體外肝細(xì)胞培養(yǎng)及在藥物篩選中的應(yīng)用

羅南書 羅南英

1(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首 416000)

2(重慶市九龍坡區(qū)第三人民醫(yī)院，重慶 400080)

引言

肝臟是人體內(nèi)最復(fù)雜的器官之一，負(fù)責(zé)執(zhí)行多種功能，解毒是其中非常重要的一種功能。外源性藥物經(jīng)過肝臟代謝后，多數(shù)藥物對(duì)人體的毒性被消除，但也有部分無毒或低毒的物質(zhì)經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后成為有毒或毒性更高的物質(zhì)。作為這個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程的發(fā)生器官，肝臟必然成為研究藥物毒性的重要靶器官。利用傳統(tǒng)的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥物毒性研究，耗費(fèi)大量人力財(cái)力，且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，種屬差異大。而體外培養(yǎng)細(xì)胞周期短，操作方便，并能避免應(yīng)用動(dòng)物模型所出現(xiàn)的種屬、個(gè)體差異及體內(nèi)各種復(fù)雜因素的干擾，更適于高通量藥物篩選。近年來，體外培養(yǎng)肝細(xì)胞已開始用于藥物篩選［1－2］。

隨著對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞－基質(zhì)相互作用理解的增強(qiáng)，肝細(xì)胞體外培養(yǎng)模型經(jīng)歷了從傳統(tǒng)的二維(2D)模式如單層貼壁細(xì)胞培養(yǎng)向更先進(jìn)的生物模擬的三維(3D)模式的轉(zhuǎn)變［3］(見圖1)。文中就體外肝細(xì)胞培養(yǎng)模型及其在藥物篩選中的應(yīng)用作簡(jiǎn)要綜述。

1 種子細(xì)胞來源

體外肝細(xì)胞培養(yǎng)所用的細(xì)胞主要有原代肝細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞和干細(xì)胞。由于原代肝細(xì)胞具有肝臟的所有特異性功能，能更好地模擬體內(nèi)肝臟的生理環(huán)境，可用于酶誘導(dǎo)和抑制研究、藥物中通量篩選，是檢測(cè)種間和個(gè)體間代謝差異的理想模型［8］。但原代肝細(xì)胞在每次實(shí)驗(yàn)之前均需通過復(fù)雜的步驟從肝組織中分離出來［9］，對(duì)培養(yǎng)條件要求較為苛刻，且細(xì)胞活力、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)及肝功能隨時(shí)間而發(fā)生改變，最終去分化而喪失肝功能［10］，故而限制了其在體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。常用的永生化肝細(xì)胞有 Fa2N-4、HepG2、Hep3B、Plc/PRFs、Huh7、HBG 和 HepaRG［11－12］。雖然永生化肝細(xì)胞系比原代細(xì)胞操作簡(jiǎn)單方便，可無限增殖，且表現(xiàn)出不同程度的肝特異性功能，但它們都不能表現(xiàn)肝臟執(zhí)行的全部功能，并帶有致瘤的風(fēng)險(xiǎn)［13］，因而其應(yīng)用也有限。目前干細(xì)胞被認(rèn)為是肝細(xì)胞的一種更可靠和豐富的來源。胚胎干細(xì)胞由于涉及道德倫理問題而不能大規(guī)模獲得和應(yīng)用，而由Takahashi等引入的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)則因無道德倫理限制而具有廣闊的應(yīng)用前景［14］。但由干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的條件還需進(jìn)一步優(yōu)化，以縮短分化時(shí)間，獲得功能穩(wěn)定的肝細(xì)胞。

2 二維培養(yǎng)模式

圖1 體外肝細(xì)胞培養(yǎng)的不同方法。(a)三維多孔支架［4］;(b)肝細(xì)胞球狀聚集體的形成［5］;(c)肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的微圖式化共培養(yǎng)［6］;(d)用于肝組織移植的脫細(xì)胞基質(zhì);(e)3D多孔微流控生物反應(yīng)器［7］;(f)無支架細(xì)胞片層技術(shù)Fig.1 Different methods for hepatocyte culture in vitro.(a)3D porous scaffolds［4］;(b)Spheroid formation for hepatocyte culture［5］; (c)Micropatterned co-culture of hepatocytes and fibroblasts［6］;(d)Decellularized matrices for liver tissuegrafts;(e)3D multiwellmicrofluidic perfusion bioreactor［7］;(f)Cell sheet technology to obtain scaffold-free multilayers

體外肝細(xì)胞培養(yǎng)的最簡(jiǎn)單方法是懸浮培養(yǎng)或單層培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞缺乏細(xì)胞－基質(zhì)接觸，而靜態(tài)單層培養(yǎng)細(xì)胞則生長(zhǎng)于彈性膜或用ECM蛋白包被的平面上，I型膠原是常用的包被物。在微量ECM組分包被基底或作為培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的條件下，細(xì)胞的功能會(huì)增強(qiáng)，而表型無變化［15］。將肝細(xì)胞在基質(zhì)膠上進(jìn)行單層培養(yǎng)時(shí)，在48 h內(nèi)可形成球狀聚集體并能維持其大部分肝臟特有功能，但隨時(shí)間增加某些功能喪失［16］。在肝生物基質(zhì)(從整個(gè)肝臟制備的ECM純化提取物)上培養(yǎng)的肝細(xì)胞與用基質(zhì)膠培養(yǎng)的肝細(xì)胞同樣可增強(qiáng)其肝特異性功能［17］。Flaim等對(duì)ECM的32種蛋白成分進(jìn)行了高通量微圖式組合篩選，發(fā)現(xiàn)I型和IV型膠原蛋白與纖連蛋白和層粘連蛋白結(jié)合對(duì)肝細(xì)胞白蛋白的分泌有促進(jìn)作用［18］。另外，I型膠原和纖連蛋白的共存可促進(jìn)細(xì)胞分化為肝細(xì)胞系。然而這些方法均有一個(gè)主要缺陷，即肝細(xì)胞在二維體外培養(yǎng)平臺(tái)上培養(yǎng)時(shí)，短期內(nèi)(小于72 h)即喪失其活力和功能，氧化作用差，因而不能用于長(zhǎng)期的藥物毒性研究。

為了在肝細(xì)胞兩側(cè)提供類似肝臟中的ECM環(huán)境，Nahmias等建立了一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的夾層結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中ECM蛋白的疊加為肝細(xì)胞提供了黏著斑定位的黏附配體并維持其類似體內(nèi)的細(xì)胞極性(見圖2)［19］。Dunn等觀察到肝細(xì)胞的夾層培養(yǎng)可維持肝細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)期(大于6周)的肝特異性功能如白蛋白、尿素和膽汁酸的分泌，而單層培養(yǎng)僅能維持1－2周［20］?，F(xiàn)已證明覆于細(xì)胞上層的硫酸肝素蛋白聚糖可促進(jìn)細(xì)胞間隙連接的形成和基底表面標(biāo)志物的表達(dá)，但覆蓋層的具體成分對(duì)肝細(xì)胞功能沒有任何促進(jìn)作用。夾層結(jié)構(gòu)培養(yǎng)阻止了肝細(xì)胞僅附著于單層一側(cè)而導(dǎo)致的應(yīng)力纖維形成，但培養(yǎng)一段時(shí)間后，肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生I期或II期解毒過程的不平衡及旁分泌信號(hào)或其他信號(hào)分子擴(kuò)散的紊亂［21］。田青華等制備了不同尺寸的微柱陣列結(jié)構(gòu)用以培養(yǎng)單層肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)陣列結(jié)構(gòu)促進(jìn)肝細(xì)胞功能，但僅研究了短期效應(yīng)［22］。

3 三維培養(yǎng)模型

3.1 球狀聚集體培養(yǎng)

培養(yǎng)肝細(xì)胞球狀聚集體主要有兩種方法，一是將肝細(xì)胞在聚合物包被的表面上培養(yǎng)，通過肝細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用使球狀聚集體自發(fā)形成。這類包被物包括天然ECM成分、蛋白聚糖、膠原蛋白連接的熱反應(yīng)聚合物、帶負(fù)電荷的聚合物如丙烯酸樹脂、半乳糖支架和聚乳酸(PLLA)等。二是利用物理手段來增加細(xì)胞－細(xì)胞之間的相互作用以誘導(dǎo)細(xì)胞聚集，常用的方法有懸液滴法、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或攪拌、振蕩、施加外力如使用超聲等，其中振蕩培養(yǎng)比旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)具有更快和更高的肝細(xì)胞球狀聚集體形成率［23］。

圖2 肝細(xì)胞形態(tài)和肌動(dòng)蛋白纖維的分布［19］。(a)單一膠原凝膠培養(yǎng);(b)膠原夾層培養(yǎng)Fig.2 Morphology and localization of actin fibers in hepatocyte cultures on a single collagen gel(a)and in a collagen sandwich(b)［19］

盡管培養(yǎng)的球狀聚集體可以維持良好的細(xì)胞活力和肝細(xì)胞表型，但由于球狀聚集體形成的滯后期(從幾小時(shí)到幾天)以及球體尺寸的難以控制，大規(guī)模地應(yīng)用球狀聚集體仍不可行。小尺寸的球狀聚集體由于細(xì)胞之間的相互作用較弱而不一定能提供所需組織水平的生理特性，而太大的球狀聚集體則由于膽汁積聚和缺乏足夠的氧氣易在球體中心形成缺氧或壞死的細(xì)胞。有研究表明尺寸為100 μm的球狀聚集體具有較高的白蛋白分泌率，而尺寸為200 μm的球狀聚集體受營(yíng)養(yǎng)限制而有壞死的核心區(qū)域［24］。目前已有多種方法應(yīng)用于誘導(dǎo)具有控制尺寸球狀聚集體的快速形成，如控制支架的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、結(jié)合細(xì)胞粘附配體以維持球狀聚集體與基質(zhì)的黏附、微流控裝置(MD)以及微圖式等［25－26］。

由多種類型細(xì)胞如實(shí)質(zhì)細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(NPC)或與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)形成的球狀聚集體［27］，其細(xì)胞功能或存活力增強(qiáng)，已被用于檢測(cè)細(xì)胞－細(xì)胞之間的相互作用。在大鼠肝細(xì)胞與星狀細(xì)胞的三維共培養(yǎng)中，100～150 μm的球狀聚集體形成了肝超微結(jié)構(gòu)如膽管、橋粒和緊密連接，增強(qiáng)了CYP3A和CYP2B的活性以及 ECM的合成［28］。Kostadinova等在24孔板內(nèi)利用可拆卸小室共培養(yǎng)肝臟所有類型細(xì)胞，可維持肝臟功能長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，并可用于藥物毒性檢測(cè)［29］。然而，由于不同細(xì)胞類型的粘附性差異而難以控制異質(zhì)球狀聚集體的形成。為了解決這個(gè)問題，Kojima等在不同類型細(xì)胞表面引入抗生物素蛋白或生物素，利用抗生物素蛋白－生物素結(jié)合的機(jī)制，使細(xì)胞自組織形成異質(zhì)球狀聚集體(見圖 3)［30］。

圖3 不同類型細(xì)胞通過抗生物素蛋白-生物素結(jié)合機(jī)制形成異質(zhì)球狀聚集體示意圖［30］。(a)一分子抗生物素蛋白結(jié)合四分子生物素;(b)抗生物素蛋白標(biāo)記的MS1細(xì)胞輕易與生物素標(biāo)記的HepG2細(xì)胞結(jié)合形成聚集體Fig.3 Schematic model of AB-dependent aggregation using different type cells［30］.(a)An avidin molecule can bind to four biotin molecules;(b)An Avi-MS1 cell easily binds to Bio-HepG2 cells

3.2 細(xì)胞片層技術(shù)

一種刺激響應(yīng)性聚合物包被的表面已被用于獲得不含任何人造支架材料的細(xì)胞片層［31］。該方法是將細(xì)胞在結(jié)合了一種溫度響應(yīng)性聚合物如聚N－異丙基丙烯酰胺凝膠的表面上培養(yǎng)。聚N－異丙基丙烯酰胺凝膠具有較低的溶解溫度(32℃)，高于此溫度時(shí)該聚合物是疏水性的且不溶于水。37℃時(shí)細(xì)胞在此疏水性表面易于黏附，而在20℃ ～25℃時(shí)由于結(jié)合的聚合物構(gòu)象改變而發(fā)生分離。由于無需酶處理而發(fā)生細(xì)胞剝離，細(xì)胞片層技術(shù)(CST)為保持細(xì)胞－細(xì)胞之間的相互作用提供了有效的方法。利用這種方法可獲得二維和三維的肝細(xì)胞片層以及由肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共同構(gòu)成的細(xì)胞片層［32］(見圖4)。影響細(xì)胞的剝離或黏附的因素有連接聚合物鏈的密度、連接聚合物的方法、聚合物鏈的構(gòu)象以及構(gòu)象變化的速率［33］。細(xì)胞接種的順序也很重要，只有在接種內(nèi)皮細(xì)胞之前先接種肝細(xì)胞才能獲得控制異型相互作用的合適的細(xì)胞片層［34］。在小鼠體內(nèi)植入二維肝細(xì)胞片層會(huì)形成二維肝組織，并維持功能達(dá)200 d，而通過在體內(nèi)結(jié)合多個(gè)細(xì)胞片層則可獲得三維分層肝組織［31］。此外，通過在單層肝細(xì)胞上覆蓋一層內(nèi)皮細(xì)胞片層可獲得混合分層細(xì)胞片層。這種混合結(jié)構(gòu)中由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ECM由于上調(diào)了整合素α和蛋白聚糖的表達(dá)而迅速改變［35］?？傮w而言，細(xì)胞分層技術(shù)強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞－細(xì)胞之間相互作用和基質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在增強(qiáng)肝細(xì)胞功能中的重要性。這些有助于制造作為肝片移植的可植入支架材料以用于微創(chuàng)手術(shù);且可以縮小到原始大小的六分之一而不影響細(xì)胞的功能。

圖4 內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞分層培養(yǎng)過程示意圖［32］Fig.4 Schematic illustration of the procedure to stratify bovine endothelial cells to the hepatocyte sheet［32］

3.3 脫細(xì)胞基質(zhì)

肝組織工程的一種方法是對(duì)廢棄供肝進(jìn)行脫細(xì)胞化和再細(xì)胞化。脫細(xì)胞處理包括去除所有細(xì)胞或核物質(zhì)，同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械完整性和組成［36］(見圖5)。脫細(xì)胞基質(zhì)表現(xiàn)出理想的基質(zhì)特性，如ECM樣的化學(xué)組成，清晰的孔隙結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞培養(yǎng)中存在的流動(dòng)通道。利用豬肝臟生物基質(zhì)可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞達(dá)45 d，表明這樣的基質(zhì)可能延長(zhǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間［37］?，F(xiàn)已可從不同物種獲得脫肝臟細(xì)胞基質(zhì)。肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的再細(xì)胞化使它們?cè)谄湓镜奈恢弥匦露ㄎ唬磉_(dá)內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和膽管的典型標(biāo)志物，從而在體外形成肝樣組織［38］。

圖5 肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)前(a)后(b)外觀圖［36］Fig.5 Gross view of a liver before(a)and after(b)decellularization［36］

從利用脫全肝臟細(xì)胞基質(zhì)和200萬(wàn)成年大鼠肝細(xì)胞建立可移植的再細(xì)胞化肝移植體的第一份報(bào)告開始［39］，該領(lǐng)域已發(fā)展至利用人類肝細(xì)胞與豬肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)結(jié)合來建立重組肝移植體［40］。用脫細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)永生化人胎肝細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞可以在植入小鼠體內(nèi)后維持兩種細(xì)胞達(dá)6周以上［41］。

盡管有上述進(jìn)展，但移植再細(xì)胞化移植體僅能存活2～8 h，其主要原因是當(dāng)血液一旦接觸到暴露的膠原蛋白(理想狀態(tài)下被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋)時(shí)即發(fā)生凝血反應(yīng)。近期的一項(xiàng)研究報(bào)告在細(xì)胞化之前先用肝素包被脫細(xì)胞基質(zhì)，這種支架在移植后可以存活4 d［42］。但使內(nèi)皮化均一的方法和條件的優(yōu)化還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 藥物篩選的體外肝臟模型

利用一種理想的體外模型在藥物研發(fā)早期進(jìn)行肝毒性篩選可以節(jié)約成本，也減少了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的需要。與體內(nèi)模型不同，這種體外模型由于可精確控制其實(shí)驗(yàn)條件而有利于進(jìn)行系統(tǒng)研究，從而加速對(duì)藥物性肝損傷機(jī)制的理解。

用于藥物毒性研究的模型包括原代肝細(xì)胞的單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)、肝片、夾層培養(yǎng)和永生化細(xì)胞系，然而，由于它們?cè)诙唐趦?nèi)(24～72 h)即失去肝特異性功能或表型、CYP酶的表達(dá)，因而僅適用于短期的二維培養(yǎng)。為防止肝細(xì)胞的去分化，模擬異質(zhì)環(huán)境，并進(jìn)行與體內(nèi)模型相關(guān)的檢測(cè)評(píng)估研究，學(xué)者們正努力研發(fā)新型的器官模型。理想的器官模型需具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè):三維的細(xì)胞微環(huán)境、不同類型肝細(xì)胞的共培養(yǎng)、可供氧的流動(dòng)液體、類似體內(nèi)的化學(xué)梯度、高通量、僅需接種少量細(xì)胞。Kostadinova等建立了一種長(zhǎng)時(shí)間的三維肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系，比單層培養(yǎng)肝細(xì)胞能更好地檢測(cè)體內(nèi)藥物導(dǎo)致的毒性［29］。

在凝膠材料如基底膜、膠原蛋白、海藻酸上培養(yǎng)的肝細(xì)胞，已被廣泛用于藥物毒性測(cè)試和篩選。劉勁松等以HepG2細(xì)胞作為模型細(xì)胞，以殼聚糖/膠原混合材料制備水凝膠支架，體外構(gòu)建肝(腫瘤)細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系，研究三維肝腫瘤模型對(duì)臨床常用的化療藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)水凝膠支架中形成的三維肝細(xì)胞骨架更接近體內(nèi)肝組織，對(duì)化療藥物的敏感性降低，可用于體外篩藥研究［43］。Lan等利用一種新型的三維凝膠共培養(yǎng)HepG2和乳腺癌細(xì)胞，并進(jìn)行了藥物毒性篩選的研究［44］。

雖然利用凝膠材料培養(yǎng)肝細(xì)胞已廣泛應(yīng)用，但很難標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。另外，由于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到聚集體中心仍是有待解決的問題，因而很難大規(guī)模生產(chǎn)。微流控反應(yīng)器特別適合肝臟模型的研發(fā)，尤其是用于藥物毒性試驗(yàn)的肝臟模型。微流控反應(yīng)器可提供較大的表面積與體積比，類似體內(nèi)的流體特性，以及對(duì)時(shí)間和空間要素的良好控制，這有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞－細(xì)胞或細(xì)胞－基質(zhì)間的相互作用和氧氣或化學(xué)梯度。許多研究者都利用基于濃度梯度的微流控反應(yīng)器進(jìn)行藥物篩選研究。Ye等構(gòu)建了一套集成化微流控芯片系統(tǒng)，利用微尺度芯片通道內(nèi)的層流混合和分流特征，將細(xì)胞培養(yǎng)、濃度梯度加樣、不同小分子－細(xì)胞相互作用等集于一體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)阿霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(HepG2)凋亡過程的監(jiān)測(cè)［45］。鄭允煥等利用SU－8負(fù)性光刻膠模具和PDMS制作出雙層結(jié)構(gòu)的微流控細(xì)胞陣列芯片，共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞、肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞3種不同細(xì)胞，監(jiān)測(cè)了不同濃度伊立替康誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的毒性作用［46］。

基于灌注的微裝置已被用于培養(yǎng)單層細(xì)胞、球狀聚集體或三維聚集體。在這些裝置中培養(yǎng)的肝細(xì)胞形成了膽管和縫隙連接［47］。一般的灌注培養(yǎng)可提高和維持肝細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間的活力和功能，并上調(diào)解毒基因的表達(dá)。三維多室毛細(xì)血管膜灌注生物反應(yīng)器可長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞功能，并已證明比二維系統(tǒng)能更有效促進(jìn)肝細(xì)胞譜系的分化［48－49］。這些系統(tǒng)在適當(dāng)?shù)募羟袘?yīng)力和流體流速下可表達(dá)各種解毒基因，從而使之成為一個(gè)功能強(qiáng)大的研究藥物毒性和細(xì)胞交叉作用的工具［50－51］。

為減少細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力，學(xué)者們不斷修正平板生物反應(yīng)器的幾何形狀(包括微加工溝脊)，具有類似于體內(nèi)肝臟流體梯度的生物反應(yīng)器已被改造用于藥物毒性分析的模塊［52－53］。在聚對(duì)苯二甲酸乙二酯包被的膠原蛋白圓形平板上夾層培養(yǎng)肝細(xì)胞可維持不同解毒酶的表達(dá)。這樣的系統(tǒng)可用于藥物篩選平臺(tái)和生物人工肝的研發(fā)［54］。

以上模型均可維持和增強(qiáng)肝細(xì)胞活力和功能，但在將這些模型用于工廠生產(chǎn)廣泛應(yīng)用之前，需要對(duì)其進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)的交叉驗(yàn)證，優(yōu)化維持細(xì)胞表型、基本功能如白蛋白分泌、ATP和谷胱甘肽的濃度、信號(hào)通路的維持和外源性代謝(階段1和2)的參數(shù)水平。此外，對(duì)模型中的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞全表型的比較以及對(duì)培養(yǎng)條件如基質(zhì)和培養(yǎng)基組成的標(biāo)準(zhǔn)化，仍需要進(jìn)一步研究［55］。

5 展望

體外肝細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)歷了從經(jīng)典單層細(xì)胞培養(yǎng)模式到技術(shù)更先進(jìn)的肝臟器官模型的轉(zhuǎn)變，可更精確地從時(shí)間和空間控制細(xì)胞－細(xì)胞和細(xì)胞－基質(zhì)間相互作用?，F(xiàn)已建立了許多體外肝臟模型，有望作為藥物毒性篩選和治療的平臺(tái)。然而，在將其用于臨床實(shí)際應(yīng)用之前，還需要進(jìn)一步的完善和優(yōu)化。目前限制細(xì)胞模型應(yīng)用的一個(gè)主要因素是模型中缺乏類似于體內(nèi)肝臟的單獨(dú)膽汁區(qū)域。在大多數(shù)模型中，膽汁被分泌到培養(yǎng)基中，并可能對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生有害影響。微流控裝置(MD)可能有助于解決此問題。這種模型可進(jìn)一步提升對(duì)膽汁相關(guān)疾病的理解，并對(duì)藥物發(fā)展領(lǐng)域產(chǎn)生巨大影響。隨著技術(shù)的進(jìn)步，有望建立類似于體內(nèi)肝臟的模型，以利于創(chuàng)建小型實(shí)驗(yàn)體系如芯片實(shí)驗(yàn)室，加快細(xì)胞對(duì)各種刺激響應(yīng)的詳細(xì)研究，以解決藥物篩選和臨床治療的難題。

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