豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

王濤++陳廣仁++蔡丙嚴

摘要：從蘇北地區(qū)某疑似豬傳染性胸膜肺炎發(fā)病豬采集病料，經(jīng)細菌分離培養(yǎng)得到3株分離株，分別命名為YC01、YC02、YC03。經(jīng)形態(tài)學檢查、CAMP試驗、衛(wèi)星生長現(xiàn)象、尿素酶試驗鑒定，3株分離菌均為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。藥敏試驗顯示，3株分離菌對頭孢噻肟、氟苯尼考及由板藍根、麻黃、連翹等組成的中藥復(fù)方高度敏感。采用高敏藥物對某感染豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的商品豬場進行治療，結(jié)果表明，板藍根、麻黃、連翹等組成的中藥復(fù)方水提物口服與頭孢噻肟肌肉注射聯(lián)用對控制豬傳染性胸膜肺炎死亡有較好效果。

關(guān)鍵詞：胸膜肺炎放線桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S852.61文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0207-02

收稿日期：2013-12-30

作者簡介：王濤（1965—），男，江蘇泰州人，碩士，副教授，從事動物傳染病防治教學與科研工作。E-mail： wangt61@hotmail.com。豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumia，PCP）是由豬胸膜肺炎放線桿菌（act inobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的豬的一種接觸性呼吸道傳染病，以急性出血性纖維素性肺炎、慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征[1]。2～5月齡豬最易感，急性暴發(fā)時，有很高的發(fā)病率、死亡率，一些病豬康復(fù)后常伴有慢性肺炎，導(dǎo)致豬生長停滯且長期帶菌，從而成為其他豬的傳染源，此病給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[2]。APP是革蘭氏陰性、有莢膜的多形球桿菌，有時呈線性，無鞭毛，不運動，不形成芽孢。根據(jù)培養(yǎng)時是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，又稱V 因子），可將APP 分為生物Ⅰ型、生物Ⅱ型，生物Ⅰ型為NAD依賴株，包括血清型1～12 型、15 型，生物Ⅱ型生長不依賴NAD，但需要其他特定嘌呤或嘌呤前產(chǎn)物以輔助生長，含有2個血清型，分別為血清型13型、14型[1]。對APP的分離鑒定是確診PCP感染的重要依據(jù)，常用的方法是細菌分離、NAD依賴性、CAMP、尿素酶等生化試驗及PCR擴增[3-4]。近年來，伴隨養(yǎng)殖業(yè)集約化生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴大，APP防治困難逐漸增大。2013年5月，江蘇省鹽城市建湖縣某商品豬場300多頭4～5月齡的育肥豬出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、死前口鼻有血色泡沫等癥狀，經(jīng)診斷為豬傳染性胸膜肺炎。為了更好地控制該病，筆者在病原分離鑒定確診此病的基礎(chǔ)上進行了高敏藥物的篩選與臨床防治試驗。

1材料與方法

1.1材料

TSA、TSB瓊脂、NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）均購于江蘇省揚州市廣陵區(qū)全球通實驗用品銷售中心，按照說明書進行配制。犢牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司；中藥麻黃、黃芩、連翹、板藍根等購自江蘇省泰州市中藥材市場；常規(guī)培養(yǎng)基、生化試劑、藥敏紙片（氟苯尼考、強力霉素、麻黃、黃芩、連翹、板藍根及其復(fù)方藥敏紙片等均為自制）購于杭州天和微生物試劑有限公司；金黃色葡萄球菌由筆者所在實驗室保存；待檢病料來源于蘇北某規(guī)模豬場疑似胸膜肺炎的發(fā)病豬；試驗豬場為建湖縣某商品豬場，存欄1 153頭。

1.2方法

1.2.1細菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察無菌取死亡豬的氣管分泌物、肺臟作觸片，革蘭氏染色，鏡檢。同時取病料接種于含0.04% NAD的TSA瓊脂平板，在需氧及5%～10% CO2條件下37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落涂片，鏡檢。純培養(yǎng)后，-70 ℃下用50%甘油生理鹽水保存?zhèn)溆肹3]。

1.2.2CAMP試驗用金黃色葡萄球菌在兔血瓊脂平板上劃1條直線，再用分離菌劃與該線垂直但不相接觸的2條線，37 ℃ 培養(yǎng)24～36 h，觀察試驗結(jié)果。

1.2.3衛(wèi)星現(xiàn)象取分離菌均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基上，再在培養(yǎng)基中央作2條金黃色葡萄球菌平行劃線，37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況。

1.2.4尿素酶試驗取培養(yǎng)24 h的分離菌株接種于含002% NAD的尿素酶液體培養(yǎng)基中，搖勻，37 ℃培養(yǎng)10、60、120 min，分別觀察結(jié)果。

1.2.5藥敏試驗分離菌株檢測其對頭孢噻肟、氟苯尼考、恩諾沙星、強力霉素、復(fù)方新諾明、丁胺卡那霉素、紅霉素、阿莫西林等8種抗生素與麻黃、黃芩、連翹、板藍根等4種中藥及復(fù)方1（板藍根、黃芩、金銀花等）、復(fù)方2（板藍根、麻黃、連翹等）、復(fù)方3（麻黃、蒲公英、連翹等）水提物的敏感性。4種中藥、3種復(fù)方按傳統(tǒng)水煎法進行煎煮，真空抽濾并濃縮，最后濃縮為1 g/mL生藥，-20 ℃ 保存。濾紙打孔直徑為6 mm的紙片，121 ℃高壓滅菌，將紙片放入藥液里浸2 h，37 ℃烘干，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將培養(yǎng)好的菌液（濃度稀釋至1.5 億CFU/mL）均勻涂布在TSA瓊脂上，然后將藥敏紙片貼在平皿上，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，并按抗菌藥物藥敏試驗判定標準判定分離菌株對不同抗生素的敏感程度[5]。

1.2.6高敏藥物對豬傳染性胸膜肺炎的防治試驗蘇北某豬場自然發(fā)病三元雜交育肥豬發(fā)病后經(jīng)臨床診斷、實驗室診斷確診為傳染性胸膜肺炎。選擇120頭日齡110～135 d、體質(zhì)量70～80 kg、出生后均未接種過胸膜肺炎放線桿菌疫苗的三元雜交育肥豬，試驗前常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，隨機分成6組： Ⅰ組氟苯尼考肌肉注射、Ⅱ組頭孢噻肟肌肉注射、Ⅲ組中藥復(fù)方2口服、Ⅳ組中藥復(fù)方2口服+頭孢噻肟肌肉注射、Ⅴ組感染對照、Ⅵ組空白對照，每組20頭。除空白對照組外，其余每組每天給藥，每次用藥前測量直腸溫度并觀察臨床癥狀，試驗前后對每頭豬進行稱重，總療程均為5 d。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定結(jié)果

病料觸片以及分離純化菌革蘭氏染色、鏡檢都可見有革蘭氏陰性、多形態(tài)的細菌，多為球桿菌、短桿菌，偶有成絲狀的細菌，著色不均。在加入0.04%NAD的TSA固體培養(yǎng)基上初次分離培養(yǎng)24 h，可見1～2 mm、露珠狀、半透明的菌落，共獲得3株分離菌。3株分離菌在靠近溶血性金黃色葡萄球菌的地方出現(xiàn)明顯的溶血區(qū)域，即CAMP試驗陽性。3株分離菌離金黃色葡萄球菌越近，菌落越大、越多；反之菌落越小、越少，證明3株分離菌為依賴NAD生長的細菌。3株分離菌均可水解尿素酶，液體培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色，菌株生長需要NAD，3株分離菌株為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。

2.2豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的藥敏試驗結(jié)果

由表1可知，3株分離菌對頭孢噻肟、氟苯尼考、中藥復(fù)方2高度敏感，對恩諾沙星、強力霉素、復(fù)方新諾明、板藍根、連翹、中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方3中度敏感，對阿莫西林、丁胺卡那霉素、紅霉素、麻黃、黃芩不敏感。

表13株分離菌的藥敏試驗結(jié)果

藥物名稱抑菌圈直徑（mm）YC01YC02YC03頭孢噻肟202022氟苯尼考182017恩諾沙星171314強力霉素13911復(fù)方新諾明11710阿莫西林735丁胺卡那霉素8710紅霉素535板藍根111415連翹121313麻黃10810黃芩577中藥復(fù)方1151312中藥復(fù)方2181918中藥復(fù)方3111614

2.3高敏藥物對豬傳染性胸膜肺炎的治療試驗結(jié)果

由表2可知，Ⅰ～Ⅳ組給藥后，與感染對照組比較，臨床癥狀明顯減輕，一般給藥3 次左右，大多數(shù)豬的體溫、食欲基本恢復(fù)正常。中藥復(fù)方2口服+頭孢噻肟肌肉注射組有效率達100%，治愈率達92.78%，相對增重率達78.82%，且沒有死亡豬。氟苯尼考注射組、頭孢噻肟注射組、中藥復(fù)方2口服組均有死亡豬，死亡率分別為30.57%、23.55%、378%?？梢?，中藥與抗生素聯(lián)用對控制豬傳染性胸膜肺炎死亡效果較好。表2高敏藥物對豬傳染性胸膜肺炎的治療試驗結(jié)果

組別試驗數(shù)

3結(jié)論與討論

胸膜肺炎放線桿菌營養(yǎng)要求高且受外界影響較大[6]。在分離過程中，最好在病死豬剛死亡或瀕臨死亡時采集病料，否則，即使病料中有APP感染，也會因死亡時間太長，致使病料中APP死亡[7]。初次分離培養(yǎng)基中要加入NAD，胸膜肺炎放線桿菌在常規(guī)培養(yǎng)基中大多不生長或生長不良。本研究選擇加入NAD的TSA瓊脂培養(yǎng)基，成功分離到3株APP，分別命名為YC01、YC02、YC03?？股貫E用是困擾獸醫(yī)臨床治療豬病的難題，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)臨床合理用藥是比較科學的方法[5]。豬胸膜肺炎放線桿菌對頭孢噻呋、地米考星、氟甲砜霉素等敏感。本研究表明，3株分離菌對頭孢噻肟、氟苯尼考及由板藍根、麻黃、連翹等組成的中藥復(fù)方高度敏感。中西藥聯(lián)用控制豬傳染性胸膜肺炎效果較好[8]。在發(fā)病豬群的飲用水中按 20 mL/50 kg 添加中藥復(fù)方2水煎劑，2次/d，連續(xù)添加5 d，同時肌注頭孢噻肟15～30 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射 3 d，即可控制該病。

參考文獻：

[1]唐文山，李昕. 豬傳染性胸膜肺炎研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展，2008，29（2）：98-102.

[2]徐公義，王海麗，葛長城，等. 豬傳染性胸膜肺炎的診斷與治療[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（5）：106-107.

[3]劉偉，王慧，陳小軍，等. 頭孢噻呋混懸劑治療人工感染仔豬傳染性胸膜肺炎的效果觀察[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（7）：164-166.

[4]吳文學，岳永波，高光，等. 注射用阿莫西林鈉對人工感染豬胸膜肺炎的療效試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2009，45（12）：68-70.

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[6]陳麗雯，楊正梅，毛家偉，等. 豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定[J]. 動物醫(yī)學進展，2009，30（7）：17-19.

[7]蔡丙嚴，周建強，陳長春，等. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型鑒定與藥敏試驗[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2012，51（4）：780-781，784.

[8]劉秀玲. 中西藥結(jié)合治療豬傳染性胸膜炎[J]. 中獸醫(yī)學雜志，2006（2）：20-21.

2.1豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定結(jié)果

病料觸片以及分離純化菌革蘭氏染色、鏡檢都可見有革蘭氏陰性、多形態(tài)的細菌，多為球桿菌、短桿菌，偶有成絲狀的細菌，著色不均。在加入0.04%NAD的TSA固體培養(yǎng)基上初次分離培養(yǎng)24 h，可見1～2 mm、露珠狀、半透明的菌落，共獲得3株分離菌。3株分離菌在靠近溶血性金黃色葡萄球菌的地方出現(xiàn)明顯的溶血區(qū)域，即CAMP試驗陽性。3株分離菌離金黃色葡萄球菌越近，菌落越大、越多；反之菌落越小、越少，證明3株分離菌為依賴NAD生長的細菌。3株分離菌均可水解尿素酶，液體培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色，菌株生長需要NAD，3株分離菌株為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。

2.2豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的藥敏試驗結(jié)果

由表1可知，3株分離菌對頭孢噻肟、氟苯尼考、中藥復(fù)方2高度敏感，對恩諾沙星、強力霉素、復(fù)方新諾明、板藍根、連翹、中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方3中度敏感，對阿莫西林、丁胺卡那霉素、紅霉素、麻黃、黃芩不敏感。

表13株分離菌的藥敏試驗結(jié)果

藥物名稱抑菌圈直徑（mm）YC01YC02YC03頭孢噻肟202022氟苯尼考182017恩諾沙星171314強力霉素13911復(fù)方新諾明11710阿莫西林735丁胺卡那霉素8710紅霉素535板藍根111415連翹121313麻黃10810黃芩577中藥復(fù)方1151312中藥復(fù)方2181918中藥復(fù)方3111614

2.3高敏藥物對豬傳染性胸膜肺炎的治療試驗結(jié)果

由表2可知，Ⅰ～Ⅳ組給藥后，與感染對照組比較，臨床癥狀明顯減輕，一般給藥3 次左右，大多數(shù)豬的體溫、食欲基本恢復(fù)正常。中藥復(fù)方2口服+頭孢噻肟肌肉注射組有效率達100%，治愈率達92.78%，相對增重率達78.82%，且沒有死亡豬。氟苯尼考注射組、頭孢噻肟注射組、中藥復(fù)方2口服組均有死亡豬，死亡率分別為30.57%、23.55%、378%?？梢?，中藥與抗生素聯(lián)用對控制豬傳染性胸膜肺炎死亡效果較好。表2高敏藥物對豬傳染性胸膜肺炎的治療試驗結(jié)果

組別試驗數(shù)

3結(jié)論與討論

胸膜肺炎放線桿菌營養(yǎng)要求高且受外界影響較大[6]。在分離過程中，最好在病死豬剛死亡或瀕臨死亡時采集病料，否則，即使病料中有APP感染，也會因死亡時間太長，致使病料中APP死亡[7]。初次分離培養(yǎng)基中要加入NAD，胸膜肺炎放線桿菌在常規(guī)培養(yǎng)基中大多不生長或生長不良。本研究選擇加入NAD的TSA瓊脂培養(yǎng)基，成功分離到3株APP，分別命名為YC01、YC02、YC03?？股貫E用是困擾獸醫(yī)臨床治療豬病的難題，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)臨床合理用藥是比較科學的方法[5]。豬胸膜肺炎放線桿菌對頭孢噻呋、地米考星、氟甲砜霉素等敏感。本研究表明，3株分離菌對頭孢噻肟、氟苯尼考及由板藍根、麻黃、連翹等組成的中藥復(fù)方高度敏感。中西藥聯(lián)用控制豬傳染性胸膜肺炎效果較好[8]。在發(fā)病豬群的飲用水中按 20 mL/50 kg 添加中藥復(fù)方2水煎劑，2次/d，連續(xù)添加5 d，同時肌注頭孢噻肟15～30 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射 3 d，即可控制該病。

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[8]劉秀玲. 中西藥結(jié)合治療豬傳染性胸膜炎[J]. 中獸醫(yī)學雜志，2006（2）：20-21.

2.1豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定結(jié)果

病料觸片以及分離純化菌革蘭氏染色、鏡檢都可見有革蘭氏陰性、多形態(tài)的細菌，多為球桿菌、短桿菌，偶有成絲狀的細菌，著色不均。在加入0.04%NAD的TSA固體培養(yǎng)基上初次分離培養(yǎng)24 h，可見1～2 mm、露珠狀、半透明的菌落，共獲得3株分離菌。3株分離菌在靠近溶血性金黃色葡萄球菌的地方出現(xiàn)明顯的溶血區(qū)域，即CAMP試驗陽性。3株分離菌離金黃色葡萄球菌越近，菌落越大、越多；反之菌落越小、越少，證明3株分離菌為依賴NAD生長的細菌。3株分離菌均可水解尿素酶，液體培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色，菌株生長需要NAD，3株分離菌株為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。

2.2豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的藥敏試驗結(jié)果

由表1可知，3株分離菌對頭孢噻肟、氟苯尼考、中藥復(fù)方2高度敏感，對恩諾沙星、強力霉素、復(fù)方新諾明、板藍根、連翹、中藥復(fù)方1、中藥復(fù)方3中度敏感，對阿莫西林、丁胺卡那霉素、紅霉素、麻黃、黃芩不敏感。

表13株分離菌的藥敏試驗結(jié)果

藥物名稱抑菌圈直徑（mm）YC01YC02YC03頭孢噻肟202022氟苯尼考182017恩諾沙星171314強力霉素13911復(fù)方新諾明11710阿莫西林735丁胺卡那霉素8710紅霉素535板藍根111415連翹121313麻黃10810黃芩577中藥復(fù)方1151312中藥復(fù)方2181918中藥復(fù)方3111614

2.3高敏藥物對豬傳染性胸膜肺炎的治療試驗結(jié)果

由表2可知，Ⅰ～Ⅳ組給藥后，與感染對照組比較，臨床癥狀明顯減輕，一般給藥3 次左右，大多數(shù)豬的體溫、食欲基本恢復(fù)正常。中藥復(fù)方2口服+頭孢噻肟肌肉注射組有效率達100%，治愈率達92.78%，相對增重率達78.82%，且沒有死亡豬。氟苯尼考注射組、頭孢噻肟注射組、中藥復(fù)方2口服組均有死亡豬，死亡率分別為30.57%、23.55%、378%?？梢姡兴幣c抗生素聯(lián)用對控制豬傳染性胸膜肺炎死亡效果較好。表2高敏藥物對豬傳染性胸膜肺炎的治療試驗結(jié)果

組別試驗數(shù)

3結(jié)論與討論

胸膜肺炎放線桿菌營養(yǎng)要求高且受外界影響較大[6]。在分離過程中，最好在病死豬剛死亡或瀕臨死亡時采集病料，否則，即使病料中有APP感染，也會因死亡時間太長，致使病料中APP死亡[7]。初次分離培養(yǎng)基中要加入NAD，胸膜肺炎放線桿菌在常規(guī)培養(yǎng)基中大多不生長或生長不良。本研究選擇加入NAD的TSA瓊脂培養(yǎng)基，成功分離到3株APP，分別命名為YC01、YC02、YC03?？股貫E用是困擾獸醫(yī)臨床治療豬病的難題，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)臨床合理用藥是比較科學的方法[5]。豬胸膜肺炎放線桿菌對頭孢噻呋、地米考星、氟甲砜霉素等敏感。本研究表明，3株分離菌對頭孢噻肟、氟苯尼考及由板藍根、麻黃、連翹等組成的中藥復(fù)方高度敏感。中西藥聯(lián)用控制豬傳染性胸膜肺炎效果較好[8]。在發(fā)病豬群的飲用水中按 20 mL/50 kg 添加中藥復(fù)方2水煎劑，2次/d，連續(xù)添加5 d，同時肌注頭孢噻肟15～30 mg/kg，1次/d，連續(xù)注射 3 d，即可控制該病。

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