信號(hào)響應(yīng)性基因載體及其應(yīng)用研究

王 晶 劉 健 許海燕

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

引言

基因治療(gene therapy)是近年來(lái)被廣泛關(guān)注的一種全新的治療手段。廣義的基因治療，包括了所有在核酸水平上進(jìn)行的治療手段，包括增強(qiáng)或抑制特定基因的表達(dá)，以及導(dǎo)入功能性和外源性基因等。基因治療與常規(guī)治療方法的最重要的區(qū)別在于:一般意義上的疾病治療，是針對(duì)基因異常所導(dǎo)致的各種癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療，而基因治療則針對(duì)的是疾病的根源——異常的基因本身。目前，許多難以通過(guò)常規(guī)手段治療的疾病，如遺傳病(血友病、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血癥等)、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病(艾滋病、類(lèi)風(fēng)濕)等，均有望利用基因技術(shù)進(jìn)行有效的治療。因此，基因治療技術(shù)將為克服這些對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅的疾病提供有力的武器。

與常規(guī)藥物治療同樣，基因治療也需要將適量的核酸藥物遞送到目標(biāo)部位，并使其在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間范圍內(nèi)發(fā)揮作用，這就離不開(kāi)藥物遞送技術(shù)的幫助。而且由于核酸藥物的特殊性，使其對(duì)藥物遞送系統(tǒng)有一些特殊的要求。例如，核酸藥物通常需要到達(dá)細(xì)胞內(nèi)的特定部位才能發(fā)揮作用，對(duì)于siRNA和shRNA等RNA藥物來(lái)說(shuō)，一般只要能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)即可，而對(duì)于質(zhì)粒等需要通過(guò)翻譯表達(dá)才能發(fā)揮作用的核酸藥物，還必須進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部。此外，由于核酸藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有大量的磷酸基團(tuán)，在生理環(huán)境下會(huì)帶負(fù)電荷，因此裸的核酸藥物分子會(huì)由于分子內(nèi)的靜電斥力呈伸展?fàn)顟B(tài)，分子尺寸較大;而且負(fù)電性的核酸藥物也會(huì)與同樣呈現(xiàn)電負(fù)性的細(xì)胞膜相互排斥［1］，這些因素導(dǎo)致了核酸藥物自身很難接近并進(jìn)入細(xì)胞。基于這些原因，設(shè)計(jì)和構(gòu)建能夠搭載核酸藥物進(jìn)入細(xì)胞，并使其能在細(xì)胞內(nèi)可控釋放的載體，是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵。

核酸載體通常可分為病毒載體及非病毒載體兩大類(lèi)。病毒載體雖然具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但是由于其表面抗原容易引起人體免疫反應(yīng)，且病毒的自我復(fù)制能力及潛在的突然變異風(fēng)險(xiǎn)，使病毒載體的安全性受到質(zhì)疑［2］。對(duì)于非病毒載體，低水平的轉(zhuǎn)染效率及特異靶向性的缺乏，是其應(yīng)用于臨床基因治療的主要障礙。非病毒核酸遞送系統(tǒng)要發(fā)揮作用，需要經(jīng)歷逃避免疫系統(tǒng)的清除、通過(guò)細(xì)胞膜屏障、從內(nèi)體中逃逸、進(jìn)入細(xì)胞核、與核酸藥物分離等諸多必要的階段［3］。這種復(fù)雜性是導(dǎo)致非病毒載體效率低下的主要原因，也使得單一功能的載體很難實(shí)現(xiàn)理想的效果。理想的非病毒性載體應(yīng)具有以下特性:1)在血液中穩(wěn)定存在，保護(hù)核酸分子不被細(xì)胞外核酸降解酶破壞，并能抵達(dá)目標(biāo)細(xì)胞;2)能夠準(zhǔn)確靶向目標(biāo)組織或細(xì)胞;3)能促進(jìn)核酸分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部;4)使核酸分子高效地從內(nèi)體中釋放，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì);5)促進(jìn)核酸分子進(jìn)入細(xì)胞核并被表達(dá)(對(duì)于siRNA不需要);6)具有開(kāi)關(guān)作用，保證核酸藥物作用時(shí)間的可控性;7)具備可視化特性，能提供無(wú)損評(píng)估核酸遞送效果的手段。很顯然，傳統(tǒng)載體難以同時(shí)滿足上述要求，而且針對(duì)不同階段的提高轉(zhuǎn)染效率的策略，有時(shí)甚至是相互矛盾的。例如，雖然PEG修飾能延長(zhǎng)載體在血液中的滯留時(shí)間并減少被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，但也導(dǎo)致了新的困境，即不利于載體被細(xì)胞識(shí)別并進(jìn)入細(xì)胞;而另一方面，陽(yáng)離子載體雖然能促進(jìn)載體進(jìn)入細(xì)胞并加速核酸復(fù)合體從內(nèi)體中的釋放，但非特異性的靜電吸附，會(huì)使其在體內(nèi)環(huán)境中難以達(dá)到目標(biāo)部位。因此，需要開(kāi)發(fā)一些具有一定“智能”的新型載體，使其能夠根據(jù)環(huán)境或人工調(diào)控信號(hào)做出響應(yīng)，適時(shí)地發(fā)揮某些特定的作用。這一類(lèi)新型的信號(hào)應(yīng)答型載體，是未來(lái)基因遞送的主要發(fā)展方向之一。

從信號(hào)響應(yīng)性基因載體這一概念的提出，到現(xiàn)在只有短短十幾年的時(shí)間，但是對(duì)其進(jìn)行的研究已經(jīng)有了飛速的發(fā)展。溫度和pH是生物體內(nèi)兩項(xiàng)重要的指標(biāo)，所以最初的研究主要集中在溫度和pH調(diào)控的信號(hào)應(yīng)答性載體［4－5］。隨著載體制備技術(shù)的成熟，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)載體作用機(jī)制研究的深入，人們又陸續(xù)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了能夠應(yīng)答其他信號(hào)的載體，包括超聲、磁場(chǎng)、光照、電場(chǎng)、氧化/還原環(huán)境、酶等。盡管不同信號(hào)應(yīng)答型載體的作用機(jī)理不同，但其目的都是為了幫助核酸藥物突破各類(lèi)生理屏障，提高其靶向性，并使核酸藥物在特定時(shí)間及部位釋放出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)高效、可控的治療效果。

本文對(duì)信號(hào)應(yīng)答的目的及機(jī)理進(jìn)行了歸納，并根據(jù)所應(yīng)答的信號(hào)性質(zhì)，將載體分為外部物理信號(hào)響應(yīng)載體及內(nèi)部化學(xué)生理信號(hào)響應(yīng)載體兩大類(lèi)，著重介紹了各種信號(hào)應(yīng)答型載體的分子結(jié)構(gòu)、應(yīng)答機(jī)制及最新應(yīng)用。同時(shí)，對(duì)近年來(lái)出現(xiàn)的能同步實(shí)現(xiàn)定位、診斷、治療目的的多功能信號(hào)應(yīng)答型載體，也做了詳細(xì)的介紹。

1 單一信號(hào)響應(yīng)性基因載體

1.1 外部物理信號(hào)刺激響應(yīng)

1.1.1 溫度敏感性基因載體

溫度是一項(xiàng)重要的生理指標(biāo)，并且易于進(jìn)行人工干預(yù)，因此能夠比較方便地通過(guò)溫度變化調(diào)控載體的功能，這一類(lèi)載體通常被稱(chēng)為溫敏性基因載體。溫度敏感性基因載體一般由兩部分組成:DNA結(jié)合基團(tuán)和溫度敏感基團(tuán)。其中DNA結(jié)合基團(tuán)通常在結(jié)構(gòu)組成上含有大量胺基，在生理?xiàng)l件下帶正電，能通過(guò)靜電吸引使DNA吸附在載體上;而溫度敏感基團(tuán)則會(huì)對(duì)溫度的變化做出響應(yīng)，從而使載體的性狀發(fā)生改變。聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)是最常用的溫度敏感基團(tuán)，它的低臨界溶解溫度(LCST)在32℃左右［6］，接近正常生理溫度。當(dāng)溫度高于LCST時(shí)，酰胺基和水之間的氫鍵被破壞，酰胺基之間形成分子內(nèi)氫鍵，鏈段中疏水的異丙基開(kāi)始起主導(dǎo)作用，此時(shí)PNIPAm的疏水性較強(qiáng)，高分子鏈段發(fā)生皺縮并緊密包裹DNA，利于其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);而當(dāng)溫度下降到低于LCST時(shí)，酰胺鍵與水分子之間會(huì)形成氫鍵，使水合作用加強(qiáng)，此時(shí)PNIPAm親水性增加，鏈段舒展并與DNA分離，從而達(dá)到DNA釋放的目的(見(jiàn)圖 1)。Kurisawa等［7］制備了 P(NIPAm-8DMAEMA-11BMA)，其中包含了8 mol%DMAEMA和11 mol%BMA，LCST是21℃。實(shí)驗(yàn)證明該載體能夠成功地將pCMV-lacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞中，其在37℃下能夠?qū)NA分子進(jìn)行包覆;而溫度降到20℃后，DNA分子絕大部分會(huì)與載體分離。Li等制備了一系列基于低聚乙二醇(OEG)的樹(shù)枝狀大分子，并研究不同支化程度、不同側(cè)鏈取代基對(duì)其LCST的影響［8］。經(jīng)過(guò)改造后，樹(shù)枝狀大分子的LCST可以從100℃ ～176℃調(diào)節(jié)至 27℃ ～65℃，從而滿足在生物體的應(yīng)用。Oupicky'等制備了小分子量的聚賴(lài)氨酸(PLL)與PNIPAm的接枝共聚物，并研究了其在38℃和20℃下對(duì)DNA分子包覆和釋放情況［9］。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度高于轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，載體與DNA分子所形成的聚電解質(zhì)復(fù)合物的密度會(huì)有一個(gè)明顯的增加，增加的程度隨PNIPAm在載體中所占比例的增大而增加，與PNIPAm的分子量無(wú)關(guān)，而且隨著PNIPAm鏈段的收縮，復(fù)合物表面的電荷量也會(huì)增加。除此之外，也有將聚氧乙烯(PEO)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)等具有溫度敏感型的高分子用于載體的制備，但是其應(yīng)用的廣泛程度遠(yuǎn)不及PNIPAm。溫度敏感型基因載體可以說(shuō)是響應(yīng)性載體的構(gòu)建基礎(chǔ)，對(duì)它的研究一直沒(méi)有停止過(guò)，且綜述也很多，此處不再展開(kāi)。

圖1 溫度敏感性基因載體的響應(yīng)機(jī)制［6］。載體與DNA的復(fù)合物在臨界溫度以上時(shí)會(huì)緊密結(jié)合，低于臨界溫度時(shí)會(huì)變得松散，從而控制DNA釋放Fig.1 The concept of temperature-responsive gene carriers［6］.A complex between the carrier polymer and the DNA is tightly formed above the transition temperature and loose under the transition temperature，then to control DNA release

1.1.2 超聲響應(yīng)性基因載體

超聲微泡在造影劑方面一直有廣泛的應(yīng)用。將其用于基因轉(zhuǎn)染是信號(hào)響應(yīng)性載體的又一發(fā)展方向。具有超聲波響應(yīng)性的微囊，通常由外殼和內(nèi)充氣體兩部分構(gòu)成，在超聲波的作用下，空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng)使內(nèi)部氣體產(chǎn)生“震蕩”或“內(nèi)爆”活性。伴隨發(fā)生的微束、沖擊波、射流等激烈過(guò)程，導(dǎo)致周?chē)M織的細(xì)胞壁和質(zhì)膜被擊穿，產(chǎn)生可逆或不可逆的小孔，從而引起細(xì)胞膜通透性改變。在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中，微泡急劇萎陷產(chǎn)生的強(qiáng)大射流，猶如成千上萬(wàn)的微型注射器，將基因注入細(xì)胞內(nèi)(見(jiàn)圖2)。

圖2 聲孔效應(yīng)在基因遞送中的應(yīng)用［10］。當(dāng)包含pDNA的微囊通過(guò)血管接近腫瘤細(xì)胞，在US作用下微囊破裂釋放pDNA。釋放的pDNA利用聲孔效應(yīng)造成的小孔進(jìn)入細(xì)胞Fig.2 Sonoporation for gene delivery［10］. When plasmid-DNA-(pDNA-)containing MBs are passed through blood vessels adjacent to tumor cells，US waves rupture MB and release pDNA.Released pDNA penetrates into cells through their membranes by sonoporation

Chumakova等制備了PLGA/PEI/質(zhì)粒復(fù)合物納米粒子［11］。PEI的表面帶負(fù)電用于搭載 DNA，PLGA微球內(nèi)部充滿空氣用于超聲響應(yīng)。在超聲波的作用下，微球破碎使DNA釋放進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。研究表明，超聲輻照組載體的轉(zhuǎn)染效率比未輻照組提高了8倍。Vandenbroucke等將siRNA進(jìn)行PEG化以防止其在體內(nèi)被降解，并將PEG化的siRNA絡(luò)合物(PEG-siPlexes)搭載于 C4F10的納米微球上［12］。在超聲作用下氟化物會(huì)氣化爆破，促進(jìn)PEG-siPlexes進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。與不進(jìn)行超聲作用的載體相比較，轉(zhuǎn)染效率顯著提高(見(jiàn)圖3)。Sirsi等在脂膜微囊(lipid-coated microbubbles)上修飾了PEG，PEI分子合成一種新型的超聲響應(yīng)型微囊，在體內(nèi)試驗(yàn)中取得了很好的效果［13］。Nomikou等則研究了中性微囊、陽(yáng)離子化微囊及生物素修飾陽(yáng)離子化微囊，在超聲作用下的體內(nèi)體外基因遞送效率［14］。結(jié)果顯示的遞送效果為:生物素修飾陽(yáng)離子化微囊＞陽(yáng)離子化微囊＞中性微囊。由于超聲波使用方便，在安全性、穿透性等方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，因此，未來(lái)超聲響應(yīng)性基因載體將會(huì)有很大的發(fā)展空間。

圖3 PEG-siPlexes搭載于微囊表面［12］Fig.3 Schematicoverview ofa PEG-siPlex loaded microbubble［12］

1.1.3 磁場(chǎng)控制基因載體

利用磁場(chǎng)對(duì)磁性顆粒的作用力，人們開(kāi)發(fā)了磁性轉(zhuǎn)染(magnetofection)技術(shù)。該技術(shù)將磁性顆粒通過(guò)靜電相互作用或者抗原－抗體結(jié)合等方式，連接于病毒載體或非病毒載體上，通過(guò)磁場(chǎng)的誘導(dǎo)使載體接近細(xì)胞膜，在初期轉(zhuǎn)染時(shí)可以有效提高轉(zhuǎn)染效率［15］。磁場(chǎng)的另一個(gè)重要應(yīng)用是用來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向遞送的作用。Liu等制備了核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4聚多巴胺納米粒子(Fe3O4@PDA NPs)，用于搭載基因和藥物，F(xiàn)e3O4核被厚度約為20 nm的PDA外殼包裹，可在磁場(chǎng)的作用下達(dá)到靶位置并釋放DNA或藥物［16］。由于PDA同時(shí)具有還原劑和偶聯(lián)劑的作用，在其表面還可以沉積Au納米粒子，可以作為一種新型的催化劑載體。此外，通過(guò)磁場(chǎng)達(dá)到控制釋放的目的近年來(lái)也有研究。Giri等設(shè)計(jì)了一種中空的二氧化硅管，在其內(nèi)部可以包封藥物或DNA，兩端用磁性納米顆粒 Fe3O4進(jìn)行封堵［17］。當(dāng)載體進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的還原性條件使酰胺鍵斷裂，在磁場(chǎng)作用下Fe3O4脫落，內(nèi)部搭載的DNA或藥物釋放(見(jiàn)圖4)。由于磁性顆粒生物相容性較好，而且超順磁性氧化鐵顆粒可以作為臨床核磁成像中的造影劑，磁場(chǎng)響應(yīng)性氧化鐵納米顆粒受到了越來(lái)越多的關(guān)注，并有望實(shí)現(xiàn)診療一體化載體的開(kāi)發(fā)。比如Filippousi等利用納米沉淀法制備了以超順磁Fe3O4為核心、mPEG-PPSu-mPEG為殼結(jié)構(gòu)的磁場(chǎng)響應(yīng)性載體，不僅可用于診斷，還可搭載藥物或基因［18］。

1.1.4 光敏感性基因載體

很多化學(xué)反應(yīng)可以被光照引發(fā)或加速，自然界中最重要的光化學(xué)反應(yīng)是植物的光合作用。在半導(dǎo)體技術(shù)中廣泛使用的光刻蝕技術(shù)，也是利用光的能量使特定分子分解。光化學(xué)反應(yīng)還可以用來(lái)生成一些新的活性物質(zhì)，其在醫(yī)學(xué)方面最典型的應(yīng)用就是光動(dòng)力治療(PDT)。光動(dòng)力學(xué)治療首先使光敏劑(具有光敏活性的分子)定位于靶細(xì)胞或目標(biāo)組織中，隨后利用可以激活光敏劑的特定波長(zhǎng)的光對(duì)目標(biāo)部位進(jìn)行照射。此時(shí)光敏劑分子能將光子能量傳遞給周?chē)难醴肿?，進(jìn)而產(chǎn)生各種活性氧(ROS)成分，如單線態(tài)氧、超氧自由基等，這些活性氧成分可以用來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞［19－20］。

圖4 基于二氧化硅包裹超順磁氧化鐵納米粒子的磁響應(yīng)性遞送體系［17］Fig.4 Schematic of the magnetic-responsive delivery system based on mesoporous silica nanorods capped with superpara magneticiron oxide nanoparticles［17］

光化學(xué)反應(yīng)的機(jī)理也可以用來(lái)設(shè)計(jì)合成光刺激響應(yīng)性基因載體。比如利用光照誘發(fā)特定化學(xué)鍵斷裂，或利用光照產(chǎn)生的活性氧破壞內(nèi)體膜，從而促進(jìn)核酸藥物在細(xì)胞內(nèi)的釋放等。Monroe等研究了質(zhì)粒與光敏感基團(tuán)復(fù)合后的表達(dá)狀況［21］。將帶有熒光素酶的質(zhì)粒包裹在重氮乙烷(DMNPE)中，用基因槍法注射到小鼠皮下直徑約1 cm的位置進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在355 nm的光照條件下，可以有效提高轉(zhuǎn)染效率。這是對(duì)設(shè)計(jì)光刺激響應(yīng)性載體的早期探索。Handwerger等合成了生物素化光敏性聚乙烯亞胺(B-PC-PEI)用于DNA的遞送，其中的鄰硝基芐醇基團(tuán)在20 cm(9 mW/cm2)光照強(qiáng)度下以365 nm波長(zhǎng)照射5 min后可以發(fā)生裂解，從而實(shí)現(xiàn)釋放siRNA 的目的［22］。Deng等在 Poly(b-amino ester)s(PBAEs)的基礎(chǔ)上加入光敏基團(tuán)，在UV的照射下能夠顯著提高載體的降解速度(見(jiàn)圖 5)［23］。PBAEs是一種常用的陽(yáng)離子載體，但是其分子量很大且在細(xì)胞內(nèi)降解慢，因而具有很大的細(xì)胞毒性。加入光刺激響應(yīng)的基團(tuán)后，光照條件下載體能迅速降解，有效降低了載體毒性，提高轉(zhuǎn)染效率。該載體在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均取得很好效果。隨后，Yin等也制備了一種結(jié)構(gòu)為PDMNBLG-r-PVBLG－8的載體，用于搭載 DNA［24］。當(dāng)載體從內(nèi)涵體中逃逸后，通過(guò)光照控制DNA的釋放，提高干擾效率。Li等更是在光響應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了熒光分子或其他生物制劑，通過(guò)交互作用制備了可同時(shí)實(shí)現(xiàn)示蹤、控釋、治療目的的基因載體［25］。迄今，利用光照條件遞送藥物的載體比較多見(jiàn)，將其用于基因遞送的研究還相對(duì)較少。

圖5 PBAEs在光照條件下的降解過(guò)程［23］Fig.5 Proposed degradation mechanisms of PBAEs in response to UV irradiation［23］

1.2 內(nèi)部生化學(xué)信號(hào)刺激響應(yīng)

外部物理信號(hào)雖然能很容易的實(shí)現(xiàn)人工干預(yù)，并能很好地實(shí)現(xiàn)針對(duì)特定部位的靶向控釋。但在實(shí)際應(yīng)用中需要有明確的病灶部位，這對(duì)于實(shí)體腫瘤等特定情況下是有效的，但對(duì)于白血病、遺傳性疾病等系統(tǒng)性疾病，則會(huì)面臨無(wú)從下手的窘境。而且，受限于物理信號(hào)的空間分辨率，針對(duì)特定細(xì)胞或特定組織的精確定位，在目前的技術(shù)水平下也難以實(shí)現(xiàn)。因此，利用病變組織、細(xì)胞內(nèi)的特定化學(xué)環(huán)境及特定細(xì)胞因子、代謝產(chǎn)物、信號(hào)通路中間產(chǎn)物等信號(hào)分子的差異性，開(kāi)發(fā)對(duì)生物體內(nèi)部的生化學(xué)信號(hào)做出響應(yīng)的智能載體，就成為一個(gè)重要的策略。

1.2.1 pH敏感性基因載體

特定的pH環(huán)境是生物體維系正常生理功能的必要條件。人體內(nèi)不同組織、器官的pH環(huán)境存在巨大差異，如胃中的pH在1～2左右，而腸道則在8左右。對(duì)于腫瘤組織來(lái)說(shuō)，由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，腫瘤組織內(nèi)部血供不足，導(dǎo)致其內(nèi)部的pH值由正常組織的7.4降至5～6左右。此外，細(xì)胞內(nèi)部不同細(xì)胞器內(nèi)的pH環(huán)境也大不相同，如內(nèi)體中的pH在5.5～6.0，溶酶體中更是接近4.5，其酸性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞外部［26－27］。這些環(huán)境酸性的差異，使pH響應(yīng)性藥物載體的開(kāi)發(fā)成為可能。

目前，對(duì)pH敏感性基因載體的研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，pH敏感的脂質(zhì)、納米微囊、樹(shù)枝狀大分子等都是研究的對(duì)象。Yatvin等首先設(shè)計(jì)制備了第一類(lèi)由卵磷脂和N－棕櫚酰同型半胱氨酸(PHC)組成的pH敏感性脂質(zhì)［28］。自此，帶有如乙烯醚、腙、縮醛和原酸酯官能團(tuán)的脂質(zhì)［29－30］，都引起了研究者的廣泛關(guān)注。與一般藥物載體不同，基因載體的作用場(chǎng)所大多是細(xì)胞內(nèi)部，由于載體復(fù)合物大多是以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞，并與溶酶體融合，因此pH敏感性基因載體，會(huì)更多的利用到細(xì)胞中酸性溶酶體或內(nèi)體與細(xì)胞外部存在的pH差異。Tseng等利用pH響應(yīng)的機(jī)理，在載體與DNA復(fù)合物的外部螯合Zn2+:ntaPEG，從而提高載體的穩(wěn)定性［31］。當(dāng)載體進(jìn)入溶酶體中(pH=4)后，螯合的PEG降解并釋放DNA。pH敏感性的聚合物，通常是利用pH調(diào)節(jié)聚合物的親、疏水性質(zhì)，從而達(dá)到陽(yáng)離子遮蔽的目的，在低pH值下，載體電荷發(fā)生變化，“質(zhì)子海綿效應(yīng)”可以使溶酶體溶脹破裂，促使DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。如何提高載體的敏感度，使DNA更快的從溶酶體中逃逸出來(lái)，成為pH響應(yīng)性基因載體主要的研究方向。而質(zhì)子海綿效應(yīng)理論仍存在諸多矛盾，需要進(jìn)一步的證實(shí)［32］。

除此之外，利用pH敏感的特點(diǎn)調(diào)控載體表面電荷，從而降低載體對(duì)血清等成分的吸附，實(shí)現(xiàn)載體在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)也是一個(gè)熱點(diǎn)研究方向。Murthy等設(shè)計(jì)了一系列以疏水的P(BMA-DMAEMA-styrene)三元共聚物為骨架，表面覆蓋可酸降解的苯甲醛縮乙二醇鍵連接的PEG鏈的“加密”高分子，用來(lái)搭載寡核苷酸［33］。在pH=7.4的生理環(huán)境中，PEG化的載體可以有效減少血清中蛋白的吸附及免疫系統(tǒng)對(duì)載體的識(shí)別;當(dāng)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體后，醇鍵斷裂，卸掉PEG外殼的載體利用質(zhì)子海綿作用逃離溶酶體。Du等更是綜合利用了腫瘤組織及細(xì)胞內(nèi)兩種pH梯度，將陽(yáng)離子載體用于細(xì)胞內(nèi)阿霉素的遞送［34］。當(dāng)載體進(jìn)入腫瘤微環(huán)境時(shí)，pH降低到6.8左右，帶負(fù)電荷的載體外部電荷反為正電荷，有利于細(xì)胞的攝取。進(jìn)入溶酶體后，pH降低至5.0左右，載體崩解并釋放藥物。將該載體用于搭載基因也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

1.2.2 氧化還原敏感性基因載體

氧化還原刺激響應(yīng)性載體的實(shí)現(xiàn)，主要依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)部存在大量的谷胱甘肽。細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的濃度是細(xì)胞外的200倍以上，從而在細(xì)胞內(nèi)外形成了氧化還原電位差。氧化還原敏感性基因載體，通常在化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有對(duì)谷胱甘肽(GSH)還原酶或二硫蘇糖醇(DTT)敏感的二硫鍵(－S-S－)，在還原劑存在下能被還原成巰基，使分子鏈斷裂。由于細(xì)胞外的谷胱甘肽不足以還原二硫鍵，所以只有當(dāng)載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部時(shí)“敏感開(kāi)關(guān)”才會(huì)啟動(dòng)，從而起到在胞內(nèi)定點(diǎn)釋放核酸藥物的作用［35］。Chen等設(shè)計(jì)了一種具有還原響應(yīng)性的聚酰胺－胺型(RHB)超支化大分子，由DMDPTA、HMBA、CBA通過(guò)邁克爾加成共聚得到，其中的二硫鍵在還原條件下會(huì)被破壞［36］。實(shí)驗(yàn)證明，具有氧化還原敏感性的載體有效地提高了基因的轉(zhuǎn)染效率。與此類(lèi)似，Manickam等也通過(guò)制備含有二硫鍵的大分子聚合物或者脂質(zhì)體，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的氧化還原響應(yīng)，從而提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率［37］。Yuan等設(shè)計(jì)制備了一種能夠靶向成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的氧化還原型基因載體［38］。其通過(guò)MPC與Ad-SS-PEG自組裝形成以PEG為包覆層的基因載體。載體進(jìn)入細(xì)胞后接觸氧化還原的環(huán)境二硫鍵被還原，PEG脫離，載體降解從而釋放DNA(見(jiàn)圖6)。

圖6 MPC/Ad-SS-PEG載體的合成路線［38］Fig.6 Synthesis route of MPC/Ad-SS-PEG［38］

1.2.3 其它細(xì)胞內(nèi)特定分子敏感性基因載體

除了以上幾種大多數(shù)細(xì)胞中都存在的響應(yīng)機(jī)制外，近年來(lái)，對(duì)于針對(duì)細(xì)胞內(nèi)其它特定分子如酶、葡萄糖等設(shè)計(jì)的敏感性基因載體也有一些研究。酶敏感的載體，一般通過(guò)利用腫瘤細(xì)胞中某些過(guò)表達(dá)的酶所需要的酯類(lèi)衍生物及短肽序列來(lái)達(dá)到靶向腫瘤細(xì)胞的目的［39－40］。利用這個(gè)原理，通過(guò)氨基甲酸酯將一些小分子胺類(lèi)(亞精胺、精胺等)連接在超支化的聚甘油上，從而制備了酶敏感的基因載體［41］。該載體能夠?qū)iRNA壓縮后在細(xì)胞內(nèi)部釋放，其基因沉默效率十分理想。將酶敏感性用于載體脫去PEG也是一個(gè)新穎的嘗試，在腫瘤細(xì)胞上存在高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)［42］，Hatakeyama等利用這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)了PEG-peptide-DOPE(PPD)載體，在體內(nèi)可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)［43］。當(dāng)達(dá)到腫瘤部位時(shí)，其中的縮氨酸結(jié)構(gòu)被MMP酶解后脫去PEG，在體外的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中效果也十分理想。

2 多重刺激響應(yīng)敏感性載體

隨著對(duì)刺激響應(yīng)性載體研究的深入，單一的刺激響應(yīng)功能已經(jīng)不能滿足需求。在同一載體上實(shí)現(xiàn)多種功能，例如同時(shí)起到靶向定位及診斷治療的目的，是當(dāng)前載體研究的另一大方向。以下介紹幾種可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種功能的復(fù)合型刺激響應(yīng)性載體，其中有些轉(zhuǎn)染效率已被初步研究，但大多數(shù)還處于材料制備合成階段;少數(shù)幾種搭載了藥物或基因，其設(shè)計(jì)理念新穎多樣，應(yīng)用前景廣泛。

邢等采用聲振空化法制備基于表面活性劑的微泡超聲造影劑(ST68)，結(jié)合了超聲和磁感應(yīng)兩種物理響應(yīng)機(jī)制［44］。用多元醇法制備表面帶負(fù)電荷的磁性Fe3O4納米粒子。以微泡為模板，通過(guò)靜電吸引層層自組裝的方法，使聚乙烯亞胺和磁性Fe3O4納米粒子在微泡表面交替沉積，制備磁性微泡。該載體只研究了其在靶向和超聲造影方面的應(yīng)用，若能使微泡囊搭載DNA，通過(guò)磁靶向使載體接近細(xì)胞，在超聲的作用下釋放DNA，也將是一個(gè)很好的設(shè)想。

利用磁場(chǎng)進(jìn)行靶向，再結(jié)合溫度、pH、氧化還原等條件控制DNA釋放，是多功能刺激響應(yīng)性載體典型的設(shè)計(jì)理念。Wang等利用ATRP法成功在磁性納米顆粒表面接枝了溫度敏感基團(tuán)，使載體同時(shí)具有磁控及溫敏特性［45］。研究表明，尺寸控制在100～120 nm的載體，通過(guò)外加磁場(chǎng)和溫度控制在COS-7和HepG-2細(xì)胞中可以有效提高轉(zhuǎn)染效率。Hao等制備了一種以Fe3O4磁性納米粒子為中心的殼球形基因載體［46］。利用了磁場(chǎng)進(jìn)行靶向定位進(jìn)入細(xì)胞，利用氧化還原響應(yīng)控制DNA釋放。其制備方法是通過(guò)膽固醇化的聚甲基丙烯酸N，N－二甲基氨基乙酯(Chol-PDMAEMA30)，把Fe3O4連接在一起并通過(guò)靜電吸附DNA，在其表面用聚甲基丙烯酸單甲氧基聚乙二醇酯 －b－聚甲基丙烯酸(PPEGMA-b-PMAASH)形成球殼，通過(guò)二硫鍵進(jìn)行交聯(lián)固定形狀從而增強(qiáng)DNA包封率。在磁場(chǎng)的作用下載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，二硫鍵氧化還原，使球殼破裂釋放DNA(見(jiàn)圖7)。

圖7 磁場(chǎng)－氧化還原復(fù)合型基因載體［46］Fig.7 Schematic diagram of the magnetic/redox-responsive gene carries［46］

pH與溫敏相結(jié)合也是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。Guo等［47］制備的溫度-pH敏感性?xún)捎H性水凝膠應(yīng)用于藥物載體方面獲得了很好的效果。Alexander等更是對(duì)pH-溫敏性載體在基因遞送方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述［48］。除此之外，還有 pH-光響應(yīng)［49］、pH-氧化還原敏感［50－51］、pH-溫度-氧化還原三重響應(yīng)［52］等結(jié)合各種響應(yīng)機(jī)制的載體設(shè)計(jì)，有的已經(jīng)應(yīng)用于基因遞送并取得了很好的效果，有的還僅限于材料制備階段。

由于磁轉(zhuǎn)染、pH、溫度敏感性載體是刺激響應(yīng)性載體中研究時(shí)間較長(zhǎng)、制備技術(shù)相對(duì)成熟的幾種載體，所以開(kāi)發(fā)復(fù)合型載體大多是建立在這三者的基礎(chǔ)上。隨著對(duì)其他響應(yīng)性機(jī)制研究的深入，多功能刺激響應(yīng)性載體的種類(lèi)會(huì)更加豐富。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，刺激響應(yīng)性基因載體在體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人欣喜，預(yù)期的作用機(jī)制可基本實(shí)現(xiàn)，是提高基因治療的效率、增強(qiáng)基因藥物特異性及靶向性的有效手段。但目前大多數(shù)研究仍停留在細(xì)胞水平，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中依然鮮有成效，其主要原因是體內(nèi)環(huán)境比體外培養(yǎng)體系要復(fù)雜得多。提高信號(hào)響應(yīng)的專(zhuān)一性及靈敏度，同時(shí)維持適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)閾值，以及尋找靶標(biāo)細(xì)胞和組織所特有的內(nèi)源性信號(hào)，將是信號(hào)響應(yīng)性載體走向臨床應(yīng)用所必須面對(duì)的主要挑戰(zhàn)。多信號(hào)協(xié)同調(diào)控以及聯(lián)合分子影像學(xué)技術(shù)的診療一體化技術(shù)應(yīng)該是未來(lái)研究的趨勢(shì)。當(dāng)然，由于主要的刺激響應(yīng)性載體多為通過(guò)各種化學(xué)手段制備而來(lái)的高分子聚合物，設(shè)計(jì)的響應(yīng)機(jī)制越多，制備過(guò)程越復(fù)雜，其實(shí)用性及安全性也就需要進(jìn)行更多的驗(yàn)證。

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