贛南地區(qū)非綜合征性唇腭裂患者尿液代謝組學(xué)的初步研究

凌永昌+劉瑞珍+劉翔+等

【摘要】 目的：通過檢測非綜合征性唇腭裂（NSCL/P）患者與正常人尿液中代謝物的變化，探討基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)在此癥的臨床應(yīng)用中的可行性。方法：分別收集12個(gè)NSCL/P患者和12個(gè)正常人對照組的尿液樣品。采用NMR分析NSCL/P患者尿液代謝特征，測定1 H-NMR圖譜，進(jìn)而用主成分分析法（PCA）處理NMR數(shù)據(jù)，研究NSCL/P組和正常對照組尿液中的代謝物差異，獲得NSCL/P患者的特異性代謝標(biāo)志物。結(jié)果：NSCL/P組和正常對照組間的尿液代謝產(chǎn)物存在明顯差別。結(jié)論：采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)能較好地反映NSCL/P患者尿液的代謝變化，獲得相應(yīng)的特征代謝物，在未來的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

【關(guān)鍵詞】 非綜合征性唇腭裂； 基于核磁共振的代謝組學(xué)； 主成分分析

唇腭裂是一種常見的口腔頜面部先天性發(fā)育畸形，我國是唇腭裂高發(fā)國家[1-2]。有研究表明近年來非綜合征性唇腭裂總體發(fā)病率在我國呈上升趨勢[3]。其影響因素不是單一的，患兒父母的家族遺傳病史、飲酒、吸煙等，母孕早期感染、使用藥物等都有可能造成發(fā)病[4-5]。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的新學(xué)科，它是通過觀察生物體系受生理病理刺激前后代謝產(chǎn)物圖譜的動態(tài)變化，來研究生命體系代謝網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)[6-7]。通過代謝組學(xué)研究既可以發(fā)現(xiàn)生物體在受到各種內(nèi)外環(huán)境擾動后的不同應(yīng)答，也可以區(qū)分同種不同個(gè)體之間的表型差異[8]。利用NMR對完整器官或組織細(xì)胞內(nèi)許多微量代謝組分進(jìn)行檢測，可得到相應(yīng)的生物體代謝物信息，研究這些組分的NMR圖譜，可以了解生物體代謝規(guī)律[9]。本文旨在運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究比較先天性唇腭裂患者和正常人的尿液代謝情況，找出兩者間的差異代謝物，從而可能為未來唇腭裂患者的早期診斷提供潛在的檢測代謝物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)采集2013年7月-2014年7月在本院診斷為非綜合征性唇腭裂患者的尿液12例，其中女8例，男4例，年齡5～20歲，平均（9±4.2）歲。同時(shí)隨機(jī)選擇2013年在本院健康體檢科查體的健康人的尿液12例作為對照組，女7例，男5例，年齡12～20歲，平均（15.0±4.1）歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 本實(shí)驗(yàn)主要儀器有：Bruker Avance DRX 600核磁共振儀（Bruker公司，德國）；XYJ80-2低速離心機(jī)（江蘇金壇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；MR1812高速離心機(jī)（jouan公司，法國）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本的采集 研究對象晨起第一次尿液的中段尿，后做好標(biāo)記保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 NMR數(shù)據(jù)的采集

1.3.2.1 預(yù)處理樣本 將凍干處理過的樣本在室溫下解凍，向編號后的Ep管中分別依次加入600 ?L樣本液及300 ?L重水，快速渦旋混勻器上震蕩混勻后，靜置10 min，在4 ℃下以14000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取其上清液500 ?L加入直徑為5 mm核磁共振管中，待NMR分析。

1.3.2.2 獲取1H-NMR核磁共振氫譜圖 獲取不同實(shí)驗(yàn)組1H-NMR核磁共振氫譜圖，使用MestReNova軟件（V7.0）對譜圖進(jìn)行了傅立葉變換，相位調(diào)整，基線校正，及定標(biāo)等處理。

1.3.2.3 差異代謝物的篩選及鑒定 通過分析各代謝物相應(yīng)的系數(shù)，在相關(guān)系數(shù)圖中，將每一個(gè)變量的載荷值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方根值相乘后進(jìn)行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換。然后與相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)臨界值表進(jìn)行比對，得到引起組間差異的代謝物。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別多變量分析，主成分分析使用中心化換算的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3 討論

先天性唇腭裂是人類最常見的先天性畸形之一[10]。唇腭裂畸形的發(fā)生與許多因素有關(guān)，是多種因素在同一或不同時(shí)期綜合作用的結(jié)果。胚胎早期的外環(huán)境，包括病毒感染、化學(xué)藥物、毒物、妊娠反應(yīng)、營養(yǎng)不良、生育年齡、胎次、胎兒出生季節(jié)等都可能與之相關(guān)[11]。

本研究運(yùn)用代謝組學(xué)對比分析了12例非綜合征性唇腭裂患者和12例正常人的尿液樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者在尿液代謝產(chǎn)物上的確存在差異，這些引起差異的特征性代謝產(chǎn)物可能是非綜合征性唇腭裂的生物標(biāo)記物，為以后對本病的研究及治療提供一個(gè)思路[12]。

綜合起來，筆者的研究表明，基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)可以較好地用于獲得具有特征性的代謝物，是尋找非綜合征性唇腭裂標(biāo)志物的有效方法，在未來的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景[13-15]。

參考文獻(xiàn)

[1]張艷萍，李逸松，梁娜，等.1253例唇腭裂患者的臨床資料分析[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，19（6）：642-643.

[2]代禮，繆蕾，周光萱，等.1996～2000年中國圍產(chǎn)兒腭裂畸形發(fā)生狀況分析[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，22（1）：35-37.

[3]趙瑞紅.先天性唇腭裂的流行病學(xué)分析[J].中國實(shí)用醫(yī)藥，2011，6（16）：223-224.

[4] Beaty T H， Wang H， Hetmanski J B，et al.A case-control study of nonsyndromic oral clefts in Maryland[J].Ann Epidemiol，2001，11（6）：434-442.

[5]陳偉良，陳光曄，任材年，等.1524例先天性唇腭裂的臨床分類和發(fā)病因素分析[J].口腔醫(yī)學(xué)縱橫，1996，12（1）：20-22.endprint

[6] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E.'Metabonomics'： understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[7] Fiehn O， Kopka J， Dormann P，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics[J].Nat Biotechnol，2000，18（11）：1157-1161.

[8]許國旺，路鑫，楊勝利.代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29（6）：701-711.

[9]周京琳.采用基于～1H-NMR的代謝組學(xué)方法對口腔鱗癌患者血漿的初步分析[D].成都：四川大學(xué)，2006.

[10]于加友，孫健.唇腭裂發(fā)病相關(guān)因素研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用口腔科雜志，2008，1（3）：172-174.

[11]王麗君，黃金龍，萬偉東.非綜合征性唇腭裂的遺傳因素和環(huán)境因素研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)：遺傳學(xué)分冊，2005，28（2）：102-104.

[12]楊為進(jìn)，王亞韡，周群芳，等.人體尿液代謝組NMR分析[J].中國科學(xué)（B輯：化學(xué)），2008，38（1）：85-92.

[13] Brindle J T， Antti H， Holmes E，et al.Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics[J].Nat Med，2002，8（12）：1439-1444.

[14] Keun H C， Ebbels T M， Antti H，et al. Analytical reproducibility in （1）H NMR-based metabonomic urinalysis[J]. Chem Res Toxicol，2002，15（11）：1380-1386.

[15]蔣懷周，劉磊，危陽洋，等.基于NMR技術(shù)對Wilson病模型大鼠尿液的代謝組學(xué)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（1）：70-73.

（收稿日期：2014-08-20） （本文編輯：王宇）endprint

[6] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E.'Metabonomics'： understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[7] Fiehn O， Kopka J， Dormann P，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics[J].Nat Biotechnol，2000，18（11）：1157-1161.

[8]許國旺，路鑫，楊勝利.代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29（6）：701-711.

[9]周京琳.采用基于～1H-NMR的代謝組學(xué)方法對口腔鱗癌患者血漿的初步分析[D].成都：四川大學(xué)，2006.

[10]于加友，孫健.唇腭裂發(fā)病相關(guān)因素研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用口腔科雜志，2008，1（3）：172-174.

[11]王麗君，黃金龍，萬偉東.非綜合征性唇腭裂的遺傳因素和環(huán)境因素研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)：遺傳學(xué)分冊，2005，28（2）：102-104.

[12]楊為進(jìn)，王亞韡，周群芳，等.人體尿液代謝組NMR分析[J].中國科學(xué)（B輯：化學(xué)），2008，38（1）：85-92.

[13] Brindle J T， Antti H， Holmes E，et al.Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics[J].Nat Med，2002，8（12）：1439-1444.

[14] Keun H C， Ebbels T M， Antti H，et al. Analytical reproducibility in （1）H NMR-based metabonomic urinalysis[J]. Chem Res Toxicol，2002，15（11）：1380-1386.

[15]蔣懷周，劉磊，危陽洋，等.基于NMR技術(shù)對Wilson病模型大鼠尿液的代謝組學(xué)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（1）：70-73.

（收稿日期：2014-08-20） （本文編輯：王宇）endprint

[6] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E.'Metabonomics'： understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[7] Fiehn O， Kopka J， Dormann P，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics[J].Nat Biotechnol，2000，18（11）：1157-1161.

[8]許國旺，路鑫，楊勝利.代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29（6）：701-711.

[9]周京琳.采用基于～1H-NMR的代謝組學(xué)方法對口腔鱗癌患者血漿的初步分析[D].成都：四川大學(xué)，2006.

[10]于加友，孫健.唇腭裂發(fā)病相關(guān)因素研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用口腔科雜志，2008，1（3）：172-174.

[11]王麗君，黃金龍，萬偉東.非綜合征性唇腭裂的遺傳因素和環(huán)境因素研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)：遺傳學(xué)分冊，2005，28（2）：102-104.

[12]楊為進(jìn)，王亞韡，周群芳，等.人體尿液代謝組NMR分析[J].中國科學(xué)（B輯：化學(xué)），2008，38（1）：85-92.

[13] Brindle J T， Antti H， Holmes E，et al.Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics[J].Nat Med，2002，8（12）：1439-1444.

[14] Keun H C， Ebbels T M， Antti H，et al. Analytical reproducibility in （1）H NMR-based metabonomic urinalysis[J]. Chem Res Toxicol，2002，15（11）：1380-1386.

[15]蔣懷周，劉磊，危陽洋，等.基于NMR技術(shù)對Wilson病模型大鼠尿液的代謝組學(xué)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（1）：70-73.

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