HPLC 法測定泰脂安膠囊中5 種三萜類化學(xué)成分

侯俊杰， 石 靜， 聶 晶*

(1. 湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢430064;2. 貴陽市環(huán)境監(jiān)測站，貴州 貴陽550002)

泰脂安膠囊為女貞葉(leaf of Ligustri lucidum)乙醇提取物制成的膠囊，具有滋養(yǎng)肝腎的功效，用于肝腎陰虛、陰虛陽亢證所致的原發(fā)性高脂血癥的治療。女貞葉乙醇提取物主含三萜類成分，其中齊墩果酸和熊果酸具有護肝、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫功能等藥理作用［1-2］?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法測定熊果酸的量［3-4］，該方法準(zhǔn)確性、重復(fù)性較差。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，本實驗選用高效液相色譜法，測定泰脂安膠囊中5 種三萜類化學(xué)成分量。

1 儀器、試劑與試藥

HP-1100 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)，G1314AVWD 紫外檢測器，Agilent 1100 化學(xué)工作站。

熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110742-200415);齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110709-200304);19α-羥基熊果酸對照品、2α-羥基熊果酸對照品、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸(均為自制對照品，純度均＞98%)。

泰脂安膠囊(三九黃石制藥廠，批號分別為090101、 090102、 090203、 090401、 1008171Z、1010281Z、1012011Z、1012241Z、1101281Z);甲醇、乙腈為色譜純;水為超純水;其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 大連依利特Kromasil C18液相色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相為甲醇-乙腈-10 mmol/L 乙酸銨溶液(53 ∶27 ∶20);檢測波長205 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫15 ℃;進樣量10 μL。理論板數(shù)按熊果酸峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.2 對照品溶液的制備 分別取5 種對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 分別含19α-羥基熊果酸30 μg、2α-羥基熊果酸50 μg、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸8 μg、齊墩果酸140 μg、熊果酸300 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取泰脂安膠囊內(nèi)容物0.3 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲處理 (功率250 W，頻率33 kHz)10 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備 取缺女貞葉乙醇提取物的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，結(jié)果見圖1。陰性對照溶液色譜圖中，在與19α-羥基熊果酸、2α-羥基熊果酸、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸、齊墩果酸、熊果酸峰相同保留時間處未見吸收峰，陰性樣品無干擾。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液(19α-羥基熊果酸28.50 μg/mL、2α-羥基熊果酸49.44 μg/mL、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸8.11 μg/mL、齊墩果酸0.149 8 mg/mL、熊果酸0.345 5 mg/mL)2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，以進樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程分別為:19α-羥基熊果酸Y =574.1 X +3.2 (r =0.999 9);2α-羥基熊果酸Y =551.5 X- 4.1 (r=0.999 8);3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸Y=882.9 X -54.5 (r =0.999 7);齊墩果酸Y =111.8X -54.5 (r =0.999 4);熊果酸Y =232.9X-90.5 (r =0.999 8)。結(jié)果表明19α-羥基熊果酸在0.057 ～0.570 μg、2α-羥基熊果酸在0.099 ～0.990 μg、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸0.016 ～0.160 μg、齊墩果酸在0.300 ～3.00 μg、熊果酸在0.691 ～6.91 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 精密吸取“2.6”項配好的混合對照品溶液，重復(fù)進樣6 次，測定峰面積，計算得19α-羥基熊果酸、2α-羥基熊果酸、23β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸、齊墩果酸、熊果酸的RSD 分別1.2%、0.9%、1.5%、1.0%、1.1%。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液 (批號1012241Z)，分別于配置后0、2、4、8、12、24 h進樣測定，測得19α-羥基熊果酸、2α-羥基熊果酸、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD 分別為0.9%、1.0%、1.4%、1.2%、0.9%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批樣品 (批號1012241Z)6 份，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，樣品中19α-羥基熊果酸平均含有量為7.79 mg/g，RSD 為1.0%;2α-羥基熊果酸平均含有量為19.1 mg/g，RSD 為1.3%;3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸平均含有量為1.19 mg/g，RSD 為1.5%;齊墩果酸平均含有量為38.2 mg/g，RSD 為1.1%;熊果酸平均含有量為75.5 mg/g，RSD 為1.3%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗 精密稱取批號1012241Z 的供試品6 份，各約0.15 g，精密加入混合對照品溶液(19α-羥基熊果酸0.115 mg/mL、2α-羥基熊果酸0.288 mg/mL、3β-反式對羥基肉桂酰氧基-2α-羥基齊墩果酸0.018 0 mg/mL、齊墩果酸0.553 mg/mL、熊果酸1.11 mg/mL)10mL，加甲醇適量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)10 min，放冷，加甲醇至刻度，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.11 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定9 批樣品，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(mg/g)Tab.2 Results of sample determination (mg/g)

3 討論

薄層掃描法難以將齊墩果酸和熊果酸二者有效分離，且其展開顯色后極不穩(wěn)定，褪色較快，難以得到較好的測定結(jié)果。本實驗通過建立HPLC 法測定泰脂安膠囊中齊墩果酸與熊果酸等5 種三萜類成分的量，在所選用條件下齊墩果酸與熊果酸能夠得到較好的分離，所測結(jié)果重復(fù)性、精密度較好，能夠有效地對泰脂安膠囊的質(zhì)量進行控制，可以作為本品的成分定量測定控制方法。

分別取齊墩果酸與熊果酸對照品溶液，于200 ～400 nm 掃描，確定最大吸收波長均在203 ～206 nm，綜合考慮采用205 nm 為檢測波長。由于齊墩果酸和熊果酸為同分異構(gòu)體，性質(zhì)相似，給分離帶來較大困難，曾以甲醇-水、乙腈-水等系統(tǒng)［5-8］，并在流動相中加入磷酸、冰醋酸、乙酸銨等試劑，通過調(diào)整比例，最后選用甲醇-乙腈-10 mmol/L 乙酸銨溶液(53 ∶27 ∶20)作為流動相，色譜峰峰形對稱，基線平直，分離效果較好。柱溫對齊墩果酸與熊果酸的分離影響很大，溫度越低分離度越高，當(dāng)柱溫為15 ℃時，其分離度大于3.0。泰脂安膠囊內(nèi)容物為女貞葉乙醇提取物，通過試驗比較，當(dāng)用甲醇超聲10 min 以上時，5 種三萜類成分提取率基本不再增高，故提取方法采用甲醇超聲10 min。

不同批號泰脂安膠囊中5 種三萜類化學(xué)成分的總量差異較小，質(zhì)量較為穩(wěn)定，分析其原因可能與其生產(chǎn)原料女貞葉乙醇提取物制備工藝穩(wěn)定、質(zhì)量控制較好有關(guān)。

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