免疫磁珠聯(lián)合定量PCR檢測胰腺癌患者冷凍前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞的變化

穆峰 陳繼冰 姜峰 汪媛 曾健瀅 姚飛 牛立志 徐克成

·論著·

免疫磁珠聯(lián)合定量PCR檢測胰腺癌患者冷凍前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞的變化

穆峰 陳繼冰 姜峰 汪媛 曾健瀅 姚飛 牛立志 徐克成

目的采用免疫磁珠(MACS)聯(lián)合定量PCR法檢測胰腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs) ，分析冷凍消融術(shù)前后CTCs變化及其與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。方法 收集2011年11月至2013年6月暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬復(fù)大腫瘤醫(yī)院收治的20例行冷凍消融術(shù)的胰腺癌患者，使用MACS聯(lián)合定量PCR法檢測患者術(shù)前及術(shù)后10 d外周血CTCs。治療后隨訪2年，記錄患者的預(yù)后，分析CTCs對患者預(yù)后的預(yù)測價值。結(jié)果 20例患者冷凍術(shù)前1 d 外周血CTCs陽性檢測率為45.0%，冷凍術(shù)后10 d CTCs陽性檢測率為15.0%，治療后患者的CTCs陽性率較術(shù)前顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.286，P<0.05)。3例術(shù)后CTCs陽性患者的中位生存期為5個月，17例術(shù)后CTCs陰性患者中位生存期為8個月，CTCs陰性患者的生存期顯著長于CTCs陽性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.552，P=0.0185)。結(jié)論 采用MACS聯(lián)合定量PCR法檢測胰腺癌患者外周血CTCs，對評估行冷凍治療胰腺癌患者的預(yù)后有一定臨床價值。

胰腺腫瘤； 循環(huán)腫瘤細(xì)胞； 預(yù)后； 冷凍消融術(shù)

胰腺癌是世界范圍內(nèi)對人類生存威脅較大的惡性腫瘤，90%的胰腺癌患者在診斷后1年內(nèi)死亡，5年生存率僅為1%～3%[1-2]。雖然以手術(shù)為主的綜合治療可延長生存率，但是5年生存率仍較低，約為4%，即使行根治性切除術(shù)，80%的患者2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3-6]。其預(yù)后不良的原因主要是轉(zhuǎn)移。大量研究表明，循環(huán)血腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)水平是一種可靠的預(yù)后指標(biāo)，它能有效地預(yù)測腫瘤患者的進(jìn)展情況和預(yù)后生存期[7-8]。Kurihara等[9]采用免疫磁珠負(fù)性富集結(jié)合免疫熒光染色的方法檢測胰腺癌患者CTCs，結(jié)果顯示術(shù)前檢測出CTCs的患者預(yù)后不良。本研究采用免疫磁珠負(fù)性富集結(jié)合熒光定量PCR的方法檢測胰腺癌患者冷凍消融治療前后外周血CTCs的變化，評價其對胰腺癌患者臨床預(yù)后的應(yīng)用價值。

材料與方法

一、研究方案

收集暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬復(fù)大腫瘤醫(yī)院2011年11月至2013年6月入院接受冷凍治療的胰腺癌患者的病例資料。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理及影像學(xué)確診的4期胰腺癌；(2)患者經(jīng)綜合分析原發(fā)灶不可手術(shù)切除，且接受冷凍消融治療；(3)患者簽署知情同意書，同意入組。本研究經(jīng)廣州復(fù)大腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并在倫理委員會指導(dǎo)下進(jìn)行。經(jīng)過整理，共20例胰腺癌患者入組，其中男性12例，女性8例，年齡42～84歲，中位年齡65歲。胰腺導(dǎo)管腺癌16例，其他類型胰腺癌4例。

二、CTCs免疫磁性標(biāo)記、富集和分選

采集入組患者冷凍消融術(shù)前1 d及術(shù)后10 d外周血10 ml，分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，將分選FC受體(FcR)阻斷劑(100 μl)和抗上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)單抗耦聯(lián)的磁性微珠(100 μl)先后加入樣本的細(xì)胞懸液混勻，4～8℃孵育30 min，然后將細(xì)胞懸液流經(jīng)置于磁場中的MS分選柱進(jìn)行EpCAM陽性細(xì)胞分選。免疫磁珠分選系統(tǒng)(MACS)和EpCAM陽性細(xì)胞分選試劑盒均購自德國美天妮公司，按說明書操作。

三、RNA提取及cDNA合成

采用Trizol(Invitrogen公司) 提取經(jīng)免疫磁珠富集分離后的細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測濃度后，取2 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)總體積為20 μl，含25 mmol/L MgCl24 μl，Oligod引物1 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10×RT buffer 2 μl，RNA酶抑制劑0.5 μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.625 μl。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，最后反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至100 μl，置-20℃冰箱儲存。所用試劑均購于大連寶生物工程公司。

四、熒光定量PCR檢測

根據(jù)GeneBank目的基因的cDNA序列，應(yīng)用Primer 3.0軟件設(shè)計跨內(nèi)含子引物。引物序列見表1，委托生工生物工程(上海)有限公司合成。使用SYBR?PremixExTaqTM(TARAKA，大連)檢測mRNA表達(dá)。反應(yīng)體系：cDNA 2 μl，SYBR?PremixExTaqTM10 μl，50×Rox Reference Dye 0.4 μl，10 μmol/L上下游引物各0.4 μl，ddH2O 6.8 μl，總共20 μl。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min， 95℃ 5 s、60℃ 20 s、72℃ 15 s，40個循環(huán)。以ACTB為內(nèi)參。

表1 胰腺CTC表面標(biāo)志物的擴(kuò)增引物

五、免疫磁珠負(fù)性富集結(jié)合熒光定量PCR法的檢測

計數(shù)106個PANC1胰腺癌細(xì)胞，逐級進(jìn)行10倍稀釋，獲取105、104、103、102、10、1個胰腺癌細(xì)胞，提取RNA，分別與10 ml健康志愿者血標(biāo)本所提取的RNA相混合后進(jìn)行定量RT-PCR檢測。擴(kuò)增效率設(shè)為96%～104%；斜率設(shè)置為-3.1～-3.5和-3.113；R2≥0.99。檢測閥值設(shè)定在最低樣本濃度情況下4個腫瘤標(biāo)志物同時出現(xiàn)擴(kuò)增信號時的Ct值[10]，KRT19、MUC1、CEACAM5、BIRC5的檢測Ct閾值分別為36.8、37.5、37.6、38.0。任意一個基因的擴(kuò)增Ct值大于該閥值即為CTCs陽性。

六、統(tǒng)計分析

應(yīng)用美國San Diego公司GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗比較冷凍前后CTCs變化，生存率曲線采用Kaplan-Me-ier方法描繪，采用Long-rank檢驗比較生存期差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、冷凍前后CTCs表面標(biāo)志物表達(dá)的變化

冷凍治療前共9例CTCs陽性，陽性率為45.0%，其中3個標(biāo)志物均陽性2例，2個標(biāo)志物陽性7例；術(shù)后共3例CTCs陽性，陽性率為15.0%，其中3個標(biāo)志物均陽性1例，2個標(biāo)志物均陽性2例。術(shù)前陽性的9例中7例術(shù)后轉(zhuǎn)陰；1例術(shù)前3個標(biāo)志物陽性，術(shù)后2個標(biāo)志物仍陽性，1個標(biāo)志物轉(zhuǎn)陰；1例術(shù)前3個標(biāo)志物陽性，術(shù)后2個標(biāo)志物轉(zhuǎn)陰，1個標(biāo)志物術(shù)前為陰性，術(shù)后轉(zhuǎn)陽。1例術(shù)前陰性者術(shù)后3個標(biāo)志物轉(zhuǎn)陽。20例患者KRT19、MUC1、BIRC1、CEACAM5具體表達(dá)情況見表2。冷凍治療后外周血CTCs陽性率較術(shù)前顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.286，P=0.038)。

二、治療后CTCs轉(zhuǎn)陰與預(yù)后的關(guān)系

20例患者冷凍術(shù)后隨訪2年，3例術(shù)后CTCs陽性患者的中位生存期為5個月，17例術(shù)后CTCs陰性患者中位生存期為8個月，CTCs陰性患者的生存期顯著長于CTCs陽性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.552，P=0.0185，圖1)。

討 論

腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)稱之為CTCs，它們形成的微轉(zhuǎn)移灶是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提，但并不是所有進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞均能夠?qū)е逻h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因為進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞絕大多數(shù)會在短期內(nèi)死亡。由于宿主的免疫識別和機(jī)械殺傷作用以及腫瘤細(xì)胞自身因素，只有極少數(shù)具有高度活力，高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中得以生存，相互聚集或分裂增殖形成微小癌栓，并在一定條件下再次脫離循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)入組織內(nèi)發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，因此CTCs是經(jīng)過體內(nèi)免疫系統(tǒng)的篩選之后所剩余的腫瘤細(xì)胞，其在生物學(xué)特性上具有和腫瘤干細(xì)胞相似的特點。少數(shù)具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞可以在不同于原位腫瘤的微環(huán)境中存活，稱之為循環(huán)腫瘤干細(xì)胞。

CTCs抵達(dá)組織、器官可以形成新的腫瘤，檢測這些細(xì)胞表面的腫瘤標(biāo)志物可明確CTCs的存在。目前研究顯示，乳腺癌、結(jié)直腸癌、腦瘤等惡性腫瘤中CTCs的數(shù)量均與患者的預(yù)后密切相關(guān)[7-8, 11]，De Giorg等[12]對晚期乳腺癌進(jìn)行PET-CT檢查，并檢測患者外周血CTCs，結(jié)果顯示有骨轉(zhuǎn)移患者的CTCs

表2 腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物mRNA表達(dá)情況

注：“-”冷凍治療前，“+”冷凍治療后，n.s未發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)

圖1 冷凍治療患者的術(shù)后生存時間

數(shù)量顯著多于無骨轉(zhuǎn)移者，認(rèn)為CTCs是影響預(yù)后的獨立危險因素。本研究利用MACS聯(lián)合定量PCR法檢測胰腺癌外周血KTR19、MUC1、BIRC1、CEACAM5腫瘤標(biāo)志物，分析胰腺癌冷凍消融術(shù)前后外周血CTCs的變化。結(jié)果顯示20例行冷凍消融術(shù)的胰腺癌患者的術(shù)前CTCs陽性率為45.0%，術(shù)后降為15.0%，術(shù)后CTCs陰性患者總生存期顯著長于CTCs陽性患者，提示檢測外周血CTCs可能在評估冷凍術(shù)后患者預(yù)后方面有一定價值。至于本研究中有1例術(shù)前陰性術(shù)后轉(zhuǎn)陽是何原因尚待進(jìn)一步探討。

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(本文編輯：屠振興)

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Change of circulating tumor cells in pancreatic cancer patients detected by magnetic activated cell sorting (MACS) combined with RT-qPCR

MuFeng,ChenJibing,JiangFeng,WangYuan,ZengJianying,YaoFei,NiuLizhi,XuKecheng.DepartmentofOncologicalSurgery,FudaCancerHospital,MedicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510665,China

Correspondingauthor:NiuLizhi,Email:fudaclab@gmail.com

Objective To evaluate the circulating tumor cells (CTCs) in peripheral blood by using magnetic activated cell sorting (MACS) combined with RT-qPCR, and analyze the relationship between CTCs and the prognosis. Methods From January 2013 to December 2014, 20 pancreatic cancer patients underwent cryoblation in Fuda Cancer Hospital Affiliated to Medical College of Jinan University were enrolled. MACS combined with RT-qPCR were used to identify preoperative CTCs and CTCs at 10 days postoperatively. The patients were followed in the next two year, and the prognosis was recorded, then the relationship between CTCs and the prognosis was analyzed. Results In the 20 cases, positive rate of preoperative CTCs was 45%, which decreased to 15% postoperatively, and the difference between the two groups was statistically significant (χ2=4.286,P<0.05). The median survival of 3 patients with positive CTCs was 5 months, and the median survival of 17 patients with negative CTCs was 8 months, the median survival of patients with negative CTCs was significantly longer than those patients with positive CTCs, and the difference between the two groups was statistically significant (χ2=5.552,P=0.0185). Conclusions It is of value to detect the circulating tumor cells in peripheral blood by MACS combined with RT-qPCR. CTCs is a potential indicator for predicting the prognosis of pancreatic cancer with cryoablation.

Pancreatic neoplasms； Circulating tumor cell； Prognosis; Cryosurgery

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.06.002

廣州天河區(qū)科技計劃項目資助(201209kw008)

510665 廣州，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬復(fù)大腫瘤醫(yī)院腫瘤外科

牛立志，Email: fudaclab@gmail.com

2015-02-02)