雙歧桿菌Ⅱ型毒素—抗毒素系統(tǒng)—MazEF的分子進(jìn)化分析

韋艷霞+劉佃濱+鄭紀(jì)偉+等

【摘要】 目的：對(duì)雙歧桿菌屬編碼的Ⅱ類毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)MazEF進(jìn)行分子進(jìn)化分析。方法：利用PSI-BLAST在NCBI中搜索獲得雙歧桿菌編碼的MazF分子序列，在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫、核酸數(shù)據(jù)庫分別下載其他菌屬基因組編碼的MazF蛋白序列和本研究所涉及菌屬的16 S rRNA序列，應(yīng)用Clustal X2和MEGA4軟件對(duì)MazF做分子進(jìn)化分析。結(jié)果：共搜索到雙歧桿菌株染色體編碼毒素蛋白MazF 26個(gè)。分子進(jìn)化分析顯示：整個(gè)雙歧桿菌屬的MazF保守性不好；MazF與16 S rRNA的共進(jìn)化僅在個(gè)別菌種中發(fā)現(xiàn)，大部分MazF的聚類結(jié)果與相應(yīng)菌種16 S rRNA的聚類結(jié)果不同。結(jié)論：雙歧桿菌中的TA系統(tǒng)MazEF可能是通過基因的水平轉(zhuǎn)移整合入基因組中，屬于菌株非核心基因組部分。

【關(guān)鍵詞】 MazEF； 毒素-抗毒素系統(tǒng)； 分子進(jìn)化； 雙歧桿菌

Ⅱ類毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)，最早在1982年于大腸埃希菌的低拷貝質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)。其后發(fā)現(xiàn)，TA系統(tǒng)同樣存在于細(xì)菌染色體上，也存在于一些外源DNA島如噬菌體、轉(zhuǎn)座子、超級(jí)內(nèi)含子和質(zhì)粒中，由于近年來發(fā)現(xiàn)其參與細(xì)菌的多種應(yīng)激調(diào)控過程而被廣泛關(guān)注[1]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：多達(dá)750個(gè)細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中存在Ⅱ類TA系統(tǒng)；自生微生物的基因組中一般含有多個(gè)Ⅱ類TA系統(tǒng)編碼基因，而在嚴(yán)格的胞內(nèi)微生物基因組中未發(fā)現(xiàn)Ⅱ類TA系統(tǒng)編碼基因；以上證據(jù)提示Ⅱ類TA系統(tǒng)對(duì)微生物的生存具有重要作用。主流觀點(diǎn)認(rèn)為：TA系統(tǒng)可能作為一個(gè)特殊的壓力反應(yīng)原件，在細(xì)菌對(duì)不利環(huán)境的應(yīng)激調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[2-3]。根據(jù)TA系統(tǒng)中氨基酸序列的相似度，Ⅱ類TA中的毒素蛋白被分為9個(gè)家族，包括CcdB、RelE、MazF、ParE、Doc、VapC、ζ、HipA以及HigB[3]。根據(jù)毒素蛋白的分類，相應(yīng)TA系統(tǒng)被分為9類。其中，MazEF是最早在大腸埃希菌基因組中發(fā)現(xiàn)、研究最為深入的Ⅱ類TA系統(tǒng)之一，參與細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)饑餓、抗生素、高溫、DNA損傷等應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控[1，4]。

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，具有對(duì)宿主多方面的益生作用，如拮抗腸道病原體、調(diào)節(jié)免疫、平衡腸道菌群等[5-20]。作為一種模式益生菌，雙歧桿菌經(jīng)常與其他乳酸菌一起用于益生菌制品的生產(chǎn)，在食品、醫(yī)藥、畜牧等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。作為益生菌使用的雙歧桿菌在工業(yè)加工、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸以及進(jìn)入宿主胃腸道的過程中會(huì)遭遇各種環(huán)境脅迫，如酸、熱、氧氣、營(yíng)養(yǎng)匱乏和高滲透壓等各種不利刺激。目前，已經(jīng)有近40株雙歧桿菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，但是它們的基因組中是否存在MazEF、它們分子的進(jìn)化關(guān)系如何、是否參與雙歧桿菌對(duì)多種不利環(huán)境的應(yīng)激調(diào)控均不清楚。由于構(gòu)成TA系統(tǒng)的一對(duì)毒素蛋白（MazF）和抗毒素蛋白（MazE）處于共進(jìn)化的狀態(tài)，MazF的進(jìn)化狀態(tài)可以代表TA系統(tǒng)MazEF的進(jìn)化狀態(tài)[21]。因此，本研究通過對(duì)雙歧桿菌MazF的進(jìn)化分析間接研究MazEF的分子進(jìn)化。作者在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得雙歧桿菌編碼的MazF，對(duì)其進(jìn)行多序列比對(duì)；進(jìn)一步將來自雙歧桿菌屬和其他菌屬的毒素蛋白MazF和菌株16 S rRNA的進(jìn)化分析結(jié)果進(jìn)行比較，完成對(duì)雙歧桿菌MazEF的分子進(jìn)化分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 MazF蛋白和16 S rRNA序列菌株來源均下載自NCBI，包括B. longum，B. breve，B. stellenboschense，B.ruminantium， B. kashiwanohense， B. bifidum， Streptococcus mutans， Mycobacterium tuberculosis， Escherichia coli， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus johnsonii。

1.2 方法 MazF蛋白和16 S rRNA序列獲取通過PSI-BLAST在NCBI中搜索，獲得雙歧桿菌染色體編碼的MazF；通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）下載其他菌屬染色體編碼的6個(gè)MazF序列；而16 S rRNA序列下載自NCBI核酸數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分別應(yīng)用Clustal X2和MEGA4軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 雙歧桿菌染色體編碼MazF情況 共搜索到雙歧桿菌染色體編碼毒素蛋白MazF 26個(gè)。其中，21個(gè)MazF編碼基因存在于B. longum、B. breve染色體上，其余位于其他5種雙歧桿菌染色體中，見表1。雙歧桿菌中MazF蛋白序列由99～129個(gè)氨基酸構(gòu)成，見圖1。

2.2 MazF分子進(jìn)化分析 通過Clustal X2對(duì)26個(gè)雙歧桿菌染色體上的MazF蛋白分子進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖1。選取來自6種雙歧桿菌的代表性MazF蛋白序列和其他菌株MazF進(jìn)化分析，并將結(jié)果與16 S rRNA分子進(jìn)化分析結(jié)果相比較見圖2。

3 討論

TA系統(tǒng)通常由處在同一個(gè)操縱子中緊密連鎖的兩個(gè)基因組成；其中一個(gè)基因編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白或RNA，另一個(gè)基因編碼相對(duì)穩(wěn)定的毒素蛋白。根據(jù)抗毒素的成分不同，通常將TA系統(tǒng)分為三類：Ⅰ類的抗毒素為反義mRNA，Ⅱ類的抗毒素基因編碼抗毒素蛋白。前者可以抑制毒素蛋白mRNA的翻譯，從而阻止毒素蛋白發(fā)揮作用；后者可以與毒素蛋白結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，達(dá)到抑制毒素的作用。而III類TA系統(tǒng)中的抗毒素雖然也是RNA，但是其抑制毒素作用的機(jī)制與Ⅱ類不同，它是通過抗毒素與毒素蛋白形成RNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)揮毒素抑制作用[22]。

MazEF是最早于大腸埃希菌基因組中發(fā)現(xiàn)的Ⅱ類TA系統(tǒng)，由處于同一操縱子、緊密連鎖的兩個(gè)基因mazE和mazF編碼。上述兩個(gè)基因均編碼小分子蛋白，其中mazE編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白，mazF編碼相對(duì)穩(wěn)定的毒素蛋白[23]。一般情況下，MazE和MazF形成蛋白復(fù)合體，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，細(xì)菌正常生長(zhǎng)。由于MazE沒有MazF穩(wěn)定，需要不斷的合成MazE維持平衡狀態(tài)，因此在某些情況下，如氨基酸饑餓、抗生素等不利刺激下，MazE被降解或合成受到抑制，其含量相對(duì)于MazF減少，從而引起細(xì)菌的死亡或生長(zhǎng)抑制[24]。研究發(fā)現(xiàn)：MazEF參與氨基酸饑餓、高溫和DNA損傷等惡劣環(huán)境下菌株的應(yīng)激調(diào)控，在細(xì)菌壓力調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[1，24]。

雙歧桿菌MazF多序列比對(duì)分析雖然發(fā)現(xiàn)了雙歧桿菌MazF的保守區(qū)域（黑色、灰色區(qū)域），然而整個(gè)雙歧桿菌屬基因組上的MazF保守性不好，僅個(gè)別菌種內(nèi)的MazF具有較好的保守性，如B. breve基因組上的MazF保守性較好。進(jìn)一步分子進(jìn)化分析顯示：MazF的聚類結(jié)果與相應(yīng)菌種16 S RNA的聚類結(jié)果不一致，MazF與16 S RNA的共進(jìn)化僅在個(gè)別菌種中發(fā)現(xiàn)，如B. breve和B. longum中的MazF。上述結(jié)果提示：雙歧桿菌中的MazEF可能是通過基因的水平轉(zhuǎn)移整合入基因組中，屬于菌株的非核心基因組部分，具有較大的流動(dòng)性。上述編碼MazEF的雙歧桿菌株可能具有某些不利環(huán)境下的生存優(yōu)勢(shì)。

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（收稿日期：2014-07-28） （本文編輯：王宇）

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（收稿日期：2014-07-28） （本文編輯：王宇）