電沉積納米金修飾的16通道電流型PSA免疫傳感器的制備

王澤華 曾冬冬 張 歡 宓現(xiàn)強(qiáng)*

1(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

2(中國科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210)

引言

前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)是由前列腺上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，1971年首次發(fā)現(xiàn)于精液中，而且這種蛋白只在前列腺組織中存在。1979年，Wang等從前列腺組織中提取并純化了這種蛋白質(zhì)［1］。正常情況下，PSA直接分泌到前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)，正常的前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)周圍存在著一種由內(nèi)皮層、基底細(xì)胞層和基底膜構(gòu)成的屏障，可避免前列腺上皮產(chǎn)生的PSA直接進(jìn)入血液之中，從而維持了血液中PSA的低濃度。當(dāng)前列腺發(fā)生癌變時該屏障被破壞，致使PSA直接進(jìn)入血內(nèi)，癌的惡性程度越高，對正常前列腺組織的破壞就越大，血清中PSA濃度也相應(yīng)增高。一般認(rèn)為，血清PSA小于4.0 ng/mL為正常，PSA大于10 ng/mL則患前列腺癌的危險性增加［2］。因此，檢測 PSA已成為診斷前列腺癌的重要手段［3］。

目前，臨床用于PSA檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫吸 附 測 定 法 (ELISA)［4－5］、化 學(xué) 發(fā) 光 免 疫 法(CLIA)［6－7］和熒光免疫分析法(FIA)［8－9］等。這些方法雖各具優(yōu)點，但在快速、靈敏、特異等方面還不理想，探求更好的簡便、高效檢測方法仍是目前的研究熱點和發(fā)展趨勢。電化學(xué)免疫檢測技術(shù)可以將目標(biāo)識別元件中抗原和抗體結(jié)合產(chǎn)生的化學(xué)量轉(zhuǎn)化成與分析物濃度有關(guān)的電信號，并通過電子系統(tǒng)進(jìn)行處理和顯示。電化學(xué)免疫傳感器(electrochemical immunosensor，ECIS)由一個目標(biāo)識別元件和一個信號換能器組成，具有靈敏、快速、簡便、高效等特點，基于電化學(xué)免疫傳感技術(shù)制備的檢測設(shè)備相對來說成本低、能耗少且易于微型化和集成化［10］，被認(rèn)為是很有希望實現(xiàn)簡便、高效檢測PSA的器件。

基于裸碳電極的電化學(xué)免疫傳感方法檢測時間短、樣品消耗少，但存在陰陽性電流響應(yīng)曲線的離散度差、靈敏度低等不足［11］，從而制約了此免疫傳感器的實際應(yīng)用。針對這些缺陷，研究人員將納米技術(shù)與電化學(xué)免疫分析技術(shù)相結(jié)合，相繼開發(fā)了用于PSA檢測的碳納米管修飾的電化學(xué)免疫傳感器、基于三維納米線陣列的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器、基于納米金修飾的聚酰胺胺(Au-PAMAM)復(fù)合材料的電化學(xué)免疫傳感器等［12－14］，但普遍存在制備過程較復(fù)雜、操作繁瑣、納米粒子材料易流失等不足。本研究在裸碳電極基礎(chǔ)上通過將納米金電沉積在16通道絲網(wǎng)印刷碳電極(16-SPCE)表面，制備了一種PSA電流型免疫傳感器。與傳統(tǒng)電化學(xué)免疫傳感器相比，該免疫傳感器的制備時間明顯縮短，特異性和靈敏度明顯提高，且可降低成本，為臨床免疫分析及檢測提供了一種快速、新穎和簡便的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

CHI660電化學(xué)工作站購于上海辰華儀器公司。16通道絲網(wǎng)印刷碳電極由中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所提供。

3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(K-blue 低活性底物，已配有雙氧水)水溶液購于 Neogen公司(Lexington，KY)。牛血清蛋白(BSA)購于Sigma公司。HAuCl4·3H2O(Au% ＞48%)購于國藥集團(tuán)上海試劑有限公司。PSA酶聯(lián)免疫試劑盒(包括一系列0～500 ng/mL不同濃度的PSA抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液和HRP標(biāo)記PSA抗體儲備液)購于Diagnostic Products公司(DPC，美國)。30份前列腺癌患者血清標(biāo)本和3份正常人體血清均由上海市腫瘤醫(yī)院檢驗科提供。其他試劑均為未經(jīng)純化直接使用的分析純。實驗中所用水均為Milli-Q水。

1.2 16-SPCE PSA免疫電極的制備

實驗采用雙抗體夾心法，其檢測原理如圖1所示。將16-SPCE電極條置于優(yōu)選出的0.05 mg/mL HAuC14溶液中，以碳電極作為對電極，AgCl電極作為參比電極，于－200 mV下電沉積，優(yōu)化的沉積時間為150 s。取出電極條，用Milli-Q水徹底沖洗電極表面后，以氮氣(N2)吹干殘留的水珠，得到納米金修飾的16通道絲網(wǎng)印刷電極。將PSA抗體(5.35 mg/mL)用0.01 M磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋100倍，然后取10 μL滴涂于每個修飾后的工作電極表面，置4℃冰箱中孵育16 h后取出，用0.01 M PBS溶液沖洗干凈，并用N2吹干，獲得免疫電極，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)行免疫反應(yīng)時，首先取出孵育好的免疫電極，用0.01 M PBS溶液沖洗干凈，并用N2吹干，取50 μL 1%酪蛋白溶液滴涂于每個電極表面，置37℃冰箱中孵育2 h后取出，洗凈，滴加不同濃度PSA抗原，37℃冰箱中孵育 1 h后，取 5 μL HRP標(biāo)記的PSA二抗(1:200倍稀釋的HRP－anti－PSA)滴涂于修飾后的工作電極表面，37℃冰箱中孵育1 h。最后，將制備好的電極用0.01 M PBS進(jìn)行徹底沖洗用于電化學(xué)測試。

HAuCl4濃度和電沉積時間會對納米金修飾電極的性能產(chǎn)生重要影響，因此對制備電極所用的氯金酸濃度和沉積時間進(jìn)行實驗，以得到電極制備的最優(yōu)條件。

圖1 電沉積納米金修飾16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器檢測PSA示意Fig.1 Schematic diagrams of electrodeposited goldnanoparticles modified 16-SPCE electrochemical immunosensor arrays for PSA.

1.4 檢測方法

采用三電極體系:以免疫電極為工作電極，碳電極為對電極，AgCl電極為參比電極。

以循環(huán)伏安法(CV)和穩(wěn)態(tài)時間電流曲線法(amperometric I-T)進(jìn)行電化學(xué)表征，以檢測所制作電極的靈敏度。時間電流曲線法測量的電位為100 mV，檢測時間為100 s，測試溫度為室溫，此時氧化還原反應(yīng)電流信號已經(jīng)趨于穩(wěn)定。電化學(xué)檢測使用辣根過氧化物酶(HRP)的催化底物 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺水溶液(K-Blue低活性底物TMB，已含有雙氧水)。將該免疫傳感器對 PSA、甲胎蛋白(alpha fetoprotein， AFP)和 癌 胚 抗 原(carcinoembryonic antigen，CEA)同時進(jìn)行檢測，以測試所制作電極的特異性。

選取30個前列腺癌病人血清標(biāo)本，利用納米金修飾后的16－SPCE的電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行檢測，并和標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法進(jìn)行了對照。此外進(jìn)行正常人血清中PSA含量的檢測，分別取3份正常人血清樣品，每份樣品各設(shè)有20個復(fù)孔，然后進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 納米金修飾的16-SPCE PSA免疫傳感器的最優(yōu)制備條件

采用電沉積的方法制備納米金修飾的電極。首先考察氯金酸溶液濃度對電極制備的影響。將16-SPCE 分別置于 0.02、0.05、0.1 mg/mL HAuCl4溶液中，得到的納米金修飾電極置于0.5 M H2SO4溶液中進(jìn)行CV掃描，通過比較納米金修飾前后還原峰電流增大的程度判斷修飾電極的性能。從圖2可以看到隨著HAuCl4溶液溶度的不斷增大，還原峰電流先增大后減小，在HAuCl4濃度為0.05 mg/mL時達(dá)到飽和，峰電流不再增大。因此，可認(rèn)為HAuCl4溶液溶度為0.05 mg/mL為電極制備的最優(yōu)條件。

圖2 HAuCl4濃度的影響Fig.2 The influence of HAuCl4concentration

其次，考察電沉積時間對電極制備的影響，將16-SPCE 分別電沉積 30、100、150、200 s，得到的納米金修飾電極置于0.5 M H2SO4溶液中進(jìn)行CV掃描，通過納米金修飾前后還原峰電流增大的比例來判斷修飾電極的性能，隨著沉積時間的增加，還原峰電流也逐漸增大，150 s時峰電流達(dá)到最大值，之后開始降低，結(jié)果如圖3所示。故選擇電沉積時間150 s為電極制備的最優(yōu)條件。

圖3 電沉積時間的影響Fig.3 The influence of electrodeposition time

然后，將納米金修飾電極與裸碳電極檢測PSA進(jìn)行了電流信號的對比研究，通過滴加濃度為10 ng/mL HRP-anti-PSA于不同修飾電極表面，在3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺水溶液中，于 －0.4 ～0.6 V電位范圍內(nèi)，以0.05 V/s的掃描速度進(jìn)行電極修飾后的電化學(xué)性質(zhì)表征，得到循環(huán)伏安圖(見圖4)考察不同修飾電極的電流信號變化。發(fā)現(xiàn)電沉積納米金后的循環(huán)伏安圖中電流明顯增大，較裸碳電極相比，信號明顯增大。

圖4 不同電極在測試底液中的循環(huán)伏安曲線Fig.4 CV curves for different modified electrodes in the test liquid

最后，探究兩種修飾16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器檢測信號強(qiáng)度的差異，將基于電沉積納米金和裸碳電極修飾16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器制備的免疫電極分別對一系列HRP-anti-PSA的濃度(4～50 ng/mL)進(jìn)行了檢測。發(fā)現(xiàn)基于電沉積納米金修飾16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器檢測到低至10 ng/mL的HRP-anti-PSA時電化學(xué)信號仍然要比背景信號高很多(＞3 SD)，說明這種免疫傳感器的檢測限可以低至10 ng/mL。而裸碳電極的信噪比要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于納米金修飾電極。當(dāng)HRP-anti-PSA的濃度低于10 ng/mL時，信號就很難與背景區(qū)分(＜3 SD)(見圖5)。

圖5 不同電極修飾16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器的性能差異Fig.5 Different electrodes modified 16-SPCE ECISA performance difference

2.2 納米金修飾的16-SPCE免疫傳感器對PSA的檢測性能

2.2.1 檢測PSA的靈敏度

對于基于納米金修飾后16-SPCE的ECIS檢測PSA的靈敏度，采用以下方案進(jìn)行考察:滴加不同濃度 HRP-anti-PSA 的免疫電極在 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺水溶液中，于－0.4～0.6 V電位范圍內(nèi)，以0.05 V/s的掃描速度進(jìn)行測定，得到循環(huán)伏安圖(見圖6)，發(fā)現(xiàn)在200 mV左右的還原峰電流明顯增加，形成了一對非對稱的氧化還原峰。為了獲得更直觀的免疫電極還原峰電流的大小，進(jìn)行I－T檢測，獲得的時間－電流曲線圖(見圖7)，圖7(a)中從上至下依次是濃度為 0、1、2、4、10、50、100 ng/mL PSA抗原的電流響應(yīng)曲線，圖7(b)中從上至下依次是0.1、0.2、0.5 ng/mL低濃度PSA抗原的電流響應(yīng)曲線，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)電流信號隨著濃度的增加呈現(xiàn)單調(diào)增加趨勢。將得到的免疫電極還原峰電流的大小與待測PSA的濃度擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖8)，結(jié)果顯示還原峰電流的增大與PSA抗原溶液濃度在0.2～100 ng/mL范圍內(nèi)呈較好的線形關(guān)系，所以該方法檢測的線性范圍達(dá)0.2～100 ng/mL，其線性回歸方程為 Y=134.558X+72.705，(R=1，P ＜0.000 1)，回歸曲線見圖8中的插入圖。通過分別計算空白樣本的3倍標(biāo)準(zhǔn)差和10倍標(biāo)準(zhǔn)差得到該方法測量的檢測限為0.14 ng/mL。

2.2.2 檢測PSA的特異性

圖6 不同HRP-anti-PSA濃度下的循環(huán)伏安曲線Fig.6 CV curvesfordifferentHRP-anti-PSA concen-trations

圖7 不同濃度PSA的時間－電流曲線。(a)PSA濃度為0、1、2、4、10、50、100 ng/mL 的時間 － 電流曲線;(b)PSA 濃度為0.1、0.2、0.5 ng/mL 的時間 －電流曲線Fig.7 I-T curves for different PSA concentrations.(a)IT curves response of PSA concentration，from top to bottom:0，1，2，4，10，50，100 ng/mL;(b)I-T curves response of PSA concentration，from top to bottom:0.1、0.2、0.5 ng/mL

對于基于納米金修飾后16-SPCE的ECIS檢測PSA的特異性，采用以下方案進(jìn)行考察:將PSA、AFP和CEA都配制成50 ng/mL，分別加入不同的電極孔位進(jìn)行檢測，其結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明由PSA引起的電流相應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AFP和CEA。

圖8 免疫電極電流響應(yīng)與PSA濃度的關(guān)系Fig.8 Immune current response of the electrode's relationship with PSA concentration

圖9 電沉積納米金修飾16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器檢測 PSA、AFP、CEAFig.9 Electrodeposited goldnanoparticles modified 16-SPCE ECISA detection of PSA、AFP、CEA

2.3 納米金修飾的16-SPCE免疫傳感器對實際血清樣品的檢測

圖10為30個前列腺癌患者利用所制作的電極進(jìn)行檢測的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法進(jìn)行相關(guān)分析的結(jié)果?；貧w方程為Y=0.930X+0.773(R=0.944，P ＜0.001，n=30)，表明兩種方法吻合性很好。

圖10 本方法和ELISA法測值之間的相關(guān)性Fig.10 The correlation between our method and ELISA

3份正常人血清樣品的檢測結(jié)果結(jié)果分別為0.42、0.49、0.51 ng/mL，符合正常人血清中 PSA 的含量［15］。

3 討論

PSA是目前臨床上用來診斷前列腺癌重要的腫瘤標(biāo)志物，很多大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)多采用化學(xué)發(fā)光免疫法對PSA進(jìn)行檢測，但該方法需要特殊檢驗設(shè)備，試劑多為進(jìn)口，費用昂貴，在中小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)中很難廣泛應(yīng)用。而簡便的常規(guī)檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附測定法和熒光免疫分析法都存在操作步驟繁瑣、準(zhǔn)確性差，成本高等缺陷。本研究基于16通道絲網(wǎng)印刷碳電極技術(shù)，充分利用納米金的優(yōu)勢，開發(fā)了一種成本低、制作簡便、靈敏度高、檢測時間短的電化學(xué)免疫傳感器。

在電化學(xué)免疫傳感器的制備過程中，如何在電極表面實現(xiàn)抗體固定是一個非常關(guān)鍵的步驟［16－17］，這是因為抗體的固定方式、活性及數(shù)量等直接影響傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度和響應(yīng)時間等性能。目前使抗體固定在電極表面最常見的方法是通過物理吸附作用，這種方法操作簡單，且不會破壞抗體活性，但同時也存在抗體組裝效率不高，容易脫落等缺陷。納米材料具有表面效應(yīng)、量子效應(yīng)等特點，可以有效地擴(kuò)增電極比表面積。在裸碳電極表面修飾納米材料可以提高電極吸附抗原抗體能力，從而有望解決電極表面的抗體組裝問題。通過電沉積法在16通道的絲網(wǎng)印刷碳電極表面修飾一層納米金制備了一種電化學(xué)免疫傳感器。

電極制備時HAuCl4濃度和電沉積時間會對納米金修飾電極的性能產(chǎn)生重要影響。具體來說，HAuCl4濃度和沉積時間會影響電極表面的納米金的還原速率及納米金的尺寸，隨著HAuCl4濃度的增加和電沉積時間的延長，在電極表面沉積的納米金越來越多最終達(dá)到一定的飽和密度。由于納米金的電催化性能，其提高了電極表面的導(dǎo)電性能，因此在硫酸中掃描時，會觀察到還原峰電流隨HAuCl4濃度增加而提高，直至達(dá)到飽和。而HAuCl4濃度過多和沉積時間過長則會影響納米金在電極表面的沉積效率、密度及納米金的平整度，從而影響其催化性能，導(dǎo)致硫酸中掃描的還原峰減小。基于以上原因，對制備電極所用的HAuCl4濃度和沉積時間進(jìn)行了考察，從而得到HAuCl4濃度為0.05 mg/mL和電沉積時間為150 s時是電極制備的最優(yōu)條件。

用最優(yōu)條件下制備的16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器對PSA進(jìn)行了檢測，同時與裸碳修飾16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器檢測PSA進(jìn)行了對比，證明納米金修飾的16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器檢測PSA的電流信號明顯高于裸碳電極，這是因為納米金具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)等納米材料獨有的優(yōu)勢，與裸碳電極相比，納米金修飾電極提高了抗PSA抗體在電極陣列上的組裝效率，最終產(chǎn)生的信噪遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于裸碳電極。通過對不同濃度HRP-anti-PSA的檢測發(fā)現(xiàn)，納米金修飾的16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器可以實現(xiàn)低濃度的檢測，而裸碳電極則無法區(qū)分，證明沉積在電極表面的納米金能有效地促進(jìn)電子傳遞，起到明顯放大電化學(xué)信號的作用。

為了進(jìn)行納米金修飾的16-SPCE免疫傳感器檢測PSA靈敏度的研究，采用循環(huán)伏安法對免疫電極進(jìn)行表征，從而獲得免疫電極表面發(fā)生的氧化還原反應(yīng)信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在200 mV左右的還原峰電流明顯增加，形成了一對非對稱的氧化還原峰，這是因為免疫電極上發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，氧化還原反應(yīng)來自辣根過氧化氫酶(HRP)催化過氧化氫，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺水像電子穿梭機(jī)一樣進(jìn)出HRP酶的氧化還原活性中心，HRP酶不斷催化過氧化氫，使得催化電流迅速增加形成一個明顯增大的電催化峰。這一現(xiàn)象證明了PSA抗原和HRP標(biāo)記的PSA抗體在免疫電極表面發(fā)生了特異性結(jié)合。為了反映HRP酶催化電化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的電流和時間的關(guān)系，采用穩(wěn)態(tài)時間電流法進(jìn)行表征，由于充電電流的影響，開始電流值較大，但是電流很快就達(dá)到平衡狀態(tài)，在100 s左右已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流。將得到的穩(wěn)態(tài)電流信號進(jìn)行擬合分析，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)電流信號隨著濃度的增加呈現(xiàn)單調(diào)增加趨勢，該方法的檢測限根據(jù)大于3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算為0.14 ng/mL，滿足臨床定量檢測PSA靈敏度的要求。

特異性是衡量電化學(xué)免疫傳感器實用性能的重要指標(biāo)之一，本研究將該免疫傳感器對PSA、AFP和CEA同時進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)AFP和CEA檢測信號值極低，和空白樣本相當(dāng)，說明固定在免疫電極表面的酶標(biāo)抗體未能將AFP和CEA捕獲，因此并未引起較大的電流變化，而PSA檢測的信號值卻很高，與AFP、CEA和空白樣本能進(jìn)行明顯區(qū)別，說明固定在免疫電極表面的酶標(biāo)抗體成功捕獲PSA。由此證明該電化學(xué)免疫傳感器具有較好的選擇性，可以實現(xiàn)PSA的特異性檢測。通常前列腺癌患者PSA在4～10 ng/mL被認(rèn)定為診斷灰區(qū)［18］，所提出的檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以彌補(bǔ)灰區(qū)可能帶來的誤診。

對前列腺癌病人血清樣本進(jìn)行檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用納米金修飾后的16-SPCE的電化學(xué)免疫檢測方法與ELISA法定量結(jié)果相關(guān)性好 (R=0.944，P＜0.001)，說明所開發(fā)的ECISA可以對PSA定量檢測。進(jìn)一步采用ECISA對正常人血清樣本中PSA含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其含量符合正常人血清中PSA的含量范圍。與ELISA相比，ECISA具有操作簡單、制備成本低、反應(yīng)時間短等顯著優(yōu)點。

綜上所述，基于電沉積納米金修飾的16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器具有較好的靈敏度，同時，該電化學(xué)免疫傳感器既可以對單一樣品同時進(jìn)行大批量的重復(fù)測試，或同時平行測定混合組分，也可以同時進(jìn)行多組不同樣品的測量，加之具有成本低的優(yōu)勢，非常適合我國廣大欠發(fā)達(dá)地區(qū)及中小型醫(yī)療機(jī)構(gòu)的需求。

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