四君子湯和理中湯干預腹瀉型IBS 大鼠胃腸轉運功能和P 物質、膽囊收縮素的比較研究

段永強， 程衛(wèi)東， 成映霞， 杜 娟， 鞏子漢， 朱立鳴， 楊曉軼， 梁玉杰

(1. 甘肅中醫(yī)學院，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室，甘肅 蘭州730020;2. 蘭州大學基礎醫(yī)學院中西醫(yī)結合研究所，甘肅 蘭州730020;3. 南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東 廣州510515)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是由于腸道動力學和內臟感覺異常所導致的胃腸道功能性疾病，以持續(xù)存在或間歇發(fā)作的排便習慣改變、糞便性狀異常(稀便、黏液便)、腹脹及腹痛等為表現(xiàn)的臨床綜合征。流行病學研究表明我國IBS 患病人群以腹瀉型為多發(fā)，由于IBS 缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學改變和生化異常［1］，故目前認為腹瀉型腸易激綜合征 (Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)與精神因素、胃腸激素分泌紊亂、炎癥介質及免疫因子促發(fā)等因素有關［2］，現(xiàn)代醫(yī)學對此病尚無完全有效的治療方案。中醫(yī)學認為D-IBS 與脾虛證或脾虛為主證的臟腑病證密切相關［3-4］。臨床多應用以益氣健脾止瀉或溫中健脾止瀉類中藥復方為主進行干預，療效顯著。故本實驗以D-IBS 大鼠為研究對象，比較經方四君子湯和理中湯對D-IBS 大鼠胃腸轉運功能、血清及小腸組織P 物質(SP)、膽囊收縮素(CCK)表達差異的影響。

1 實驗材料

1.1 動物 采用SPF 級Wistar 大鼠，雌雄各半，3 月齡，體質量(180 ±20)g，由甘肅中醫(yī)學院醫(yī)學實驗中心提供(動物合格證號SCXK ［甘］2011-0001-0001011;實驗設施合格證SYXK ［甘］2011-0001-0000315)。

1.2 藥物

1.2.1 四君子湯 人參(Ginseng Radix et Rhizoma)、白術(Atractylodis macrocephalae Rhizoma)、茯苓(Poria)、甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)原藥材按3 ∶3 ∶3 ∶2 比例配制并加工，第1 次加10 倍量蒸餾水浸泡4 h，按常法煎煮2 次，每次40 min，濾出藥液置70 ～80 ℃水浴濃縮至質量濃度為2 g/mL 藥劑，冷卻后置4 ℃冰箱備用，使用時稀釋至所需質量濃度。

1.2.2 理中湯 人參(Ginseng Radix et Rhizoma)、白術(Atractylodis macrocephalae Rhizoma)、干姜(Zingiberis Rhizoma)、甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)按1 ∶1 ∶1 ∶1比例配制并加工，第1 次加10 倍量蒸餾水浸泡4 h，按常法煎煮2 次，每次40 min，濾出藥液置70 ～80 ℃水浴濃縮至每1 mL 藥液含生藥2 g，冷卻后置4 ℃冰箱備用，使用時稀釋至所需質量濃度。

1.2.3 番瀉葉(Sennae Folium)制劑 將番瀉葉粉碎成粉，用蒸餾水浸泡，置于50 ℃水浴6 h 濃縮至質量濃度為1 g/mL藥劑，去渣取汁4 ℃保存，使用時稀釋至所需質量濃度。以上中藥均購自蘭州復興厚中藥材有限責任公司，并經甘肅中醫(yī)學院藥學系中藥生藥學教研室楊扶德教授鑒定合格。

1.3 主要試劑和儀器 P 物質(Substance P，SP)、膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)放免試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號20111008;20111011)。GC-911r 放射免疫計數器，KDC-2044 低速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，安徽省合肥市)。

2 實驗方法

2.1 造模和分組 大鼠適應性飼養(yǎng)6 d 后，受試動物按體質量編號，用隨機數字表法［5］分為空白對照組(n =10)和造模組(n=60)。除空白對照組外，造模組大鼠參照文獻［6］ 造模:以番瀉葉煎劑溶液 (0.4 g/mL)按10 mL/kg容量灌胃，每日1 次;在灌服完番瀉葉煎劑1 h 后，即用粗制棉繩束縛大鼠的兩后肢，使之行動不便，躁動不安，造成一定應激刺激，持續(xù)2 h，每日1 次，以上兩法復合連續(xù)造模時間持續(xù)14 d。造模結束后篩選符合D-IBS 模型大鼠，并采用隨機法分為D-IBS 模型組、四君子湯中藥組、理中湯中藥組，每組10 只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。

2.2 灌胃給藥與飼養(yǎng) 造模14 d 結束后，四君子湯組給予20 g/(kg·d)四君子湯藥劑灌胃，理中湯組給予20 g/(kg·d)理中湯藥劑灌胃，等效劑量按照實驗動物研究“等效劑量”計算方法(按60 kg 成人體表面積換算標準劑量2 倍量)折算，灌胃容積為10 mL/kg 體質量，連續(xù)灌胃給藥14 d，空白對照組、IBS 模型組給予同體積蒸餾水灌胃;各組均以蒸餾水、標準飼料喂養(yǎng)。

2.3 胃排空試驗 參照文獻［7］從第14 天晚上8 時開始禁食、不禁水至第16 天早晨8 時，共禁食36 h。給半固體營養(yǎng)糊2 mL，30 min 后用10%水合氯醛麻醉后股動脈采血，制備待檢標本。隨后迅速打開腹腔，結扎幽門和賁門后取出胃，清除胃表面的血漬，第1 次稱定質量(胃總質量)，后剪開胃體，洗去胃內容物，用濾紙吸干水分第2 次稱定質量(胃凈質量)，按公式計算:胃殘留率= (胃總質量-胃凈質量)/2 ×100%。

2.4 小腸推進試驗 參照文獻［8］ 結扎幽門和回盲部，分離腸系膜，測量幽門至回盲部的長度作為小腸總長度，從幽門至營養(yǎng)糊黑染的距離作為小腸推進長度。按公式計算:小腸推進率= 營養(yǎng)糊推進距離 (cm)/小腸全長(cm) ×100%。

2.5 標本采集與指標檢測

2.5.1 血清SP、CCK 測定 將股動脈取得的3 mL，靜置2 h 后離心(2 000 r/min)10 min，取上清，放入尖底管中4 ℃低溫冰箱保存待測，采用放免法檢測SP、CCK。

2.5.2 小腸組織的收集 大鼠處死后，迅速將近胃竇端小腸組織截取，稱定質量后分別用眼科小剪刀快速剪碎，分別置于勻漿器中，用9 倍組織質量生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，并以3 500 r/min 離心10 min，取上清液置4 ℃冰箱保存，采用放免法檢測SP、CCK。

3 結 果

3.1 大鼠一般生存狀態(tài) 空白對照組大鼠始終表現(xiàn)為反應靈敏，活動及飲食量正常，被毛濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。D-IBS 模型組大鼠多數在第4 天即開始出現(xiàn)倦臥、被毛稀疏干枯;第7 天后出現(xiàn)怠動少食、消瘦拱背，肛周污穢，部分動物出現(xiàn)脫肛，甚至動作遲緩，同時毛發(fā)失去光澤而枯槁、疏散，成群蜷縮或拱背，并逐漸出現(xiàn)體質量減輕，排泄物增多(墊料呈橘黃色)等“脾虛”癥狀(D-IBS 組1 只大鼠因灌胃操作不當致死，尸檢未見明顯異常)。四君子湯、理中湯中藥組大鼠第6 天出現(xiàn)輕度倦臥、被毛稀疏干枯;第9 天后出現(xiàn)少食、怠動、消瘦，肛周污穢，部分動物出現(xiàn)脫肛，動作遲緩，大便增多等，第12 天后上述癥狀開始減輕或消失，表現(xiàn)為反應較為靈敏，活動及飲食量正常，被毛疏散但有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。

3.2 各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較 與空白組比較，模型組大鼠胃殘留率明顯升高，小腸推進率顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);經中藥干預后并與模型組比較，四君子湯和理中湯均能降低胃殘留率和小腸推進率，但以理中湯作用顯著，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，且在抑制小腸推進率方面，理中湯組與四君子湯比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較(±s)

表1 各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較(±s)

注:與空白組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與四君子湯組比較，▲P ＜0.05

組別 動物數/n 胃殘留率/% 小腸推進率/%10 38.94 ±7.85 42.26 ±10.35 D-IBS 模型組 9 60.14 ±9.23＊＊ 70.83 ±14.38＊＊四君子湯組 10 52.42 ±9.54 57.07 ±12.09△理中湯組 10 43.87 ±10.52△ 46.13 ±10.44空白組△△▲

3.3 各組大鼠血清及小腸膽囊收縮素(CCK)的比較 與空白組比較，模型組大鼠血清及小腸CCK 水平均顯著升高，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P ﹤0.01);經中藥干預后，四君子湯和理中湯均能降低血清及小腸CCK 水平，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P ﹤0.05，P ﹤0.01)，四君子湯和理中湯組比較，以理中湯作用顯著，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P ﹤0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清及小腸膽囊收縮素(CCK)的比較(±s)

表2 各組大鼠血清及小腸膽囊收縮素(CCK)的比較(±s)

注:與空白組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與四君子湯組比較，▲P ＜0.05

組別 動物數/n 血清CCK/(pg·mL -1)小腸CCK/(ng·g -1)10 37.74 ±4.84 65.09 ±11.55 D-IBS 模型組 9 59.24 ±7.02＊＊ 95.50 ±16.04＊＊四君子湯組 10 50.19 ±5.57△△ 81.51 ±14.54△理中湯組 10 43.86 ±8.64△△▲ 67.35 ±16.41空白組△△▲

3.4 各組大鼠血清及小腸P 物質(SP)的比較 與空白組比較，模型組大鼠血清/小腸組織SP 水平升高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P ﹤0.01);經中藥干預后并與模型組比較，四君子湯有降低血清SP 水平的趨勢，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P ﹥0.05)，理中湯能顯著降低血清SP 水平，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P ﹤0.05);而且四君子湯和理中湯均能降低小腸組織SP 水平，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P ﹤0.05，P ﹤0.01)，理中湯組與四君子湯比較以理中湯作用顯著，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P ﹤0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清及小腸P 物質(SP)的比較(±s)

表3 各組大鼠血清及小腸P 物質(SP)的比較(±s)

注:與空白組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與四君子湯組比較，▲P ＜0.05

組別 動物數/n 血清SP/(pg·mL -1)小腸SP/(ng·g -1)10 77.42 ±10.93 114.22 ±14.97 D-IBS 模型組 9 96.01 ±12.58＊＊ 158.50 ±13.10＊＊四君子湯組 10 87.01 ±14.50 139.28 ±14.01△理中湯組 10 83.70 ±12.46△ 125.25 ±15.46空白組△△▲

4 討論

腸易激綜合征(IBS)是一種臨床最常見的慢性腸功能紊亂疾病，由于該病缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學改變和生化異常，臨床表現(xiàn)復雜，常以結腸癥狀為主，也可表現(xiàn)為其他消化道癥狀甚至軀體癥狀。目前IBS 的病因尚未完全明了，但其涉及因素較多，如與腸道運動異常、內臟感覺異常、腦腸相互作用、神經免疫機制紊亂等有關。尤其是腹瀉型腸易激綜合征 (Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS)的發(fā)病與精神因素，胃腸激素分泌紊亂，炎癥介質及免疫因子促發(fā)等因素有關，中醫(yī)學認為DIBS 與脾虛證或脾虛為主證的臟腑病證密切相關。

其中腸神經系統(tǒng)(entericnervous system，ENS)是胃腸壁內的自主神經系統(tǒng)，具有獨立于大腦而行使其功能的完整結構。近年來的研究結果表明ENS 中的神經遞質以及多種神經肽與IBS 的發(fā)病機制存在一定關系。如Sjolund等［9-10］學者研究表明，IBS 的胃結腸反射(進食可以刺激結腸運動，引起結腸收縮增加，從而激發(fā)便意，稱為胃結腸反射)多由胃腸激素濃度的變化調節(jié)，而且胃腸激素對胃腸道的分泌、運動、吸收、營養(yǎng)和免疫等起著重要作用，它們的分泌異?？蓪е挛改c道運動紊亂。作為胃腸激素之一的P 物質，是速激肽家族中具有11 個氨基酸的多肽，廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)、消化系及免疫器官等部位，SP 作用于消化系主要表現(xiàn)為促進腸蠕動、增高結腸內壓力、參與痛覺傳導、刺激小腸和結腸黏膜分泌水分及電解質、促進胃腸道血管擴張等［11］;SP 還可以促進肥大細胞脫顆粒反應，釋放的組胺、前列腺素、白三烯、緩激肽等活性介質，可引起組織炎癥性反應、神經性疼痛，介導內臟高敏反應等［12］。

膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)主要由十二指腸和空腸黏膜的I 細胞合成，具有廣泛的生物作用，可以促進胰腺分泌和膽囊收縮，舒張Oddi 氏括約肌，減慢胃排空，促進小腸及結腸的運動并縮短通過時間［13］。有研究表明IBS 患者血漿中CCK 水平明顯高于健康者［14］。Thomson等［15］認為，CCK 可以增加結腸黏膜機械感受器的敏感性，因此CCK 水平增高可能通過降低腸易激綜合征患者內臟痛覺感受器的閾值或拮抗內源性鴉片樣物質的鎮(zhèn)痛作用，使患者出現(xiàn)腹痛。

中醫(yī)學基于D-IBS 持續(xù)存在或間歇發(fā)作的“腹瀉、腹痛或食入即瀉”等臨床癥狀群特征，將其歸納為“泄瀉、腹痛”等范疇，認為本病病因在于外邪直中、飲食不節(jié)、勞倦體虛等，導致脾胃虛弱，升降失調，或脾虛濕盛，下注大腸，雖病位在腸，但其本在脾，故證候類型多歸納為脾虛證或脾虛濕盛證，亦有大量研究表明脾虛證都存在腸神經系統(tǒng)分泌異常、胃腸道運動和小腸分泌吸收功能紊亂［12］，由此提示IBS 發(fā)生與中醫(yī)脾虛證的病機實質關系密切，而且在中醫(yī)臨床上諸多醫(yī)家常常應用益氣健脾的四君子湯或溫中健脾的理中湯加減治療脾虛腹瀉之癥，療效確切［16-17］。經方四君子湯以人參、白術、茯苓、炙甘草四味藥物配伍組成共湊益氣健脾之功，而理中湯以人參、白術、干姜、炙甘草配伍組成共湊溫中健脾之功，兩首復方雖均能治療脾虛腹瀉之證，但理中湯配方中以干姜替代茯苓，加強了溫中散寒，回陽燥濕的功效。故本研究以D-IBS 大鼠為研究對象，通過檢測血清及小腸組織胃腸激素SP、CCK 表達差異的變化，比較四君子湯和理中湯對D-IBS 的干預效應。

本研究結果顯示D-IBS 模型大鼠胃殘留率明顯升高，小腸推進率顯著升高，說明D-IBS 大鼠存在胃腸排空、轉運功能紊亂;D-IBS 模型大鼠血清及小腸CCK、SP 水平均顯著升高，說明脾虛型D-IBS 模型大鼠存在胃腸運動障礙和胃腸激素分泌紊亂;經中藥干預后，四君子湯和理中湯均能降低血清及小腸CCK 水平，其中四君子湯和理中湯組比較，以理中湯作用顯著;在抑制SP 表達方面，四君子湯和理中湯有降低血清SP 水平的趨勢，但四君子湯組與模型組比較組間差異無統(tǒng)計學意義，理中湯組與模型組比較組間差異有統(tǒng)計學意義;而且四君子湯和理中湯均能降低小腸組織SP 水平，理中湯組與四君子湯比較以理中湯作用顯著，說明四君子湯和理中湯調節(jié)D-IBS 大鼠胃腸轉運功能、血清及小腸CCK、SP 表達方面的作用相似，且理中湯的作用優(yōu)于四君子湯，提示理中湯去茯苓加干姜后，較四君子湯加強了溫中散寒，燥濕止瀉之功，說明恢復脾之陽氣，加強燥濕健脾，滲濕止瀉之功是理中湯治療D-IBS 的途徑之一。

［1］ 中華醫(yī)學會消化病學分會. 腸易激綜合征的共識意見［J］.中華內科雜志，2003，42(9):669-670.

［2］ 楊 紅，錢家鳴. 胃腸激素與腸易激綜合征［J］. 胃腸病學和肝病學雜志，2002，11(4):367-369.

［3］ 吳 兵，張聲生. 腸易激綜合征腹瀉型的證候學研究進展［J］. 北京中醫(yī)藥，2007，26(5):312-314.

［4］ 譚遠忠，魏文斌，劉 華. 運脾化濕中藥對腸易激綜合征脾胃濕阻證患者AQP8 表達的影響研究［J］. 中藥材，2009，32(9):1487-1489.

［5］ 苗明三. 實驗動物和動物實驗技術［M］. 北京:中國中醫(yī)藥出版社，1997:142.

［6］ 查安生，張樹卿，周 導，等. 逍遙煎劑對腹瀉型腸易激綜合征大鼠的治療作用［J］. 中國中西醫(yī)結合消化雜志，2008，16(3):165-167.

［7］ 陳 奇. 中藥藥理研究方法［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:332.

［8］ 葉仁群，張光奇. 二金湯鎮(zhèn)痛作用和對胃腸運動功能影響的實驗研究［J］. 中南藥學，2004，2(1):39-40.

［9］ Sjound K，Ekman R，Lindgren S，Rehfeld J F. Disturbed motilin and cholecystokinin release in the irritable bowel syndrome［J］. Scand J Gastroenterol，1996，31(11):1110-1114.

［10］ 鄭小偉，王 穎，宋 紅. 三種脾氣虛證模型大鼠血清胃泌素及胃竇G 細胞的比較研究［J］. 中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(6):338-340.

［11］ 藍 程，唐承薇. P 物質對多器官功能衰竭時腸黏膜肥大細胞活性的調節(jié)［J］. 中華消化雜志，2003，23(5):271-274

［12］ Bradesi S，Eutamene H，Garcia-Villar R. Acute and chronic stress differently affect visceral sensitivity to rectal distension in female rats［J］. Neurogastroenterol Motil，2002，14 (1):75-82.

［13］ 蕭樹東. 江紹基胃腸病學［M］. 上海:上海科學技術出版社，2001:67-69.

［14］ 張紅杰，林 琳，趙志泉，等. 胃腸肽類激素與腸易激綜合征發(fā)病間的關系［J］. 南京醫(yī)科大學學報:自然科學版，2003，23(6):527-529.

［15］ Thomson I R，F(xiàn)ettman M J，Jonsson J. Alimentary tract and pancreas responses to cholecystokinin octapeptide in patients with functional abdominal pain syndromes［J］. Gastroenterol Hepatol，1992，7(3):293-297.

［16］ 李洪現(xiàn)，郭遂成，李秉濤. 四君子湯加味治療腸易激綜合征療效觀察［J］. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2005，14(4):456

［17］ 程衛(wèi)軍，胡秋炎. 理中湯加味治療腸易激綜合征108 例臨床觀察［J］. 山東中醫(yī)雜志，2000，19(4):207.