順鉑激活的低分化鼻咽癌細(xì)胞氯電流為非鈣激活氯電流*

陽(yáng)小雅， 劉 梅， 伍嘉寶， 賴周易， 汪 源，

范愛(ài)輝4， 朱林燕2， 毛建文5， 王立偉3△， 陳麗新2△

凋亡性細(xì)胞皺縮(apoptotic volume decrease，AVD)是細(xì)胞凋亡的普遍特征，在細(xì)胞凋亡早期觸發(fā)機(jī)制中起關(guān)鍵作用［1］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗癌藥順鉑(cisplatin;即順式二氨基二氯鉑，cis-diamminedichloroplatinum，cDDP)可誘導(dǎo)低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞AVD和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，氯通道阻斷劑對(duì)其具有阻抑作用。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步用膜片鉗方法觀察到順鉑在等滲環(huán)境下激活氯電流，該電流具有外向整流、對(duì)胞內(nèi)ATP具有依賴性、能被氯通道阻斷劑阻斷、陰離子通透性順序?yàn)镮－≥Br－＞Cl－＞gluconate等特性［2］，提示了順鉑可激活氯通道，該通道參與了AVD和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而，氯離子通道有電壓依賴性氯通道、配體門控性氯通道、蛋白激酶或核苷酸介導(dǎo)的氯通道、容積敏感性氯通道、鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCC)等幾種類型［3］，順鉑激活的氯通道屬于何種氯通道尚未明確。研究表明，容積敏感性氯通道和CaCC激活后擁有部分與順鉑激活的氯電流相似的電流特征，如外向整流特性、能被氯通道阻斷劑阻斷、相似的陰離子通透性等，且兩者皆參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控［4-6］。為進(jìn)一步明確順鉑激活的氯通道的類型，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)去除細(xì)胞內(nèi)外的Ca2+、胞外灌流鈣通道阻斷劑及改變胞外灌流液滲透壓等方法辨明順鉑激活的氯通道是否為CaCC。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞用含10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的RPMI-1640生長(zhǎng)液在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按常規(guī)方法傳代。

2 膜片鉗全細(xì)胞記錄

采用我們前文報(bào)道的方法記錄全細(xì)胞電流［7］。用EPC-7膜片鉗放大器(List Electronic)記錄單個(gè)CNE-2Z細(xì)胞的全細(xì)胞電流。充灌電極內(nèi)液后微電極尖端電阻為5～10 MΩ。電流與電壓信號(hào)用CED 1401(Cambridge，UK)數(shù)字化(采樣頻率3 kHz)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EPC軟件分析。在電壓鉗制模式下，細(xì)胞被鉗制在0 mV，以0 mV、±40 mV和±80 mV順序不斷反復(fù)循環(huán)，每一電位持續(xù)200 ms，兩電位之間間隔4 s。所有實(shí)驗(yàn)在室溫(20～24℃)中進(jìn)行。

在鈣通道阻斷劑實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)順鉑激活氯電流達(dá)到峰值并平穩(wěn)2 min后，加入鈣通道阻斷劑，觀察鈣通道阻斷劑對(duì)順鉑激活氯電流的影響。

在觀察順鉑激活氯通道的容積敏感性實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)順鉑激活氯電流達(dá)到峰值并穩(wěn)定后，換為含相同濃度順鉑的高滲灌流液，待氯電流達(dá)到最小值并平穩(wěn)，計(jì)算滲透性細(xì)胞容積縮小對(duì)順鉑激活氯電流的抑制率。計(jì)算公式為:抑制率 (%)=［(CCtrl－CIso)－(CHyper－CIso)］/(CCtrl－CIso)×100%，其中 CCtrl是加入順鉑等滲灌流液時(shí)的對(duì)照電流密度，CIso是等滲時(shí)的電流密度，CHyper是加入含順鉑高滲液后的電流密度。

3 溶液及試劑

3.1 灌流液 等滲灌流液含(mmol/L):70 NaCl，2 CaCl2，0.5 MgCl2，10 HEPES 和 140 D-mannitol。用D-mannitol調(diào)節(jié)滲透壓至300 mOsmol/L。高滲灌流液除D-mannitol為280 mmol/L外，其余成分均同等滲灌流液，其滲透壓為440 mOsmol/L。無(wú)鈣等滲灌流液在等滲灌流液基礎(chǔ)上去除CaCl2并加入2 mmol/L EGTA。灌流液用Tris液調(diào)pH至7.4。用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)(Osmomat 030)檢測(cè)溶液滲透壓。

3.2 電極內(nèi)液 電極內(nèi)液含(mmol/L):70 N-methyl-D-glucamine chloride(NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、1 EGTA、10 HEPES、140 D-mannitol和 2 ATP。Tris液調(diào)pH至7.25，滲透壓調(diào)至300 mOsmol/L。無(wú)鈣電極內(nèi)液在電極內(nèi)液的基礎(chǔ)上加入5 mmol/L EGTA，其它成分與電極內(nèi)液相同。

3.3 主要試劑 順鉑購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，使用前按需用各種灌流液稀釋。硝苯地平(nifedipine)購(gòu)自 Sigma，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天新鮮配制，用DMSO溶解配制成5 mmol/L儲(chǔ)存液，室溫避光保存;灌流前再用灌流液稀釋至1、5和10 μmol/L。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，用方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)均數(shù)差異顯著性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞外無(wú)Ca2+對(duì)順鉑激活氯電流的影響

如圖1A所示，當(dāng)細(xì)胞處于無(wú)Ca2+等滲灌流液中時(shí)，可記錄到較小且穩(wěn)定的細(xì)胞背景電流。當(dāng)灌流5 μmol/L順鉑無(wú) Ca2+等滲灌流液時(shí)，在(435.7±100.1)s時(shí)能激活一電流，該電流逐漸增大，約(1 175.6±221.5)s達(dá)到峰值，內(nèi)向和外向電流在 ±80 mV鉗制下平均密度約為(－72.0±14.1)pA/pF和(93.1 ±14.5)pA/pF(P ＜0.01)，見(jiàn)圖1B、D、E。當(dāng)電流達(dá)到峰值并穩(wěn)定后，灌流液換成5 μmol/L順鉑含Ca2+等滲灌流液，電流出現(xiàn)小幅度上升，達(dá)到平臺(tái)期時(shí)電流大小為(－86.5±15.2)pA/pF(－80 mV)和(117.6 ±14.1)pA/pF(+80 mV)，但與無(wú) Ca2+時(shí)激活的電流相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖1C、E。

Figure 1.Effects of extracellular calcium depletion on the activation of cDDP-activated Cl－ currents in CNE-2Z cells.A:traces of background currents recorded in the Ca2+free isotonic solution;B:currents recorded in the Ca2+-free cDDP solution;C:a typical time course of the currents induced by cDDP in the absence or presence of extracellular Ca2+;D:currents recorded in the cDDP solution;E:the current-voltage relationships of the cDDP-activated currents in the absence or presence of extracellular Ca2+.Iso(Ca2+-free):Ca2+-free isotonic condition;cDDP(Ca2+-free):Ca2+-free cDDP solution challenge;cDDP:cDDP solution challenge.Mean ± SEM.n=9.＊＊P ＜0.01 vs Iso(Ca2+-free)group.圖1 細(xì)胞外無(wú)Ca2+對(duì)順鉑激活的CNE-2Z細(xì)胞電流的影響

上述結(jié)果顯示，順鉑在細(xì)胞外有Ca2+與無(wú)Ca2+條件下均可激活氯電流，且電流大小無(wú)明顯差別，證實(shí)順鉑激活氯電流不依賴于細(xì)胞外Ca2+。然而，順鉑在細(xì)胞外無(wú)Ca2+時(shí)激活氯電流的潛伏期比細(xì)胞外有Ca2+時(shí)延長(zhǎng)(P＜0.01)，達(dá)峰時(shí)間也增加(P＜0.05)，見(jiàn)表1，提示Ca2+在順鉑激活氯電流過(guò)程中可能通過(guò)某種途徑起調(diào)節(jié)作用。

表1 順鉑在細(xì)胞外無(wú)Ca2+與正常狀態(tài)下激活氯電流的潛伏期及達(dá)峰時(shí)間Table 1.Latency and peak time of cDDP-activated chloride currents in the absence or presence of extracellular Ca2+(Mean±SD.n=9)

2 細(xì)胞內(nèi)無(wú)Ca2+和細(xì)胞內(nèi)外均無(wú)Ca2+對(duì)順鉑激活氯電流的影響

如圖2A所示，在－80 mV電壓鉗制下，內(nèi)向電流峰值的電流密度為(－85.7±30.1)pA/pF，+80 mV電壓鉗制下，外向電流的電流密度為 (93.2±28.5)pA/pF，與正常細(xì)胞內(nèi)外含Ca2+情況下激活的電流密度相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外均無(wú)Ca2+時(shí)，順鉑激活氯電流的潛伏期為(296.3 ±66.1)s，與含 Ca2+對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，達(dá)峰時(shí)間為(1 087.5 ±135.2)s，較含Ca2+對(duì)照組延長(zhǎng)(P＜0.05)。當(dāng)電流達(dá)峰并穩(wěn)定后，灌流液換成順鉑含Ca2+等滲灌流液，形成了細(xì)胞內(nèi)無(wú)Ca2+狀態(tài)，此時(shí)電流變化不明顯，如圖2B和2C所示，達(dá)到平臺(tái)期時(shí)電流大小為(－86.0±37.7)pA/pF(－80 mV)和(97.8 ±40.9)pA/pF(+80 mV)，與細(xì)胞內(nèi)外均含Ca2+的對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，順鉑激活氯電流不依賴于細(xì)胞內(nèi)的Ca2+。

Figure 2.Effects of intra/extracellular calcium depletion on the activation of cDDP-activated Cl－ currents in CNE-2Z cells.A:currents recorded in the Ca2+-free cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution;B:currents recorded in the cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution;C:the current-voltage relationships of the cDDP-activated currents under the intra/extracellular calcium depletion conditions.Iso(Ca2+-free):Ca2+-free isotonic condition;cDDP(intraand extracellular Ca2+-free):Ca2+-free cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution;cDDP(intracellular Ca2+-free):cDDP solution with 5 mmol/L EGTA in the pipette solution.Mean ± SEM.n=9.圖2 細(xì)胞內(nèi)無(wú)Ca2+、細(xì)胞內(nèi)外均無(wú)Ca2+對(duì)順鉑激活的CNE-2Z細(xì)胞電流的影響

3 鈣通道阻斷劑對(duì)順鉑激活氯電流的影響

結(jié)果顯示 1 μmol/L 和5 μmol/L nifedipine不能抑制順鉑激活的氯電流。圖3A和B分別顯示了順鉑激活的氯電流和5 μmol/L nifedipine的抑制作用瞬時(shí)圖。－80 mV電壓鉗制下，內(nèi)向電流從 (－75.0±12.4)pA/pF 略減小到(－73.0 ±13.1)pA/pF，抑制率為(4.2 ±3.9)%(P ＞0.05);+80 mV 電壓鉗制下，外向電流從 (86.9±13.3)pA/pF減小到(79.6 ± 13.9)pA/pF，抑制率為(10.8 ± 3.1)%(P＞0.05)，見(jiàn)圖 3C。增大 nifedipine 濃度至 10 μmol/L，抑制率無(wú)進(jìn)一步增大。

Figure 3.Effects of calcium channel antagonist nifedipine on the cDDP-activated Cl－ currents in CNE-2Z cells.A:traces of the currents induced by cDDP;B:current traces showing effect of nifedipine on the cDDP-activated Cl－currents;C:the currentvoltage relationships under cDDP-activated condition and extracellular nifedipine(5 μmol/L)treatment.Iso:isotonic condition;cDDP:cDDP challenge;nifedipine:nifedipine treatment after cDDP challenge.Mean ± SEM.n=7.圖3 鈣通道阻斷劑nifedipine對(duì)順鉑激活氯電流的影響

4 順鉑激活氯電流的容積敏感性

如圖4A所示，47%高滲灌流液可迅速完全抑制順鉑激活的氯電流。此抑制作用是可逆的，換回等滲灌流液可見(jiàn)氯電流恢復(fù)。圖2B和C分別顯示了順鉑激活的氯電流和高滲灌流液抑制作用的瞬時(shí)圖。在鉗制電壓為－80 mV時(shí)，47%高滲灌流液使順鉑激活的內(nèi)向電流從 (－50.0±7.7)pA/pF減小到(－8.5 ±2.5)pA/pF，抑制率為 (91.8 ±3.6)%(P＜0.01)，在鉗制電壓為+80 mV時(shí)，外向電流從(60.5 ±10.5)pA/pF 減小到(8.9 ±2.4)pA/pF，抑制率為(91.3 ±4.2)%(P ＜0.01)。47%高滲灌流液對(duì)外向電流和內(nèi)向電流的抑制率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖4D，表明順鉑激活的氯電流對(duì)容積變化敏感。

討 論

CaCC在組織中分布廣泛，在體內(nèi)多種生命活動(dòng)中扮演著重要角色，如嗅覺(jué)、味覺(jué)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)元的興奮性、腺體和上皮細(xì)胞分泌、平滑肌收縮、細(xì)胞增殖及凋亡等［4，8-9］。CaCC 激活后的電流ICl(Ca)呈現(xiàn)出外向整流特性、離子選擇性順序?yàn)?SCN－＞I－＞NO3－＞Br－＞Cl－＞F－＞gluconate、能被傳統(tǒng)的氯通道阻斷劑如tamoxifen等所阻斷等特性［10］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，抗癌藥順鉑能在數(shù)分鐘內(nèi)誘導(dǎo)低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞產(chǎn)生氯電流，該電流同樣具有外向整流、能被氯通道阻斷劑tamoxifen阻斷、陰離子通透性順序?yàn)?I－≥Br－＞Cl－＞gluconate等特征［2］，與ICl(Ca)呈現(xiàn)的部分特征相似。［Ca2+］i的升高是激活CaCC的必要條件，胞內(nèi)鈣庫(kù) Ca2+的釋放、胞外Ca2+內(nèi)流與 Na+/Ca2+交換均可使［Ca2+］i升高［8］。然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在細(xì)胞外無(wú)Ca2+或細(xì)胞內(nèi)外均無(wú)Ca2+的情況下，順鉑均能激活氯電流，該電流大小與有Ca2+存在時(shí)激活的電流大小相同，表明順鉑誘導(dǎo)的氯電流不依賴于細(xì)胞內(nèi)/外的Ca2+，提示該通道不是CaCC。另有報(bào)道顯示，鈣通道阻斷劑米拉地爾(mibefradil)［3］能有效抑制 ICl(Ca)，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CNE-2Z細(xì)胞，鈣通道阻斷劑nifedipine不能抑制順鉑激活的氯電流，進(jìn)一步說(shuō)明順鉑激活的氯通道非CaCC。

Figure 4.Effects of extracellular hypertonic condition on cDDP-activated chloride currents in CNE-2Z cells.A:the time course of the cDDP-activated currents inhibited by the hypertonic solution;B:currents recorded in the cDDP isotonic solution;C:currents recorded in the cDDP hypertonic solution;D:the current-voltage relationships of the cDDP-activated currents in the isotonic or hypertonic conditions.Iso:isotonic condition;cDDP:cDDP solution challenge;cDDP+Hyper:cDDP hypertonic solution challenge.Mean ± SEM.n=6.＊＊P ＜0.01 vs cDDP group.圖4 細(xì)胞外高滲對(duì)順鉑激活氯電流的影響

容積敏感性氯通道為最常見(jiàn)的陰離子通道，在細(xì)胞容積調(diào)節(jié)［11］、細(xì)胞遷移［12］、細(xì)胞周期［13］、細(xì)胞增殖［13-14］等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，容積敏感性氯通道通過(guò)參與AVD的發(fā)生而參與細(xì)胞凋亡［5-6，14］。容積敏感性氯電流部分的電流特征與ICl(Ca)相似，如外向整流特性、相似的陰離子通透性、均能被傳統(tǒng)的氯通道阻斷劑所阻斷等，此外，容積敏感性氯電流亦擁有自己獨(dú)特的特征，如對(duì)胞內(nèi)ATP的依賴性及對(duì)容積變化敏感［7］。我們的前期研究表明，順鉑誘導(dǎo)的氯電流擁有與容積敏感性氯電流相似的特征，為進(jìn)一步探討該電流對(duì)細(xì)胞容積改變是否敏感，我們?cè)陧樸K等滲灌流液激活氯電流的情況下給予高滲刺激，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該電流可被明顯抑制，說(shuō)明該電流具有容積敏感性，提示在CNE-2Z細(xì)胞中，順鉑激活的氯通道可能是容積激活氯通道，而非CaCC。在表皮樣腺癌KB細(xì)胞［5］及野生型人肺腺癌細(xì)胞(WT A549細(xì)胞)［6］中，順鉑也能引出與容積敏感性氯電流特征相似的電流，進(jìn)一步提示了順鉑激活的氯通道很可能是容積激活氯通道，但還需利用特異性阻斷劑以及其它手段研究證實(shí)。

Ca2+在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，盡管在細(xì)胞外無(wú)Ca2+的情況下，順鉑激活的氯電流大小與胞外有Ca2+時(shí)激活的電流大小相同，然而，其激活時(shí)間與達(dá)峰時(shí)間均延長(zhǎng)，提示了雖然氯通道的激活不依賴于Ca2+，但細(xì)胞外Ca2+在其激活過(guò)程中可能起調(diào)節(jié)作用。我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究顯示，胞外無(wú)Ca2+或加入鈣離子阻斷劑nifedipine均可延緩順鉑誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞AVD的發(fā)生［15］，提示細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流可能在觸發(fā)細(xì)胞凋亡早期AVD中對(duì)氯通道的激活起重要調(diào)節(jié)作用，但并非氯通道激活所必須的條件。細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞的途徑主要有Na+/Ca2+交換、通過(guò)鈣通道內(nèi)流入胞內(nèi)等［8］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鈣通道阻斷劑nifedipine不能抑制順鉑激活的氯電流，提示Ca2+不是通過(guò)鈣通道途徑進(jìn)入細(xì)胞而起作用。細(xì)胞外Ca2+是否通過(guò)Na+/Ca2+交換或通過(guò)其它途徑進(jìn)入細(xì)胞而調(diào)節(jié)氯通道的激活則有待進(jìn)一步探討。

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