通過抑制自噬作用增強聲動力學(xué)療法誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡研究

馮曉蘭 王 攀 王筱冰

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710062)

引言

聲動力學(xué)療法(sonodynamic therapy，SDT)是在光動力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)的基礎(chǔ)上，建立和發(fā)展起來的一種腫瘤治療方法［1］。它主要是利用超聲對生物組織有較強的穿透作用，且能聚焦于深層組織的腫瘤部位并激活腫瘤組織中特異性富集并長時間滯留的聲敏劑，從而殺傷腫瘤細胞和抑制腫瘤組織生長。SDT抗腫瘤有較強的靶向性、安全性和廣譜性，而且超聲治療裝置簡單，造價低廉。因此，SDT研究具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用前景［2］。

SDT是抗癌研究另辟蹊徑的新方法探索，涉及生物、醫(yī)學(xué)、物理和化學(xué)諸多領(lǐng)域，目前國內(nèi)外學(xué)者就其實驗裝置、理化參數(shù)、抗腫瘤機理等開展了多學(xué)科研究，并取得了一些令人欣慰的進展。尤其是低強度超聲可以誘導(dǎo)細胞凋亡引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。2000年，Ashush等首次報道了低強度超聲可以誘導(dǎo)人白血病細胞HL－60、K562、U937和M1/2發(fā)生凋亡［3］。隨后，又有學(xué)者對SDT誘導(dǎo)細胞凋亡及相關(guān)機制開展了研究［2，4］。本課題組在超聲結(jié)合卟啉類聲敏劑抗腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，SDT誘導(dǎo)細胞凋亡具有一定的普遍性，誘發(fā)不同腫瘤細胞凋亡的最低用藥劑量和超聲強度及輻照時間均有所不同，在同等處理條件下，不同細胞受誘導(dǎo)后表現(xiàn)出的凋亡比例和程度亦有差異［5－6］。

自噬是細胞死亡研究領(lǐng)域的新課題，有研究表明自噬既作為一種防御機制來抵御環(huán)境變化對細胞造成的損傷，同時也作為一種死亡程序誘導(dǎo)細胞主動性死亡，即II型程序性細胞死亡，它與I型程序性細胞死亡(細胞凋亡)之間有著密不可分的聯(lián)系［7］。Kessel等在PDT處理L1210細胞研究中發(fā)現(xiàn)，PDT在誘導(dǎo)細胞凋亡的同時亦可以引發(fā)細胞自噬，但自噬在PDT介導(dǎo)的細胞死亡模式中的具體機制尚不清楚，其可能依賴于光敏劑類型及PDT劑量等［8］。大量研究工作已證實SDT可以誘導(dǎo)細胞凋亡或壞死［4－6］，但關(guān)于SDT在殺傷腫瘤細胞的同時能否誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬方面的報道較少。本研究通過分析在超聲結(jié)合原卟啉IX(protoporphyrin IX，PpIX)誘導(dǎo)S180細胞死亡過程中，是否存在自噬現(xiàn)象以及自噬在細胞存活中的作用，初步探討了細胞自噬與細胞凋亡的關(guān)系，為SDT抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供有價值的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng)

S180腫瘤細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、1 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在5%的CO2、37℃培養(yǎng)箱及飽和水蒸氣條件下常規(guī)培養(yǎng)及傳代，實驗用細胞為對數(shù)生長期細胞。

1.1.2 試劑

原卟啉IX鈉鹽為Sigma公司產(chǎn)品，用去離子水避光溶解，濃度為5.0 mg/mL，過濾除菌，分裝于Eppendof管中，－20℃避光保存。

噻唑藍(MTT)、羅丹明 123(RHO123)、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、吖啶橙(AO)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、z-VAD-fmk購自Sigma公司。巴伐洛霉素A1(Ba A1)為Millipore公司產(chǎn)品。LC3和actin抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.1.3 超聲裝置

超聲換能器由陜西省超聲學(xué)重點實驗室研制，超聲功率放大器為美國T＆C公司產(chǎn)品(AG-1020)。流式細胞儀為 Millipore公司產(chǎn)品(guava easyCyte8HT)，熒光顯微成像系統(tǒng)為Nikon E600，酶標(biāo)儀為Bio-Tek Elx800。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的收集及處理

無菌條件下收集S180培養(yǎng)細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為1×106cells/mL，重懸在無血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中。將細胞懸液均勻分裝到一次性醫(yī)用試管中，每管 1 mL，隨機分為對照組(Control group，CT)，單純原卟啉 IX組(Protoporphyrin IX alone group，P)，超聲組(Ultrasound alone group，U)，超聲結(jié)合原卟啉IX組(Protoporphyrin IX combined with Ultrasound group，UP)。P和 UP組細胞加入 PpIX，使其終濃度為1 μg/mL，37℃培養(yǎng)箱中避光孵育45min，使PpIX在S180腫瘤細胞內(nèi)含量達到最大;U和UP組樣品在頻率為1.1 MHz、功率為3 W/cm2的超聲裝置中分別處理60 s。聲照處理后，各組細胞重懸到RPMI-1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育，不同時間點取材進行后續(xù)實驗操作。

1.2.2 MTT檢測細胞毒效應(yīng)

處理后4 h，MTT法檢測各實驗組的細胞毒作用，對照組和各處理組細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL細胞懸液，每組6個復(fù)孔。將接種后的培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)不同時間，避光條件下每孔加入10 μL MTT母液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL三聯(lián)液，37℃孵育17 h，酶標(biāo)儀檢測570 nm處光吸收值(OD值)，計算各組細胞相對存活率。細胞相對存活率=(實驗組OD/對照組OD)×100%。

1.2.3 線粒體膜電位(MMP)檢測

RHO 123能夠選擇性進入細胞并滯留在膜電位完整的線粒體中，RHO123的熒光強度與線粒體膜電位變化呈正相關(guān)。SDT處理后1 h，不同處理組細胞與2 μg/mL的RHO 123在37℃避光孵育20 min后，PBS漂洗3次，然后重懸到Hanks溶液中進行流式細胞儀檢測RHO 123的熒光強度(激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm)。同時，取部分細胞懸液，滴片，熒光顯微鏡觀察，同時采集RHO 123熒光圖像和相差圖像。

1.2.4 DAPI染色

DAPI是一種DNA結(jié)合染料，能夠反映細胞核的形態(tài)變化。SDT處理后8 h，收集各組細胞，加入終濃度為 4 μg/mL 的 DAPI，室溫染色30 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察并照相。

1.2.5 吖啶橙染色

吖啶橙是一種熒光染料，其發(fā)出的熒光會隨著細胞內(nèi)的pH值變化而變化，利用吖啶橙活細胞染色能夠檢測細胞自噬現(xiàn)象［9］。在吖啶橙染色的細胞中，胞漿和核仁發(fā)亮綠色和暗紅色熒光，而酸性細胞器發(fā)亮紅色熒光，紅色熒光的強度與酸性細胞器的酸度和容積成正相關(guān)。因此，酸性的自噬泡被吖啶橙染色后可以在熒光顯微鏡下觀察到點狀紅色斑點。SDT處理后1 h，細胞懸液中加入1 mg/mL的吖啶橙，37℃避光反應(yīng)20 min，棄染液，熒光顯微鏡觀察并照相。

1.2.6 Western blotting

檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化。LC3(微管相關(guān)蛋白Ⅰ的輕鏈3)有兩種類型，在自噬發(fā)生過程中，LC3由Ⅰ型(18 kDa)向Ⅱ型(16 kDa)轉(zhuǎn)化，LC3-II含量的多少通常用來反映自噬活性的高低。SDT處理后0.5 h，離心收集各組細胞懸液，用100 μL RIPA裂解液冰上裂解1 h，BCA法進行蛋白定量，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加LC3抗體(1∶400)并4℃孵育過夜，二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，X膠片曝光顯影，以Actin蛋白為內(nèi)參。

1.2.7 抑制劑實驗

細胞自噬檢測中常用3-甲基腺嘌呤(磷脂酰肌醇3激酶的抑制劑，3-MA)特異性抑制自噬體形成;巴伐洛霉素A1(Ba A1)特異性抑制自噬體與溶酶體的融合;細胞凋亡中通常采用Caspase廣譜型抑制劑z-VAD-fmk抑制細胞凋亡。實驗通過加入自噬抑制劑檢測SDT處理后對腫瘤細胞凋亡的影響;同時，加入凋亡抑制劑觀察對細胞自噬的影響;初步分析凋亡和自噬應(yīng)答SDT作用的上下游關(guān)系和內(nèi)在聯(lián)系。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果均表示為平均值±SD(標(biāo)準差)，利用Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，P＜0.05視為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測細胞存活率

圖1為MTT檢測各組細胞存活率實驗結(jié)果，從圖中可以看出，與對照組相比，單純PpIX組(1 μg/mL)無明顯細胞毒作用(P＞0.05)，單純超聲組顯示出一定的細胞毒作用(P＜0.05)，其細胞存活率為84.3%，二者聯(lián)合處理后進一步降低了細胞的存活率，其存活率為59.3%(P＜0.01)。

圖1 不同處理組細胞存活率檢測(*與對照組相比P＜0.05，＊＊與對照組相比P＜0.01;△△與PpⅨ組相比P＜0.01;#與超聲組相比P ＜0.05)Fig.1 Detection of cell survival rate after different treatment(*compared with control，P＜0.05;＊＊compared with control，P ＜ 0.01;△△compared with PpⅨ，P ＜0.01;#compared with ultrasound，P ＜0.05)

2.2 SDT誘導(dǎo)細胞凋亡檢測

采用DAPI染色觀察不同處理后4 h時S180腫瘤細胞的細胞核變化情況。從圖2可以看出CT組細胞核大多數(shù)呈圓球形，DAPI藍色熒光呈均勻彌散分布;單純PpIX組與對照組細胞相比，差異不明顯;單純超聲組處理后，個別細胞的DAPI熒光染色有所增強;而在超聲聯(lián)合PpⅨ組中，細胞核藍色熒光增強的細胞數(shù)目進一步增多，部分細胞出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集等現(xiàn)象，呈現(xiàn)出細胞凋亡樣形態(tài)學(xué)變化特征。

2.3 SDT處理后線粒體膜電位(MMP)檢測

圖2 DAPI染色觀察不同處理組細胞核損傷。(a)對照組;(b)PpIX組;(c)超聲組;(d):超聲聯(lián)合PpⅨ組Fig.2 DAPI staining observed the nucleus damage after different treatment.(a)Control;(b)PpⅨ;(c)Ultrasound;(d)Ultrasound plus PpⅨ

圖3主要顯示各處理組細胞的線粒體膜電位變化情況。從圖中可以看出，對照組細胞中RHO123的平均熒光強度(MFI)為1 309.31;單純PpⅨ組的MFI為1 215.55(P＞0.05);單純超聲組的MFI為1 090.24，與對照組相比，其 MMP明顯降低(P＜0.05);超聲聯(lián)合 PpⅨ組的 MFI降至971.28，而且與以上3組相比，均有顯著性差異(P＜0.05)。

2.4 SDT誘導(dǎo)細胞自噬檢測

在自噬發(fā)生過程中，自噬相關(guān)蛋白LC-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化與自噬體的形成正相關(guān)。圖4顯示了Western Blotting檢測各組細胞處理后LC-I和LC3-II蛋白含量變化，從圖中可以看出，單純PpIX組與對照組的LC3-II條帶無明顯差異，單純超聲處理組LC-II條帶明顯加深，與單純超聲組相比，超聲聯(lián)合PpⅨ組LC-II表達進一步增強，提示自噬參與了SDT誘導(dǎo)的S180細胞應(yīng)答。

2.5 自噬和凋亡抑制劑對SDT誘導(dǎo)的細胞凋亡的變化

圖3 不同處理組S180細胞線粒體膜電位變化。(*與對照組相比P＜0.05，＊＊與對照組相比P＜0.01;△△與PpⅨ組相比P＜0.01;#與超聲組相比P＜0.05)Fig.3 Mitochondrialmembranepotential change after different treatment(*compared with control， P ＜ 0.05;＊＊ compared with control，P ＜0.01;△△ compared with PpⅨ，P＜0.01;#compared with ultrasound，P ＜0.05).

圖5為Via-count檢測各組細胞存活率與死亡率的實驗結(jié)果，從圖中可以看出，與對照組相比，超聲聯(lián)合PpⅨ組顯示了明顯的細胞存活降低(60.75%，P＜0.01)和細胞損傷的增加(39.25%，P＜0.01)。而在超聲聯(lián)合PpⅨ處理前用3-MA預(yù)處理組，S180細胞存活明顯下降(37.33%，P＜0.01)，同時損傷的細胞明顯增多(62.67%，P＜0.01)。同樣，在超聲聯(lián)合PpⅨ處理前用Ba A1預(yù)處理組，S180細胞存活下降至45.33%(P＜0.01)，同時損傷的細胞明顯增多至54.67%(P＜0.01)。兩組結(jié)果均顯示相比于UP，加入自噬抑制劑Ba A1(0.1 μM)和3-MA后，S180有更為明顯的細胞受損現(xiàn)象的發(fā)生。

圖4 Western blot檢測S180細胞中LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化。(a)對照組;(b)PpIX組;(c)超聲組;(d):超聲聯(lián)合PpⅨ組Fig.4 Western blot detected the conversion of LC3-I to LC3-II of S180 cells. (a)Control;(b)PpⅨ;(c)Ultrasound;(d)Ultrasound plus PpⅨ

2.6 自噬和凋亡抑制劑對SDT誘導(dǎo)細胞自噬小泡形成的影響

吖啶橙可以自由穿透細胞膜并聚集在酸性成分內(nèi)，呈現(xiàn)出紅色熒光，通?？梢杂脕頇z測酸性小泡的形成［9］。從圖6可以看出，處理后1 h，與對照組相比，超聲聯(lián)合PpⅨ組細胞內(nèi)吖啶橙紅色熒光顯著增強，且這一現(xiàn)象可以被自噬抑制劑Ba A1(0.1 μM)和 3-MA(1.0 mM)所抑制。而細胞凋亡Caspase廣譜型抑制劑z-VAD(5 μM)對細胞內(nèi)酸性自噬小泡的形成影響不明顯。同時，抑制劑在所選濃度范圍內(nèi)不會對對照組細胞造成明顯損傷。

圖5 Via-count檢測不同處理組S180細胞存活率及死亡率變化(＊＊與對照組相比存活的細胞數(shù)P＜0.01;##與對照組相比死亡的細胞數(shù)P＜0.01;δδ與聲動力組相比存活的細胞數(shù);△△與聲動力組相比死亡的細胞數(shù)P＜0.01)Fig.5 Viability of S180 cells as assessed by the Guava Viacount after ultrasound combined with 1 μg/mL PpIX(＊＊ Viable cells compared with control，P ＜0.01;##Damage cells compared with control，P＜0.01;δδViable cells compared with SDT，P ＜0.01;△△Damaged cells compared with SDT，P ＜0.01)

2.7 自噬和凋亡抑制劑對SDT誘導(dǎo)細胞自噬蛋白LC3表達的影響

圖6 吖啶橙活體細胞染色檢測處理后S180細胞胞漿自噬小泡(上為對照組，下為聲動力組)。(a)未加抑制劑;(b)3-甲基腺嘌呤;(c)巴伐洛霉素A1;(d)Caspase廣譜型抑制劑Fig.6 Acridine orange staining detected autophagy vesicles of living cell S180 after different treatment(The upper line is control，the bottom line is with sonodynamic therapy).(a)No inhibitor;(b)3-MA;(c)Ba A1;(d)z-VAD-fmk

圖7 Western blotting檢測不同抑制劑對LC3蛋白表達影響(蛋白條帶從左至右:未加抑制劑組，3-甲基腺嘌呤組，巴伐洛霉素A1組，Caspase廣譜型抑制劑組)。(a)對照組;(b)聲動力組Fig.7 Western blotting test of different inhibitors on LC3 protein expression(The protein band(from left to right)are no inhibitor，3-MA，Ba A1，z-VAD-fmk).(a)Control group;(b)SDT treatment group

圖7顯示，超聲聯(lián)合PpⅨ處理后1 h，LC3-II蛋白條帶可以被3-MA有效抑制，但不會被Ba A1所抑制;相反，無論是對照組還是UP處理組，Ba A1稍微增加了LC3-II蛋白表達，這一結(jié)果可能與Ba A1阻止了自噬體和溶酶體的融合，導(dǎo)致胞漿內(nèi)大量自噬體積聚有關(guān)［10］。然而，Caspase抑制劑z-VAD并沒有明顯改變LC3-II的表達水平。

2.8 自噬和凋亡的抑制劑對SDT誘導(dǎo)S180細胞線粒體膜電位變化的影響

圖8顯示，超聲聯(lián)合PpⅨ處理后1 h，自噬抑制劑3-MA和Ba A1均增強了UP引發(fā)的線粒體膜電位下降。UP和UP+3-MA處理組細胞形態(tài)嚴重變形，線粒體RHO123熒光染色下降。在UP+Ba A1處理組中，線粒體RHO123熒光染色下降，細胞膜表面出現(xiàn)泡狀突起，呈現(xiàn)細胞凋亡樣結(jié)構(gòu)特征。UP+z-VAD處理組與單獨UP處理組相比，細胞內(nèi)線粒體水平變化不明顯，提示線粒體膜電位下降可能是Caspase活化的上游事件。

2.9 自噬和凋亡的抑制劑對SDT誘導(dǎo)細胞凋亡的影響

超聲聯(lián)合PpⅨ處理后8 h，采用DAPI染色觀察不同處理組細胞核形態(tài)變化。圖9顯示相差顯微鏡和DAPI熒光染色結(jié)果:對照組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，DAPI藍色熒光呈均勻彌散分布。超聲聯(lián)合PpⅨ組細胞DAPI染色增強且細胞形態(tài)嚴重變形。超聲聯(lián)合PpⅨ處理前用3-MA預(yù)處理組，S180細胞形態(tài)極度形變，同時展示縮小或變大的細胞核。超聲聯(lián)合PpⅨ前用Ba A1預(yù)處理組，有更多的細胞顯示凋亡細胞核變化特征并伴隨有染色質(zhì)凝集成半月形出現(xiàn)。超聲聯(lián)合PpⅨ前用z-VAD預(yù)處理能部分抑制凋亡細胞核典型特征的出現(xiàn)。

3 討論和結(jié)論

細胞自噬是細胞胞漿和細胞器被雙層膜包被的自噬小體吞噬，并由自噬溶酶體降解消化的過程［11］。自噬的主要作用是應(yīng)付饑餓或環(huán)境刺激以保護細胞生存。但最近的研究表明，自噬在一定條件下被激活可以促進細胞死亡［12］。許多研究還證明細胞自噬和凋亡之間存在相互作用［7，13］。然而，細胞自噬究竟是促進細胞生存還是死亡，目前還沒有一致的結(jié)論，因為不同學(xué)者在不同實驗條件下得到的結(jié)果不同。自噬作為細胞抗癌研究領(lǐng)域的新課題，已成為不同抗癌療法研究細胞應(yīng)答的熱點［14］。

圖8 熒光顯微鏡觀察自噬和凋亡抑制劑對SDT處理后S180細胞線粒體膜電位變化(上為羅丹明123熒光圖像，下為相差圖像。圖片中箭頭所指細胞的放大圖見該圖的右上角)。(a):對照組;(b):聲動力組;(c):聲動力加3-甲基腺嘌呤;(d):聲動力加巴伐洛霉素A1;(e)聲動力加Caspase廣譜型抑制劑Fig.8 Fluorescence microscopy observed mitochondrial membrane potential changed after SDT treatment through adding autophagy and apoptosis inhibitor(The upper line is Rho 123，the bottom line is phase.The cell in the upper right corner of a image is the magnified one indicated by a arrow in the same image).(a)Control;(b)Sonodynamic therapy;(c)SDT+3-MA;(d)SDT+Ba A1;(e)SDT+z-VAD-fmk.

圖9 熒光顯微鏡觀察自噬和凋亡抑制劑對SDT處理后S180細胞DAPI染色結(jié)果(上為DAPI熒光圖像，下為相差圖像。圖片中箭頭所指細胞的放大圖見該圖的右上角)。(a):對照組;(b):聲動力組;(c):聲動力加3-甲基腺嘌呤;(d):聲動力加巴伐洛霉素A1;(e):聲動力加Caspase廣譜型抑制劑。Fig.9 Fluorescence microscopy observed DAPI staining results after SDT treatment through adding autophagy and apoptosis inhibitor(The upper line is Rho 123，the bottom line is phase.The cell in the upper right corner of a image is the magnified one indicated by a arrow in the same image).(a):Control;(b):Sonodynamic therapy;(c)SDT+3-MA;(d)SDT+Ba A1;(e)SDT+z-VAD-fmk.

本研究主要探討頻率為1.1 MHz、輸出功率為3 W/cm2的超聲，聯(lián)合1 μg/mL PpⅨ作用于 S180腫瘤細胞后細胞的應(yīng)答效應(yīng)。MTT實驗結(jié)果顯示在此SDT參數(shù)下，單純PpIX無明顯細胞毒效應(yīng)，單純超聲產(chǎn)生一定的細胞毒性作用，而兩者的協(xié)同作用產(chǎn)生明顯抗腫瘤效應(yīng)，使細胞存活率下降了近40%。細胞凋亡是抗腫瘤研究中有效的細胞死亡方式之一。其中，線粒體在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，線粒體膜電位下降被認為是細胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。聲敏劑PpIX在腫瘤細胞主要分布于線粒體［5］，本研究結(jié)果顯示SDT處理后，細胞的凋亡特征如線粒體膜電位下降、染色質(zhì)凝集、膜起泡等現(xiàn)象非常明顯，提示 PpIX-SDT可能誘導(dǎo)了S180細胞線粒體依賴性凋亡途徑的發(fā)生。在自噬發(fā)生過程中，LC3Ⅱ型通過LC3Ⅰ型的轉(zhuǎn)化而增加，可作為自噬發(fā)生的一個半定量方法［11］。Western blotting檢測SDT處理后4 h，與CT組比較，UP組LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化顯著增加，提示自噬亦可能參與了SDT誘導(dǎo)的S180細胞應(yīng)答效應(yīng)。

以上研究結(jié)果提示，PpIX-SDT處理可以誘導(dǎo)S180細胞發(fā)生凋亡和自噬。細胞自噬與凋亡的相互作用已被很多研究證實，它們具有相同的作用分子，也可以同時存在于同一個細胞中［11］。本研究利用自噬和凋亡的抑制劑研究自噬在SDT誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡中的作用。首先，通過加入兩種自噬抑制劑3-MA和Ba A1，檢測了S180細胞經(jīng)SDT處理后細胞的存活和損傷情況。BaA1作為H+-ATPase的抑制劑，它通過阻止自噬體和溶酶體的融合將細胞自噬阻止在晚期階段［10］。Via-count結(jié)果顯示BaA1能夠有效地加劇SDT處理后的S180細胞的損傷。同樣加入3-MA后(PI3K的抑制劑，可通過抑制自噬體的形成將細胞自噬阻止在早期階段)，細胞存活急劇下降，伴隨著細胞損傷明顯增加，說明了抑制細胞自噬后，細胞受到了更為嚴重的損傷，這可能是通過抑制自噬作用增強了SDT誘導(dǎo)的S180腫瘤細胞發(fā)生了凋亡。隨后通過吖啶橙活細胞染色觀察自噬體的形成，結(jié)果表明SDT處理組S180細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量AVOs，且這一現(xiàn)象可以被Ba A1抑制。但實驗中發(fā)現(xiàn)Ba A1并不能阻止LC3的剪切，相反，卻輕微增加了LC3-II水平。3-MA通過抑制自噬體的形成將細胞自噬阻止在早期階段，可以明顯降低LC3-II蛋白條帶。凋亡抑制劑z-VAD對吖啶橙AVOs染色和LC3剪切均沒有明顯影響。研究提示在本實驗SDT參數(shù)下處理S180細胞所誘導(dǎo)的自噬體的形成，可能是其引發(fā)細胞凋亡的上游事件。為研究自噬在SDT應(yīng)答效應(yīng)中的作用，實驗進一步檢測了線粒體膜電位變化和染色質(zhì)凝集等，結(jié)果表明早在SDT作用后1 h，自噬抑制劑就增強了SDT對線粒體膜電位的損傷;同時，Caspase抑制劑不能抑制線粒體膜電位變化水平，提示線粒體膜電位的下降有可能發(fā)生在Caspase上游或者不依賴于Caspase的活化。

總之，本研究結(jié)果表明，自噬可能參與了SDT誘導(dǎo)的S180細胞死亡，且自噬特異性抑制劑可以抑制自噬體的形成，從而增強SDT誘導(dǎo)的細胞凋亡。此研究結(jié)果豐富了SDT誘導(dǎo)細胞的死亡模式，并且為如何通過干預(yù)細胞自噬活性增強SDT抗腫瘤療效提供有價值的實驗設(shè)想。

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