥P(guān)注SAP發(fā)病機(jī)制中PAF信號(hào)通路的重要性[7,14-15]。因PAFR幾乎普遍存在于各種類型的細(xì)胞，故PAFR通路可引起全身炎癥應(yīng)答和多種器官損傷[16]。孫文佳等[17]報(bào)道，通過加入PAFR通路阻斷劑可以降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的TLR4通路活化，從而抑制NF-κB因子的核移位，減輕炎癥反應(yīng)。Richardson等[18]報(bào)道，在大鼠第四腦室注射LPS誘發(fā)的急性神經(jīng)炎性反應(yīng)中，炎性反應(yīng)程度與PAF等細(xì)胞因子水平呈正相關(guān)，且PAF間接或直接地提高了腦內(nèi)的谷氨酸水平，從而激活谷氨酸受體，使神經(jīng)元死亡[19]。PAF也是SAP發(fā)病機(jī)制中的始動(dòng)因素，其中的PLA2信號(hào)因子扮演重要角色，其細(xì)胞毒作用可以加劇炎癥的發(fā)展[20]。有研究報(bào)道，應(yīng)用PLA2阻斷劑干預(yù)急性壞死性胰腺炎大鼠后IL-1β等炎性因子表達(dá)量明顯下降[21]。銀杏苦內(nèi)酯作為PAFR的天然阻斷劑已被學(xué)者發(fā)現(xiàn)和證實(shí)[17,22]，它在多器官組織中通過阻斷PAFR信號(hào)通路減輕組織炎癥應(yīng)答[17,23]。本課題組前期的研究工作證實(shí)，BN52021干預(yù)AP大鼠后可抑制PLA2活化，拮抗PAFR通路激活所造成的胰腺損傷[24]，其機(jī)制可能通過競爭性結(jié)合表達(dá)上升的PAFR蛋白所致[25]。

本研究結(jié)果顯示，GRK 及其相關(guān)因子AC、PLA2、PLCβ mRNA及蛋白表達(dá)在LPS刺激后顯著上調(diào)，BN52021干預(yù)后GRK mRNA表達(dá)降至幾近正常水平， AC、PLA2 PLCβ mRNA表達(dá)也被顯著抑制，表明BN52021能夠有效改善LPS刺激后MS1細(xì)胞的生存狀況，機(jī)制可能與BN52021抑制LPS刺激后PAFR信號(hào)通路中上調(diào)的AC、GRK、PLA2和PLC β表達(dá)有關(guān)。PKT在BN52021干預(yù)前后無明顯變化，表明該基因不參與PSFR信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

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(本文編輯：呂芳萍)

Mechanism of effect of Ginkgolide B on lipopolysaccharide induced microvascular endothelial cells

ChenKai,CaoWeili,XiaShihai.CenterofHepatopancreatobiliaryandSplenic,AffiliatedHospital,LogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300162,China

Correspondingauthor:XiaShihai,Email:xshhcx@sina.com

Obiective To investigate the effect of Ginkgolide B (BN52021) on lipopolysaccharide(LPS) induced pancreas microvascular endothelialv(MS1) cells, and to explore its molecular mechanism. Methods The optimal concentration and best time point of LPS inhibing MS1 cell survival and the optimal concentration of BN52021 increasing survival of LPS induced MS1 cells were determined by MTT. The mRNA and protein expression of adenylate cyclase(AC), phospholipase A2(PLA2), phospholipase Cβ(PLCβ), protein tyrosine kinase(PTK) and G protein coupled receptor kinase (GRK) in platelet activating factor receptor(PAFR) signal pathway in MS1 cells were determined by real-time PCR and Western blot. Results It was showed that 10 μg/ml LPS for 24 h was the optimal concentration and best time point to induce the decrease of MS1 cells. 50 mmol/L of BN52021 was the optimal concentration of increacing survival of LPS induced MS1 cells. After LPS induction, AC, GRK, PLA2, PLCβ, PTK mRNA expressions of MS1 cells were 4.02±0.14, 2.63±0.03, 3.31±0.12, 2.09±0.08, 1.85±0.07, which were significantly higher than those in control group (P<0.01). After BN52021 treatment, AC, GRK, PLA2, PLCβ mRNA expressions of LPS induced MS1 cells were 2.35±0.13, 1.17±0.14, 1.87±0.11, 1.65±0.10, which were significantly lower than those in LPS induction group (P<0.01). The expression of PTK mRNA was 1.83±0.13, which was not significantly different from that in LPS induction group. Western blot showed that the levels of protein expression were consistent with those of mRNA expression. Conclusions BN52021 can down-regulate the up-regulated genes expression of AC, GRK, PLA2 and PLCβ in the PAFR signal pathway in LPS induced MS1 cells.

Pancreatitis, acute necrotizing; Ginkgolides; Lipopolysaccharides; Microvessels; Endothelial cells

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.06.007

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173393)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(12JCZDJC25500)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院基金面上項(xiàng)目(FYM201522)；西青醫(yī)院院級(jí)課題基金面上項(xiàng)目(XQLX201406)

300162 天津，中國武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰脾中心

夏時(shí)海，Email：xshhcx@sina.com

2015-04-03)