正交試驗法優(yōu)選土家藥夜關(guān)門中D-松醇提取工藝

郜紅利，張 方

(1.湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，湖北恩施 445000;2.恩施自治州優(yōu)撫醫(yī)院，湖北恩施 445000)

夜關(guān)門為豆科植物截葉鐵掃帚Lespedeza cuneata(Dum.Cours.)G.Don的全草，以其白天葉子迎陽張開，傍晚自然合攏，故而在土家族稱為“夜關(guān)門”［1］。夜關(guān)門作為土家苗藥的珍貴藥材，其性微溫，味辛微苦，具有散瘀消腫，補肝益肺，安神之功效，可用于治療遺精、哮喘、跌打損傷、失眠等［2-7］?，F(xiàn)代研究表明，夜關(guān)門中含有黃酮類化合物、D-松醇、木質(zhì)素、松腦、酚性成分、鞣質(zhì)、含羞草堿和含羞草苷等［8］。

D-松醇 (右旋肌醇甲醚)，又名“咳寧醇”，該化合物具有類似于胰島素的作用，用于治療由胰島素耐藥性引起的相關(guān)疾病［9］。D-松醇還能夠增強肌肉組織的功能，增加肌肉中糖元的形成，刺激肌肉組織中葡萄糖的運輸，且具有止咳、祛痰作用及典型的抗炎活性和抗急性水腫作用［10-11］。D-松醇還可以促進(jìn)人體對肌酸的吸收，因此，近年來本品被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥原料和保健品添加劑。

本項目擬采用乙醇溶液提取，通過正交試驗設(shè)計，考察提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶劑用量對土家苗藥夜關(guān)門中D-松醇的影響，確定最佳提取工藝條件，為民族藥夜關(guān)門的開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

BP211D電子天平 (d=0.01 mg，德國賽多利斯);Waters 515液相色譜儀及Waters 2420蒸發(fā)光散射檢測器(美國Waters公司);N3000色譜工作站 (浙江大學(xué));恒溫水浴鍋 (精科華瑞);RE-51旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海榮亞生化儀器廠)。

夜關(guān)門采集于湖北省恩施州利川市佛寶山森林自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)朱敏英副教授鑒定為豆科植物夜關(guān)門全草;D-松醇對照品 (上海索萊寶生物科技有限公司，批號:10284-63-6);乙腈 (色譜純，美國默克公司);蒸餾水;其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 D-松醇定量測定方法建立

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 供試液的制備 取夜關(guān)門全草，粉碎過80目篩，于鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重。稱取夜關(guān)門粉末10 g，加150 mL 95%乙醇溶液于80℃回流提取3次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮干后用乙醇溶解并定容至100 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的D-松醇對照品20.02 mg，置于5 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得對照品溶液。

2.1.1.3 陰性對照溶液制備 取溶解對照品的乙醇，過0.45 μm微孔濾膜，即得陰性對照品溶液。

2.1.2 色譜條件［12］Cosmosil Sugar-D色譜柱 (4.6 mm×250 mm);流動相為乙腈-水 (80∶20，V∶V)，體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;Waters 2420蒸發(fā)光散射檢測器檢測，氣壓25 kPa;載氣N2，漂移管溫度設(shè)定為55℃;噴霧器級別為60%;增益值100。在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，D-松醇峰形良好，與雜質(zhì)能較好的實現(xiàn)分離 (分離度＞1.5)，陰性無干擾。

圖1 夜關(guān)門液相色譜圖

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 精密吸取2.002 mg/mL的對照品溶液，分別加乙醇溶解定容至 0.04、0.1001、0.2002、0.4004、1.001、2.002 mg/mL。按 “2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣，每個質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得線性方程為Y=32624.7682C+1163.4425，r=0.9998，表明D-松醇在0.04～2.002 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 單因素實驗 以D-松醇量為指標(biāo)，考察提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶劑用量對提取工藝的影響。

2.2.1.1 提取溫度 精密稱取3 g夜關(guān)門粉末5份，加水30 mL，分別于40、60、70、80、100℃下浸提3次，每次1 h后過濾，將濾液轉(zhuǎn)入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇，結(jié)果顯示，60、70、80和100℃時量均較高，故選用70、80、100℃作為正交試驗水平。

2.2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取3 g夜關(guān)門粉末5份，分別加入0%、25%、50%、75%、95%的乙醇溶液30 mL，60℃下浸提3次，每次1 h后過濾，將濾液轉(zhuǎn)入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇量。結(jié)果顯示，D-松醇量隨著提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，故選用50%、75%、95%作為正交試驗水平;

2.2.1.3 提取時間 精密稱取3 g夜關(guān)門粉末5份，分別加入30 mL水，60℃下浸提3次，每次30、60、90、120、150 min后過濾，將濾液轉(zhuǎn)入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇。結(jié)果顯示，D-松醇隨著提取時間的變化不明顯，從成本考慮，故選用30、60、90 min作為正交試驗水平;

2.2.1.4 溶劑用量 精密稱取3 g夜關(guān)門粉末5份，分別按料液比1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20加入50%乙醇溶液，60℃下浸提3次，每次1 h后過濾，將濾液轉(zhuǎn)入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇。結(jié)果顯示，D-松醇量隨著提取溶劑用量的增大而增大，提取越完全。綜合成本考慮，故選用料液比1∶5、1∶10、1∶15作為正交試驗水平。

2.2.2 正交試驗優(yōu)選提取工藝 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以D-松醇量為指標(biāo)，考察提取時間 (A)、溶劑用量 (B)、提取溫度(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù) (D)對提取工藝的影響。提取方法為精密稱取夜關(guān)門粉末10 g，按照L9(34)正交試驗設(shè)計，藥液減壓濃縮至干，加乙醇定容至100 mL，測定其中D-松醇。正交試驗因素水平表見表1，結(jié)果和方差分析見表2、表3。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

2.2.3 正交試驗結(jié)果分析 由表2和表3可以看出，極差大小顯示各因素主次順序為D＞B＞C＞A，最佳提取條件為A1B3C2D3，以A因素為誤差項的方差分析結(jié)果表明，提取溶劑中乙醇的體積分?jǐn)?shù)和提取溶劑的用量對夜關(guān)門中D-松醇的提取效果有顯著意義 (P＜0.05)，提取溫度和提取時間對夜關(guān)門中D-松醇的提取效果無顯著性意義 (P＞0.05)?？紤]各因素影響主次，結(jié)合效能和生產(chǎn)成本，最終確定最佳工藝條件為A1B3C2D3，即加15倍量95%乙醇，80℃下回流提取3次，每次30 min。

2.3 優(yōu)選工藝驗證試驗 精密稱取約10 g干燥至恒重的夜關(guān)門粉末5份，加150 mL 95%乙醇，回流提取3次，每次30 min。合并提取液，減壓濃縮干，以95%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣，每個樣品進(jìn)樣3針，以平均峰面積計算D-松醇。結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果

結(jié)果表明，該提取工藝與正交試驗結(jié)果基本一致，該工藝合理可行，穩(wěn)定性較好。

3 討論及結(jié)論

3.1 預(yù)實驗考察了藥材粉碎粒度對提取工藝的影響，實驗結(jié)果是粒度小于80目內(nèi)對D-松醇提取率的影響不大，呈現(xiàn)持平的趨勢。

3.2 實驗從是否采用浸泡以及浸泡時間的長短對提取率進(jìn)行比較，取5份夜關(guān)門樣品，1份不采取浸泡直接提取，另4份置于室溫下加15倍量水浸泡，浸泡時間分別為0.5 h、1 h、2 h、4 h后進(jìn)行提取，后進(jìn)行測定。得知提取到的D-松醇量比不浸泡的相差不大，故本實驗選取最佳提取工藝采用不浸泡。

3.3 基于D-松醇具有重要的應(yīng)用價值，以及目前的提取工藝所存在的弊端，本實驗以D-松醇為指標(biāo)，通過L9(34)正交試驗，確定了夜關(guān)門中D-松醇的最佳乙醇回流提取工藝，即加15倍量95%乙醇，80℃下回流提取3次，每次30 min。結(jié)果顯示，此提取工藝穩(wěn)定、可重復(fù)性高，流程簡單，操作性強，監(jiān)測手段也常用，能夠用來進(jìn)行研究D-松醇提取工藝，優(yōu)化D-松醇的質(zhì)量控制。這一關(guān)鍵技術(shù)性提取工藝，為今后充分利用夜關(guān)門資源以及進(jìn)一步開發(fā)夜關(guān)門制品提供了理論依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實意義。

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