單純高膽固醇或其合并玉米油飲食建立兔動(dòng)脈粥樣硬化模型的比較*

文 依， 周 燕， 劉 翔， 張南榮， 王紅麗， 呂保峰， 靳三慶

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)疾病，未有有效的預(yù)防和治療方法，為攻克這一難題，研究者們進(jìn)行著各種各樣的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。高脂飲食法建立AS模型是常用的建模方法，但國(guó)內(nèi)外建立AS模型的高脂飲食配方報(bào)道不一，國(guó)內(nèi)多數(shù)研究者選用膽固醇溶解于玉米油或豬油后，與普通飼料混勻配成高膽固醇合并玉米油或豬油的飼料［1-2］，國(guó)外則大多僅選擇膽固醇溶解于酒精后與普通飼料混勻配成高膽固醇飼料［3-4］。究竟2種飼料配制方法對(duì)AS模型的建立有何影響、是否必須于飼料中添加豬油或玉米油?這些問(wèn)題未見(jiàn)報(bào)道。大鼠和兔是用于建立AS模型最常用的動(dòng)物，但由于大鼠具有一定的抗動(dòng)脈粥樣硬化特性，相對(duì)較難形成AS模型。兔是草食性動(dòng)物，對(duì)高脂飲食具有高度敏感性，其脂代謝與人相似。同時(shí)有研究表明人的AS斑塊與兔的AS斑塊具有一定的相似性［5］。我們分別用上述2種方法建立了兔AS模型，以比較單純高膽固醇飼料和高膽固醇飼料合并玉米油對(duì)兔AS模型形成的異同，為AS模型的建立提供基本數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物及分組

健康雄性新西蘭兔18只，4月齡，體重2.0～2.5 kg。動(dòng)物入組前，為適應(yīng)環(huán)境變化均先給予普通飼料喂養(yǎng)(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，室溫20℃下保存)1周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物均單籠喂養(yǎng)、自由飲水，維持室內(nèi)溫度20℃，濕度50%;并以12 h∶12 h光照與黑暗交替。經(jīng)過(guò)1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為3組，每組6只，普通飼料組(C組)、單純高膽固醇飼料組(H1組)和高膽固醇玉米油飼料組(H2組)。本研究獲中山大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-2010-0901。

2 動(dòng)物飼養(yǎng)

每只動(dòng)物給予150 g/d飼料喂養(yǎng)，飲水不限，飼養(yǎng)12周，并每周測(cè)量1次體重。具體飼養(yǎng)方法如下:C組每天早晨和晚上分別給予普通飼料70和80 g喂養(yǎng)。H1組每天早晨給予含1%膽固醇飼料150 g。飼料配制方法:先用電子秤稱好相應(yīng)量的膽固醇和普通飼料待用;然后每1.5 g膽固醇配20 mL的無(wú)水乙醇，在60～70℃下溶解后立即與148.5 g普通飼料混勻;待飼料鋪開(kāi)冷卻24 h，乙醇完全揮發(fā)后使用。H2組每天早晨給予普通飼料70 g，晚上給予高膽固醇加玉米油飼料80 g(1.5 g膽固醇+9 g玉米油+69.5 g普通飼料)，這種喂養(yǎng)方法相當(dāng)于每日攝取150 g高膽固醇加玉米油飼料(1%膽固醇+6%玉米油+93%普通飼料)。高膽固醇加玉米油飼料配制方法:先用電子秤稱好相應(yīng)量的膽固醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，避光保存)、玉米油(市售的100%純度的金龍魚(yú)玉米油)及普通飼料待用;然后加熱玉米油，將膽固醇溶解于玉米油中，立即與普通飼料混勻;待飼料完全冷卻后使用。飼料每日現(xiàn)配現(xiàn)喂。

3 血脂測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前(0周)及實(shí)驗(yàn)第12周末(12周)，各組動(dòng)物禁食12 h后，自耳中動(dòng)脈取2 mL血于普通干燥管中，置于4℃、1 500×g離心15 min(臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)5810R，Eppendorf AG)，收集血清標(biāo)本。用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀(ADVIA-2400，Bayer)檢測(cè)血清高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)濃度。

4 標(biāo)本收集及保存

實(shí)驗(yàn)第12周末，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉動(dòng)物，打開(kāi)胸腔，取胸主動(dòng)脈8 cm(自主動(dòng)脈根部算起)?？v行剖開(kāi)動(dòng)脈，用生理鹽水輕輕沖洗，并在4℃、Kreb’s緩沖液中剪去血管外膜及結(jié)締組織。Kreb’s緩沖液 pH 7.4，配方如下(mmol/L):NaCl 118.3，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO324.9，Glucose 11.1，CaCl22.5。將動(dòng)脈用10%中性甲醛(廣州市艾發(fā)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)固定24 h，然后進(jìn)行脂肪染色。

5 脂肪染色

動(dòng)脈內(nèi)膜脂肪染色采用蘇丹IV染色或油紅O染色。

5.1 蘇丹IV溶液配制方法 0.1 g蘇丹IV干粉(Amresco)，溶于50 mL丙酮中，再加入70%乙醇50 mL，充分混合后使用。動(dòng)脈內(nèi)膜染色方法步驟如下:(1)PBS洗5 min;(2)70%乙醇洗3 min;(3)蘇丹IV溶液3～5 min;(4)80%乙醇洗3～5 min;(5)自來(lái)水洗1～2min。

5.2 油紅O染色方法步驟 (1)雙蒸水洗2 min;(3)60%異丙醇洗2 min;(3)0.5%油紅O溶液(Sigma)15 min;(4)60%異丙醇洗3次，每次5 min;(5)雙蒸水洗2 min。

6 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的觀察和面積的測(cè)定

動(dòng)脈染色后，輕輕將其鋪平，內(nèi)膜朝上，并用大頭針固定于白色泡沫板上，首先用肉眼觀察動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成情況，然后用數(shù)碼相機(jī)(Canon EOS550D)拍照。使用ImageJ2x軟件自動(dòng)測(cè)量并計(jì)算斑塊面積占血管內(nèi)膜面積百分比(plaque area/intimal area，PA/IA)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 16.0軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。重復(fù)測(cè)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，多組間結(jié)果的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩組間比較采用Bonferroni方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物基本情況

C組兔精神狀況良好，食欲正常。H1組兔精神狀態(tài)尚可，食欲較好。H2組兔精神狀態(tài)稍差，逐漸出現(xiàn)食欲下降。C組死亡1只，H1組無(wú)死亡，H2組死亡2只。

2 體重變化

3組動(dòng)物體重均隨飼養(yǎng)時(shí)間增加而增加，在不同時(shí)點(diǎn)各組間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重增加量比較無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Body weight gain in rabbits fed with different diets.Group C:normal diet(n=5);group H1:a diet enriched with 1%cholesterol(n=6);group H2:1%cholesterol diet containing 6%corn oil(n=4).Mean±SD.圖1 各組動(dòng)物體重增加情況

3 血脂變化情況

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前(0周)，各組間LDL-C、TC和TG基礎(chǔ)值無(wú)顯著差異(P＞0.05)，H1組HDL-C水平高于C組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)第12周末，H1組和 H2組HDL-C、LDL-C和TC水平均高于 C組(P＜0.05);H2組TG高于C組(P＜0.05)，H1組與C組間的TG無(wú)顯著差異(P＞0.05);H1組HDL-C水平低于H2組(P＜0.05)，但2組間LDL-C、TC及TG水平無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 血清HDL-C、LDL-C、TG及TC水平變化Table 1.Serum levels of HDL-C，LDL-C ，TG and TC(mmol/L.Mean±SD)

4 大體標(biāo)本觀察

C組動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，管壁較薄且柔軟;H1組及H2組動(dòng)脈內(nèi)膜可見(jiàn)大量高于內(nèi)膜的乳白色斑塊，管壁增厚并僵硬。經(jīng)過(guò)染色后，可見(jiàn)C組動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，未見(jiàn)紅染的脂質(zhì)條紋及斑塊;H1組及H2組所有兔動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙，呈現(xiàn)大量紅染的、高于內(nèi)膜的斑塊，斑塊大小不一，并見(jiàn)一些斑塊相互融合成大片，2組造模成功率均為100%，見(jiàn)圖2。

5 PA/IA結(jié)果

C 組PA/IA 為0%，H1組為(49.74±18.78)%，H2組為(56.95±26.74)%。H1組、H2組分別與C組相比，組間均有顯著差異(P＜0.05);H1組與H2組的PA/IA相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Fat-stained images of aorta intima.A:the normal aorta intima stained by Sudan IV;B:the atherosclerotic aorta intima stained by Sudan IV;C:the normal aorta intima stained by oil red O;D:the atherosclerotic aorta intima stained by oil red O.“↗”indicates plaques stained by Sudan IV or oil red O.圖2 主動(dòng)脈內(nèi)膜脂肪染色圖片

Figure 3.The percentage of plaque area in the total aortic intimal area.Mean±SD.Group C:n=5;group H1:n=6;group H2:n=4.*P ＜0.05 vs group C.圖3 斑塊面積占內(nèi)膜總面積百分比

討 論

AS是心腦血管疾病發(fā)病的重要原因［6］，AS及其并發(fā)癥可導(dǎo)致較高的死亡率，關(guān)于AS的防治仍是研究熱點(diǎn)。在AS的研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究具有重要的意義。建立良好的AS動(dòng)物模型成為探討和評(píng)價(jià)AS防治方法的有力工具。目前關(guān)于動(dòng)物AS模型的建立有多種方法，包括長(zhǎng)期高脂飲食飼養(yǎng)、基因敲除或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、損傷動(dòng)脈內(nèi)膜等［1，7-8］，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。由于高脂飲食制備AS模型更符合人類AS疾病發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)，因而被廣為使用。目前不同研究所用的高脂飲食建模飼料配方不同，如單純高膽固醇飼料、高膽固醇合并玉米油或豬油飼料等［1，3］。那么，究竟添加油類成分對(duì)于AS模型的建立是否有促進(jìn)作用呢?由于市售的豬油質(zhì)量和其成分的一致性難以保證，而玉米油的純度及質(zhì)量較為可靠，因此我們選用玉米油作為高脂物質(zhì)進(jìn)行添加。本實(shí)驗(yàn)對(duì)高膽固醇合并玉米油飼料和單純高膽固醇飼料建立的AS模型進(jìn)行比較，探究2種飼料造模的異同，為AS模型的建立提供基本數(shù)據(jù)。

脂質(zhì)代謝紊亂被認(rèn)為是AS發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)。AS斑塊主要包括含有脂質(zhì)的平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞增殖;膽固醇或膽固醇酯蓄積;膠原、彈力蛋白等結(jié)締組織基質(zhì)形成［9］。粥樣斑塊中的脂質(zhì)主要來(lái)自血脂，因此血液中TC、TG及LDL-C的增高和HDL-C的降低有助于動(dòng)脈壁斑塊的形成，并會(huì)導(dǎo)致血液流變學(xué)異常。Toshima等［10］研究表明，血液中氧化修飾的LDL-C長(zhǎng)期增高可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，而HDL-C則可抑制LDL-C對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此血脂水平是評(píng)價(jià)AS動(dòng)物模型成功建立與否的重要參考指標(biāo)。本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)12周后，H1組和H2組血清LDL-C、TC均比普通飼料組明顯增高(P＜0.05)，這與其它實(shí)驗(yàn)報(bào)道一致［11］，證實(shí)2種飼料配方均可誘導(dǎo)兔產(chǎn)生高脂血癥，其發(fā)生AS風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)增加。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物飼養(yǎng)12周時(shí)，H2組TG高于 C組(P＜0.05)，H2組 HDL-C水平高于H1組(P＜0.05)，這可能與H2組添加玉米油有關(guān)。目前關(guān)于玉米油對(duì)AS發(fā)揮的作用仍存在爭(zhēng)議，有研究表明玉米油中含有86%的不飽和脂肪酸，還有固醇、卵磷脂等成分，可抑制小腸對(duì)膽固醇的吸收，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［12］;也有研究表明玉米油高脂飲食可使血脂增高，導(dǎo)致AS病變［13］。

在AS防治的研究中，多數(shù)研究者判斷干預(yù)措施是否有效及AS病變程度主要使用AS模型的血脂變化，斑塊面積(或厚度)占內(nèi)膜總面積(或厚度)的百分比等指標(biāo)［14-16］。因此本實(shí)驗(yàn)中，判斷AS是否發(fā)生及其嚴(yán)重程度使用了PA/IA這一指標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)C組無(wú)AS斑塊形成，H1及H2組主動(dòng)脈內(nèi)壁均能見(jiàn)到AS斑塊，說(shuō)明無(wú)論是否添加玉米油的高膽固醇飲食均能建模成功。這與 Romero等［4］及 Misiacos等［2］用相似的高脂飲食造模方法研究結(jié)果一致，同時(shí)也間接證實(shí)了2種飲食建模法可靠、易重復(fù)。而H1組與H2組組間PA/IA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，飼養(yǎng)12周時(shí)2組間LDL-C、TC及TG水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明在12周的飼養(yǎng)周期條件下，與單純高膽固醇飲食相比，高膽固醇合并玉米油飲食并沒(méi)有加重AS斑塊形成的作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2組高脂飲食組動(dòng)物體重增加量并沒(méi)有低于普通飼料飲食組動(dòng)物體重增加量(P＞0.05)。這與 Ramachandran等［17］研究結(jié)果一致，而Hartvigsen等［18］研究表示高脂飲食組動(dòng)物體重增加量比普通飼料飲食組動(dòng)物體重的增加偏低。本研究發(fā)現(xiàn)自第7周開(kāi)始，H2組動(dòng)物體重增加量低于H1組，但2組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，可能由于高膽固醇合并玉米油飼料較單純高膽固醇飼料油膩，影響動(dòng)物飲食攝入，導(dǎo)致體重偏低。

本研究先后采用2種動(dòng)脈內(nèi)膜的染色方法:蘇丹IV染色和油紅O染色。蘇丹IV染料和油紅O染料均為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯、膽固醇等顯色。雖然2種染色方法使血管內(nèi)膜的染色存在色差，但由于其染色原理一樣，對(duì)AS斑塊面積計(jì)算并無(wú)影響。另外，H1組HDL-C基礎(chǔ)水平高于C組(P＜0.05)，可能是本研究樣本量偏小，個(gè)體差異較大導(dǎo)致的結(jié)果。本研究只觀察了12周，2種不同飲食法飼養(yǎng)更短或更長(zhǎng)時(shí)間對(duì)AS形成是否有差異仍待探討。粥樣斑塊的成分主要是膽固醇及膽固醇酯，Ozaki等［19］研究表明斑塊中脂質(zhì)成分含量并不隨血脂增高而平行增加，因此2種飲食法對(duì)AS斑塊組成、穩(wěn)定性及斑塊是否易脫落等病理特征是否有差異，有待于進(jìn)一步研究。

雖然2種飲食法均能成功建立AS模型，造模成功率均為100%，但與單純高膽固醇飼料配方相比，高膽固醇合并玉米油的制作方法復(fù)雜，花費(fèi)成本較高，且玉米油與AS的關(guān)系尚不明確。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)還發(fā)現(xiàn)添加玉米油的飼料較油膩，減少兔飲食攝入，不利于高脂飲食兔的長(zhǎng)期飼養(yǎng);這也是我們?cè)贖2組動(dòng)物的飼養(yǎng)時(shí)將所有高脂飲食(含有1天量的膽固醇和玉米油)放在晚上，而早上使用正常飼料的原因，我們發(fā)現(xiàn)這樣基本上可以保證兔高脂飲食的攝入。

綜上所述，我們認(rèn)為在12周的飼養(yǎng)周期內(nèi)，單純高膽固醇飲食建立兔AS模型更加方便可靠。

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