人肺鱗癌細(xì)胞電阻抗譜測(cè)量實(shí)驗(yàn)研究

張 倩 方 云 董長(zhǎng)征 馬 青

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

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人肺鱗癌細(xì)胞電阻抗譜測(cè)量實(shí)驗(yàn)研究

張 倩 方 云 董長(zhǎng)征 馬 青*

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

在1 kHz～100 MHz范圍內(nèi)，采用Agilent 4294A精密阻抗分析儀，測(cè)量人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞懸浮液的電阻抗，通過(guò)電阻抗頻譜圖和Nyquist圖的分析，提取肺癌細(xì)胞電阻抗頻譜的特征參數(shù)，并與人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：肺癌細(xì)胞與正常人肺細(xì)胞懸浮液的電阻抗譜存在著較顯著的差異；肺鱗癌細(xì)胞的電阻抗實(shí)部增量最大值(ΔZmax)和電阻抗虛部峰值(Z″P)與細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)(Φ)呈線性關(guān)系；肺鱗癌細(xì)胞懸浮液阻抗譜的特征頻率(fc)低于正常人肺細(xì)胞的54.72%(P<0.001)，并且不受細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的影響。這表明，細(xì)胞懸浮液阻抗譜特征頻率可以用于區(qū)分肺鱗癌細(xì)胞和正常人肺細(xì)胞，可為肺鱗癌細(xì)胞的鑒定與分型提供電生理指標(biāo)。

人肺鱗癌細(xì)胞；電阻抗頻譜；Nyquist圖；特征頻率

引言

肺癌的發(fā)病率和死亡率在中國(guó)乃至全世界皆位居首位[1]。肺癌的種類和分期較復(fù)雜，因此需要不斷發(fā)展新的診斷方法來(lái)完善肺癌的早期診斷技術(shù)。細(xì)胞在癌變過(guò)程中，除了結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化外，其電生理特性也會(huì)發(fā)生明顯變化[2]。電阻抗技術(shù)是一種非侵入性、免標(biāo)記、實(shí)時(shí)性強(qiáng)[3]的電生理研究方法，最早應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和食品檢測(cè)領(lǐng)域，如細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[4-5]和細(xì)菌檢測(cè)[6-7]等。目前，電阻抗技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于人體離體及在體組織水平和細(xì)胞水平的理論研究及臨床應(yīng)用，比如基于人肺組織電阻抗譜的肺癌診斷，基于細(xì)胞懸浮液阻抗譜的乳腺癌細(xì)胞分期[8]，脂肪干細(xì)胞[9]、卵巢癌細(xì)胞[10]、神經(jīng)細(xì)胞[11]的電阻抗特性研究等。但是，人體組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)以及不勻質(zhì)性，使得在組織學(xué)水平上的電阻抗研究較為復(fù)雜，而且不能直觀反映細(xì)胞水平的電阻抗信息。因此，筆者在1 kHz～100 MHz范圍內(nèi)，應(yīng)用阻抗測(cè)量技術(shù)，研究肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1和人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B懸浮液的電阻抗頻譜特性，分析了兩者之間的差異，探討利用細(xì)胞學(xué)水平上的電阻抗差異來(lái)輔助診斷肺癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和人肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))分別使用RPMI-1640(GIBCO公司)和MEM(GIBCO公司)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基含有10%小牛血清(Hyclone公司)、100 U/mL青霉素和鏈霉素(GIBCO公司)，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為溫度37℃、CO2濃度5%、濕度100%。

1.2 細(xì)胞懸浮液的準(zhǔn)備

在無(wú)菌條件下，將貼壁生長(zhǎng)的BEAS-2B和SK-MES-1細(xì)胞，消化收集到15 mL離心管中。將離心管在25℃、1 000 r/min的條件下離心10 min，得到高濃度富集細(xì)胞懸液，待電阻抗測(cè)量。

1.3 電阻抗譜與細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的測(cè)量

電阻抗譜與細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)測(cè)量見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)時(shí)細(xì)胞的電阻抗譜。 (a)和(b) 人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞和肺鱗癌細(xì)胞的Z(f)曲線；(c)和(d) 人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞和肺鱗癌細(xì)胞的Z″(f)曲線Fig.1 The electric impedance spectra of BEAS-2B and SK-MES-1 cell suspensions of different volume fractions. (a) and (b)The real parts Z(f) of BEAS-2B and SK-MES-1; (c) and (d) The imaginary parts Z″(f) of the two cells

1.4 電阻抗關(guān)系式

測(cè)量完畢后，需要將測(cè)量到的電容C和電導(dǎo)G轉(zhuǎn)換成復(fù)電阻抗，復(fù)電阻抗Z*=|Z*|×e-jθ=Z′+jZ″。其中，實(shí)部Z′=|Z*|cosθ，虛部Z″=|Z*|sinθ，相位角θ，電阻抗實(shí)部增量ΔZ=Z-Zh，Zh為電阻抗實(shí)部高頻極限值，實(shí)部增量最大值ΔZmax=ZL-Zh，其中ZL為電阻抗實(shí)部低頻極限值。電場(chǎng)頻率f，電阻抗譜特征頻率記為fc，角頻率ω=2πf，虛部單位j=(-1)1/2，電阻抗虛部峰值記作Z″P。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞電阻抗頻譜

圖1中的(a)和(b)分別為正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞和肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞的電阻抗實(shí)部Z隨外加電場(chǎng)頻率f變化的曲線。兩者有相似之處：一是在1～100 kHz范圍內(nèi)，電阻抗實(shí)部曲線基本保持水平，下降趨勢(shì)不明顯；在100 kHz～100 MHz范圍內(nèi)，Z值隨著頻率的增加顯著下降。二是隨著細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的增加，Z值也隨之增加，在1～100 kHz范圍內(nèi)增加的幅度較大，在100 kHz～100 MHz范圍內(nèi)增加的幅度較小。三是電阻抗實(shí)部最大增量ΔZmax與細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)Φ呈線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為：正常肺上皮細(xì)胞ΔZmax=12.78+4.08Φ，肺鱗癌細(xì)胞ΔZmax=-10.59+4.37Φ。肺鱗癌細(xì)胞的斜率高于正常肺上皮細(xì)胞，表明細(xì)胞懸浮液體積分?jǐn)?shù)的變化對(duì)肺癌細(xì)胞電阻率的影響大于對(duì)正常細(xì)胞電阻抗的影響。由于不同細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的電阻抗實(shí)部高頻極限值接近，所以電阻抗實(shí)部最大增量ΔZmax實(shí)際上由電阻抗實(shí)部低頻極限值決定，反映了細(xì)胞懸浮液阻抗譜在低頻時(shí)的阻抗特性。

圖1(c)和(d)分別為正常細(xì)胞與肺鱗癌細(xì)胞的電阻抗虛部Z″隨外加電場(chǎng)頻率f變化的曲線。它們的相似之處：一是隨著外加電場(chǎng)頻率的增加，曲線呈單一弛豫峰分布。二是電阻抗虛部峰值Z″P與細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)Φ呈線性關(guān)系，其線性回歸方程分別是：正常肺上皮細(xì)胞Z″P=8.09-1.01Φ，肺鱗癌細(xì)胞Z″P=11.90-1.12Φ，肺鱗癌細(xì)胞對(duì)應(yīng)的Z″P與Φ之間的線性回歸方程的截距和斜率不同于正常肺上皮細(xì)胞。三是電阻抗虛部峰值對(duì)應(yīng)的電場(chǎng)頻率為細(xì)胞懸浮液阻抗譜的特征頻率fc，其中BEAS-2B的特征頻率處于0.7 MHz附近，而SK-MES-1的特征頻率明顯降低，處在0.3 MHz附近。另外，隨著細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞的特征頻率基本保持不變。

2.2 細(xì)胞的Nyquist圖

圖2中(a)和(b)分別為BEAS-2B和SK-MES-1細(xì)胞的Nyquist圖，又稱復(fù)電阻抗平面圖，描述了不同頻率的電阻抗實(shí)部Z與虛部Z″之間的關(guān)系。隨著外加電場(chǎng)頻率的增加，Nyquist圖從右向左延伸為半圓弧和一個(gè)上揚(yáng)尾，圓弧的圓心在橫軸的下方，圓弧頂點(diǎn)對(duì)應(yīng)特征頻率fc處的復(fù)電阻抗，橫軸的右截距為ΔZmax。隨著細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的增加，Nyquist圖向右擴(kuò)展，圓弧包圍面積增加，實(shí)部增量最大值ΔZmax增加。與正常肺上皮細(xì)胞比較，鱗癌細(xì)胞的ΔZmax略低。

從圖1和圖2提取的相關(guān)電阻抗參數(shù)見(jiàn)表1。細(xì)胞懸浮液阻抗譜受細(xì)胞種類和懸浮液體積分?jǐn)?shù)的影響。通過(guò)對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)條件下阻抗參數(shù)值的提取，分析其參數(shù)數(shù)值與體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系，有助于確定該參數(shù)是否可以作為細(xì)胞的特征參數(shù)。特征參數(shù)可以用來(lái)簡(jiǎn)化圖形形式的阻抗譜，同時(shí)可用于細(xì)胞分型及細(xì)胞的定量計(jì)算。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)時(shí)細(xì)胞的Nyquist圖。(a)BEAS-2B；(b)SK-MES-1Fig.2 The Nyquist plots of BEAS-2B and SK-MES-1 cell suspensions of different volume fractions. (a)BEAS-2B;(b)SK-MES-1

表1 正常細(xì)胞與肺鱗癌細(xì)胞的電阻抗頻譜特征參數(shù)

Tab. 1 The electrical impedance spectral characteristic parameters of human lung squamous carcinoma cells and normal cells

細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)/%實(shí)部最大增量ΔZmax/(Ω·cm)虛部峰值Z″P特征頻率fc/MHzBEAS?2BSK?MES?1BEAS?2BSK?MES?1BEAS?2BSK?MES?11576327335970903066031251066410630156916580660293516124131032966237306603144182781836538693867071029

2.3 細(xì)胞特征頻率與體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系

圖3是細(xì)胞特征頻率fc與體積分?jǐn)?shù)Φ之間的散點(diǎn)圖。在Φ=14%～52%范圍，經(jīng)過(guò)線性回歸分析，得到fc與Φ的線性回歸方程(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明，兩條線性回歸方程的斜率(-0.000 6和-0.000 2)極低，即回歸直線近乎與橫坐標(biāo)軸平行，這說(shuō)明特征頻率與細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的變化無(wú)關(guān)。最重要的差別是：肺癌細(xì)胞懸浮液阻抗譜的特征頻率fc顯著低于正常細(xì)胞的這一數(shù)值，只有正常人肺細(xì)胞懸浮液阻抗譜特征頻率的54.72%(P<0.001，如圖4所示)。

圖3 特征頻率與細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系Fig.3 Relationship between characteristic frequency and cell volume fraction

圖4 細(xì)胞特征頻率的比較Fig.4 Comparison of cellular characteristic frequency

3 討論

細(xì)胞懸浮液屬于非均勻的電介質(zhì)體系，具有絕緣和導(dǎo)電雙重特性。細(xì)胞膜將細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液隔離，形成細(xì)胞內(nèi)液-細(xì)胞膜-細(xì)胞外液三相的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜內(nèi)外介質(zhì)的電導(dǎo)率不同。當(dāng)細(xì)胞處于頻率變化的電場(chǎng)中時(shí)，在細(xì)胞膜兩側(cè)會(huì)形成離子聚集，從而產(chǎn)生細(xì)胞界面極化現(xiàn)象，即Maxwell-Wagner效應(yīng)[13]。此效應(yīng)可以依據(jù)激勵(lì)電壓V(ω)與響應(yīng)電流I(ω)之比等于復(fù)數(shù)電阻抗(Z(ω)=V(ω)/ I(ω))，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞電阻抗頻譜測(cè)量。

由圖1可知，人肺癌細(xì)胞懸浮液的電阻抗譜表現(xiàn)為：在1 kHz～100 MHz頻率范圍內(nèi)，隨著外加電場(chǎng)頻率的增加，細(xì)胞的電阻抗實(shí)部(Z)先保持穩(wěn)定然后逐漸減小，電阻抗虛部(Z″)呈現(xiàn)先增后減的單峰狀。該現(xiàn)象可以依據(jù)細(xì)胞三元件電路模型[14]進(jìn)行解釋：當(dāng)外加電場(chǎng)角頻率(ω=2πf)較低時(shí)，細(xì)胞膜的容抗(Zm=1/jωC)較大，電流將會(huì)繞過(guò)細(xì)胞在細(xì)胞外液中流動(dòng)，此時(shí)細(xì)胞膜相當(dāng)于電容性斷路狀態(tài)，表現(xiàn)為高阻抗性。 隨著電場(chǎng)角頻率(ω=2πf)的增加，細(xì)胞膜的容抗(Zm=1/jωC)逐漸減小，少量電流可以通過(guò)細(xì)胞膜。當(dāng)外加電場(chǎng)頻率足夠高時(shí)，細(xì)胞膜容抗相當(dāng)?shù)停藭r(shí)電流可以順利通過(guò)細(xì)胞內(nèi)液，細(xì)胞膜處于電容性短路狀態(tài)，表現(xiàn)為低阻抗值。在圖1(c)和(d)中，因存在外加交變電場(chǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞膜極化作用，當(dāng)外加電場(chǎng)頻率等于fc時(shí)，電阻抗虛部(Z″)達(dá)到峰值(Z″P)。另外，肺癌細(xì)胞懸浮液的電阻抗譜受懸浮液的體積分?jǐn)?shù)影響，即隨著細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞的電阻抗的實(shí)部(Z)和虛部(Z″)及實(shí)部最大增量(ΔZmax)都隨之增加，但阻抗譜的形狀基本保持一致。該現(xiàn)象的解釋是：當(dāng)細(xì)胞體積分?jǐn)?shù)增大時(shí)，細(xì)胞密度增加，單位體積極化的細(xì)胞膜表面積也隨之增大，引起電阻抗實(shí)部Z、虛部Z″和實(shí)部最大增量ΔZmax增大。結(jié)合表1可知，肺癌細(xì)胞的ΔZmax和Z″P均低于正常細(xì)胞，原因是：與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞的細(xì)胞膜滲透性較高[15]，細(xì)胞骨架較為松散不規(guī)則，骨架蛋白成分也發(fā)生改變[16]，這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組成上的變化導(dǎo)致癌細(xì)胞的電阻抗低于正常細(xì)胞。

圖2所示復(fù)阻抗平面圖的半圓弧特征來(lái)源于細(xì)胞膜的極化效應(yīng)，即Maxwell-Wagner效應(yīng)，也是肺癌細(xì)胞電阻抗在復(fù)平面的特征性響應(yīng)。圖3的特征頻率fc與體積分?jǐn)?shù)的回歸曲線分析表明，測(cè)試樣本的fc與體積分?jǐn)?shù)不相關(guān)。體積分?jǐn)?shù)表明測(cè)試樣本中所含細(xì)胞的多少，圖4顯示肺癌細(xì)胞的fc顯著低于正常細(xì)胞，說(shuō)明了fc的重要意義。fc的變化反映了正常人肺上皮BEAS-2B細(xì)胞與肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞自身內(nèi)在的固有特性，與測(cè)試樣本中所含細(xì)胞的多少無(wú)關(guān)。在本研究中，肺癌細(xì)胞的fc顯著低于正常細(xì)胞的結(jié)果，為肺癌細(xì)胞的鑒定或分型提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可作為肺癌細(xì)胞鑒定與分型的電生理指標(biāo)。

4 結(jié)論

通過(guò)細(xì)胞電阻抗譜的測(cè)量，獲得肺鱗癌細(xì)胞(SK-MES-1)頻域電學(xué)特性，如電阻抗實(shí)部最大增量(ΔZmax)、虛部峰值(Z″P)和特征頻率(fc)等特征參數(shù)，并發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的ΔZmax、Z″P和fc低于正常肺上皮細(xì)胞,故可應(yīng)用這些電特性指標(biāo)觀察或評(píng)價(jià)抗癌藥物的療效。

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The Measurement of Electrical Impedance Spectrum of Human Lung Squamous Carcinoma Cells

Zhang Qian Fang Yun Dong Changzheng Ma Qing*

(MedicineSchool,NingboUniversity,Ningbo315211,Zhejiang,China)

human lung squamous carcinoma cell; impedance spectra; Nyquist plots; characteristic frequency

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 01.016

2014-09-09， 錄用日期:2014-10-23

浙江省新苗人才計(jì)劃(2013R405060)；寧波市自然科學(xué)基金(2012A610211，2013A610211)

R734.2 Q64

D

0258-8021(2015) 01-0114-05

*通信作者 (Corresponding author)， E-mail: maqing@nbu.edu.cn