正交試驗(yàn)結(jié)合抗菌活性實(shí)驗(yàn)優(yōu)選野菊花的提取工藝

何志超， 李劍芳， 李國(guó)成， 王冬梅

(1. 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州510120;2. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510080)

野菊花是菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L. 的干燥頭狀花序，其性微寒，味苦辛，入肝、肺經(jīng)。具有疏風(fēng)清熱，解毒消腫，降血壓等功效［1］，現(xiàn)代藥理研究表明，野菊花具有良好的抗菌、消炎、抑制血小板凝集等作用［2-4］。有相關(guān)文獻(xiàn)［5-7］報(bào)道了野菊花相關(guān)的正交試驗(yàn)，但僅從化學(xué)成分上予以考察，均未納入活性實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。因此，為建立更加全面的野菊花提取工藝，提高提取物活性，本試驗(yàn)選擇正交試驗(yàn)結(jié)合抗菌活性實(shí)驗(yàn)方法，優(yōu)選野菊花的最佳提取工藝參數(shù)，為野菊花的進(jìn)一步開發(fā)提供有益的參考。

1 儀器與材料

TU-1800PC 紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);BL310 電子天平(SARTORIUS 廠);三洋牌MLS-3020 高壓滅菌鍋;YJ-875B醫(yī)用凈化工作臺(tái)(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);PSH500A 生化培養(yǎng)箱(重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);XSP-4C光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)。

蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100080-200707)。乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、黃曲霉，所用菌種均來自廣州市微生物研究所。牛肉膏(上海長(zhǎng)陽(yáng)生化制藥廠出品);蛋白胨(廣東環(huán)凱微生物科技公司);瓊脂粉(廣東省科學(xué)微生物研究所)。

野菊花干燥花序，購(gòu)自廣州市清平藥材批發(fā)市場(chǎng)。經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院楊得坡教授鑒定為菊科植物野菊 (Chrysanthemum indicum L.)的干燥頭狀花序。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果以及參考相關(guān)文獻(xiàn)，以料液比(因素A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(因素B)、提取溫度(因素C)、提取時(shí)間(因素D)、pH 值(因素E)為考察因素，每個(gè)因素選擇4 個(gè)水平，以野菊花總黃酮量、浸出物總量以及抑菌活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L16(45)正交表設(shè)計(jì)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，具體因素水平詳見表1。

表1 野菊花提取工藝正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels for extraction of Chrysanthemum indicum L.

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［8］精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 (0.2 mg/mL)0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25 mL 量瓶中，各加入6 mL 蒸餾水，再加入5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻后放置后6 min，再次加入1% 硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后放置6 min，再加入4%氫氧化鈉10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min 后。從700nm 至200nm 進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)為509.5nm。以吸光度A 為Y 軸，對(duì)質(zhì)量濃度C 為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為:A = 8.82 ×10-3C+1.13 ×10-2(r=0.998 5，P ＜0.001)。

2.2.2 總黃酮的測(cè)定 分別精密量取供試液5 mL置于25 mL 量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行測(cè)定，顯色，在509.5 nm 處測(cè)定吸光度A1，另分別精密量取供試液5 mL，置于25 mL 量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，在509.5 nm 處測(cè)定吸光度A2，取二次吸光度差值，由回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含有量。

2.3 抗菌活性的測(cè)定［9］嚴(yán)格按照CLSI 體外藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程，配制含有不同藥物濃度 (0%、1%、2%、4%，m/V)的瓊脂平皿，用微量移液器吸取適量提取物濃溶液置冷卻至50 ℃左右的培養(yǎng)基中，迅速振搖使之混合均勻，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中至厚度為4 ～5 mm，水平放置待凝。

菌液按要求配制，控制稀釋濃度在1.5 ×106cfu/mL。用微量移液器吸取0.1 mL 菌液于培養(yǎng)基上，涂抹均勻。接種后培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌于24 h 后觀察結(jié)果，真菌于48 h 后觀察結(jié)果。抗菌活性結(jié)果詳見表2。

2.4 正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)及結(jié)果分析 本正交試驗(yàn)應(yīng)用SPSS17.0 進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析，采用多指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)分采用綜合評(píng)分法進(jìn)行處理。總的綜合評(píng)分計(jì)算公式為:Yg*=ΣWk ×Ygk’，Yg*指第g 號(hào)試驗(yàn)的總評(píng)分;Wk 指權(quán)重(出膏率的權(quán)重為0.3，總黃酮提取率的權(quán)重為0.4，抗菌活性的權(quán)重為0.3)，Ygk’指第g 號(hào)試驗(yàn)K 項(xiàng)指標(biāo)消除量綱后的評(píng)分。Ygk’ = (Ygk - Ykmin) × 100/(Ykmax-Ykmin)，Ygk 指第g 號(hào)試驗(yàn)k 項(xiàng)指標(biāo)測(cè)量值;Ykmax指第k 項(xiàng)指標(biāo)中的最大值，Ykmin指第k項(xiàng)指標(biāo)中的最小值。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見4，5。

表2 野菊花抗菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of antibacterial activities of Chrysanthemum indicum L.

由表3，5 可知，綜合總黃酮量、浸出物總量以及抗菌活性3 個(gè)指標(biāo)后，各因素對(duì)綜合評(píng)分結(jié)果影響大小依次為B ＞C ＞A ＞E ＞D，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)結(jié)果影響最大，確定最佳工藝為A3B3C4D2E4，即加入8 倍量50%乙醇后調(diào)整pH 至9，在80 ℃下回流提取4 h。

2.5 正交試驗(yàn)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果所得的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行3 批次驗(yàn)證試驗(yàn)，具體詳見表6。

表5 單因素統(tǒng)計(jì)量Tab.5 Results of estimated marginal means

表6 野菊花提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Tab.6 Results of confirmatory experiment for extraction of Chrysanthemum indicum L.

結(jié)果顯示所得的野菊花提取物出膏率、總黃酮量高，抗菌活性良好。提示正交試驗(yàn)所得的工藝符合實(shí)際，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇 中藥提取系采用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒ㄊ怪兴幩挠行С煞只蛴行Р课唤龅牟僮?，合理的提取工藝?yīng)最大程度保留有效成分以及提高提取效率［10］。本研究結(jié)合理化指標(biāo)(總黃酮量、浸出物總量)以及藥效學(xué)指標(biāo)(抑菌活性)對(duì)野菊花提取工藝進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，盡可能做到全面反映提取工藝的優(yōu)劣。

3.2 抗菌活性結(jié)果分析 本試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)野菊花浸膏抗菌活性影響最大的因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度。其中乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，提取溫度越低，所提取浸膏的抗菌活性越高。并且不同條件提取的野菊花提取物均對(duì)供試細(xì)菌具有良好的抗細(xì)菌活性，在較低濃度下(1%)仍對(duì)供試細(xì)菌有明顯的抗菌活性，與文獻(xiàn)報(bào)道的野菊花有較強(qiáng)的抗細(xì)菌活性相符［11-13］。對(duì)于供試真菌，僅在高濃度時(shí)(3% ～4%)表現(xiàn)出一定的抗真菌活性，與文獻(xiàn)報(bào)道不相符［12］，這可能與野菊花的提取方式不同相關(guān)。有報(bào)道顯示［14］，相同的中藥采用不同的提取方式，其提取物的抗菌活性會(huì)有顯著差別，主要原因?yàn)椴煌崛》绞綄?dǎo)致各提取物的組成不相同，從而導(dǎo)致抗菌活性的差別。

3.3 結(jié)果分析討論 根據(jù)所選取的因素水平考察結(jié)果，最終確定影響野菊花提取工藝的因素依次為:B ＞C ＞A ＞E ＞D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞pH 值＞提取時(shí)間，各因素均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)提取工藝影響最大。適當(dāng)?shù)囊掖俭w積分?jǐn)?shù)有利于溶解大部分的有機(jī)化合物，減少雜質(zhì)的提取，使有效成分含量高。但同時(shí)隨著溫度的升高，抗菌活性有所下降，原因?yàn)橐熬栈ú糠挚咕钚猿煞謱?duì)熱敏感，如萜類化合物對(duì)高熱敏感，會(huì)引起氧化或重排，造成結(jié)構(gòu)的改變。

料液比、pH 值為次要影響因素。料液比對(duì)提取效率影響較大，隨著料液比升高，提取率增大，這是因?yàn)槿軇┰蕉?，植物成分的溶出越多。而?duì)于抗菌活性的影響，除了在1 ∶4 的水平下抗菌活性最強(qiáng)外，其余水平活性接近。由于溶劑越多，后期的減壓濃縮所需的時(shí)間越長(zhǎng)，提取液受熱的時(shí)間就越長(zhǎng)，這可能造成了抗菌活性成分的變性，所以抗菌活性有所下降。pH 對(duì)野菊花提取綜合評(píng)價(jià)影響亦較大，野菊花含有大量黃酮類化合物，且多具有酚羥基，顯弱酸性，在堿性條件下可提高其提取率。

提取時(shí)間影響最少。當(dāng)提取時(shí)間由2 h 增加到4 h，提取率增加明顯，隨后增加提取時(shí)間對(duì)提取率以及抗菌活性影響不大。

本試驗(yàn)以野菊花總黃酮量，浸出物總量以及抗菌活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選野菊花最佳提取工藝，同時(shí)兼顧理化指標(biāo)與藥效學(xué)指標(biāo)，較單純理化指標(biāo)的提取篩選工藝相對(duì)更科學(xué)、合理，且優(yōu)化后所得條件相對(duì)穩(wěn)定可靠，為進(jìn)一步開發(fā)野菊花提供有益的依據(jù)。

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