復(fù)方靈丹膠囊抗肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究

王化宇，?？∑妫瑥垷橃?，金清龍*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130117;2.吉林大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130000)

肝纖維化 (Hepatic fibrosis)是由于肝炎病毒、酒精、藥物、毒物、血吸蟲(chóng)等多種損傷因素長(zhǎng)期刺激肝臟造成的一種常見(jiàn)慢性肝臟疾病，往往是導(dǎo)致肝硬化或肝癌發(fā)生的重要始動(dòng)因素［1-2］。肝纖維化是一個(gè)可預(yù)防、可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，一旦發(fā)展成為肝硬化，完全康復(fù)的可能性將會(huì)非常渺茫［3］。因此防治肝損傷和肝纖維化是臨床肝病治療的重要環(huán)節(jié)之一。

復(fù)方靈丹膠囊為吉林大學(xué)第一醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由丹參、靈芝等藥材組成，具有扶正補(bǔ)虛、活血化瘀、清利濕熱之功效，主治正虛血瘀兼濕熱證所致的病毒性肝炎、肝纖維化等癥。本研究采用CCl4和高脂飼料復(fù)合誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，對(duì)復(fù)方靈丹膠囊抗肝纖維化作用進(jìn)行研究，并初步探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品和試劑 復(fù)方靈丹膠囊 (由吉林大學(xué)第一醫(yī)院提供);透明質(zhì)酸 (HA，20101005)，Ⅳ型膠原蛋白試劑盒(Ⅳ-C，20101005)，層粘連蛋白試劑盒 (LN，20111125)，超氧化物歧化酶試劑盒 (SOD，20110806)，丙二醛(MDA，20110806)，一氧化氮合酶 (NOS，20110806)，以上均購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;水合氯醛 (河北高碑店市春光試劑廠(chǎng));肝素鈉注射液 (徐州萬(wàn)邦生化制藥有限公司)。

1.2 儀器 JA5103N電子分析天平 (上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)、DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司);E53042432移液器 (日本NICHIRTYO);IKAT10勻漿機(jī) (德國(guó));BIO-RAD酶標(biāo)儀 (美國(guó));WFH-203J三用紫外可見(jiàn)分析儀 (上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，清潔級(jí)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料均購(gòu)于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):2010-0005。

2 方法

2.1 復(fù)方靈丹膠囊的制備及用法 取處方量丹參和山豆根，加10倍量70%的乙醇浸泡30 min，加熱回流提取三次，每次30 min，濾過(guò)，濾液合并，50℃下回收乙醇至無(wú)醇味;藥渣與處方中其余藥材混合，加10倍量水煎煮3次，每次30 min，濾過(guò)，濾液合并，濃縮，與醇提濃縮液混合，干燥至恒定質(zhì)量，粉碎，加入處方量葫蘆素混合均勻，加入3%滑石粉，用干法制粒，裝膠囊，即得。

成人1日3次，一次3～5粒，按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［4］中方法換算成大鼠給藥量，則高劑量組給藥劑量為0.5 g(內(nèi)容物)/kg(體質(zhì)量)，低劑量給藥組給藥劑量為0.25 g/kg。

2.2 肝纖維化模型的建立［5-6］從Wistar大鼠中隨機(jī)取出12只，雌雄各半，作為空白組，其余大鼠均以用84.5%玉米面加15%豬油和0.5%膽固醇制成的高脂飼料飼養(yǎng)，以30%白酒代替飲用水，同時(shí)皮下注射40%CCl4色拉油溶液，首次注射量為0.5 mL/100 g，之后每次注射量為0.3 mL/100 g，每隔3 d注射1次;空白組以正常飼料和自來(lái)水飼養(yǎng)，注射等量的色拉油，連續(xù)造模5周。

2.3 分組及給藥 飼養(yǎng)五周后，將造模組存活下來(lái)的大鼠隨機(jī)分成3組，分別為模型組、高劑量給藥組和低劑量給藥組，各組大鼠繼續(xù)按上述方法飼養(yǎng)，同時(shí)高、低劑量給藥組以復(fù)方靈丹膠囊混懸液灌胃，給藥劑量分別為0.5g(內(nèi)容物)/kg(體質(zhì)量)和0.25 g/kg，空白對(duì)照組和模型組以等量生理鹽水灌胃，每日給藥，連續(xù)4周。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定

2.4.1 肝功能的檢測(cè)［7-8］末次給藥24 h后，腹腔注射10%水合三氯乙醛 (0.3 mL/kg)將大鼠麻醉，仰位固定，采用腹主動(dòng)脈取血，血液放置30 min，以4000 r/min離心，取血清100 μL置于EP管中，對(duì)肝功能指標(biāo)測(cè)定。

2.4.2 肝纖維化指標(biāo)的檢測(cè)［9-10］采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)，按各試劑盒操作說(shuō)明書(shū)中步驟進(jìn)行試驗(yàn)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定血清中透明質(zhì)酸 (HA)，Ⅳ型膠原蛋白 (Ⅳ-C)和層粘連蛋白 (LN)的水平。

2.4.3 抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) 取大鼠部分肝部組織，精密稱(chēng)定，按質(zhì)量體積比1∶3比例加入生理鹽水，勻漿，以3600 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，采用ELASA法測(cè)定肝組織中丙二醛 (MDA)的水平及超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮合酶 (NOS)的活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝臟表征觀察 空白組大鼠肝臟為暗紅色，表面光滑并有光澤，質(zhì)軟，邊緣銳利;模型組大鼠肝臟為淺黃色，表面粗糙并失去正常光澤，質(zhì)地變硬，邊緣鈍圓，部分大鼠肝臟明顯腫大;低劑量給藥組大鼠肝臟表面淡紅色，與模型組相比表面光滑，色澤得到一定恢復(fù)，質(zhì)地變軟，邊緣變薄，但沒(méi)有恢復(fù)到空白組大鼠肝臟的狀態(tài);高劑量給藥組大鼠肝臟與模型組相比表征得到明顯恢復(fù)，部分大鼠肝臟基本恢復(fù)到正常狀態(tài)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝臟表征觀察結(jié)果

3.2 肝功能檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠的堿性磷酸酶 (ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、谷氨酸轉(zhuǎn)移酶 (GGT)、總膽紅素 (TBIL)、直接膽紅素 (DBIL)、間接膽紅素(IBIL)的活性均極顯著增高 (P＜0.001)，白蛋白 (ALB)的活性顯著下降 (P＜0.01)，膽堿酯酶 (CHE)的活性極顯著下降 (P＜0.01);與模型組相比，各給藥組大鼠的ALP、ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL、IBIL的水平 (或活性)均極顯著降低 (P＜0.001)，ALB的水平顯著升高(P＜0.01)，CHE的活性極顯著下降 (P＜0.001)，并且高劑量給藥組各項(xiàng)指標(biāo)與低劑量給藥組相比也具有極顯著性差異 (P＜0.001或P＜0.01)，部分指標(biāo)基本恢復(fù)正常。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血清肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 ()

表1 血清肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 ()

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001;與空白組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01，ΔΔΔP ＜0.001;與低劑量給藥組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001。下同

組 別 動(dòng)物數(shù)/只 ALP/(U·L－1) ALT/(U·L－1) AST/(U·L－1) GGT/(U·L－1)空白組 12 148.4±34.7 63.9±12.5 131.1±19.7 0.22±0.44模型組 8 783.2±148ΔΔΔ 469.1±129.2ΔΔΔ 699.8±25.5ΔΔΔ 11.20 ±2.56ΔΔΔ低劑量組 10 287.3 ±51.5＊＊＊ 141.3 ±33.0＊＊＊ 345.5 ±33.0＊＊＊ 1.25 ±0.5＊＊＊高劑量組 10 149.7 ±40.1＊＊＊## 84.4 ±21.1＊＊＊## 143.0 ±16.7＊＊＊## 0.33 ± 0.5＊＊＊###組 別 CHE/(U·L－1) DBIL/(μmol·L－1) IBIL/(μmol·L－1) TBIL/(μmol·L－1) ALB/(g·L－1)533±127 0.58±0.2 1.6±0.2 1.4±0.2 31.4±2.98模型組 182±49ΔΔΔ 13.90 ±2.9ΔΔΔ 6.9±1.8ΔΔΔ 18.4±4.0ΔΔΔ 23.7 ±2.60ΔΔ低劑量組 367 ±71＊＊＊ 1.90 ±0.2＊＊＊ 3.5 ±0.3＊＊＊ 3.6 ±0.2＊＊＊ 31.1 ±1.01＊＊高劑量組 468 ±32＊＊＊## 0.70 ±0.1＊＊＊### 1.5 ±0.3＊＊＊### 1.4 ±0.3＊＊＊### 31.5 ±1.82空白組＊＊

3.3 肝纖維化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠血清中層粘連蛋白 (LN)、Ⅳ型膠原蛋白(Ⅳ-C)和透明質(zhì)酸 (HA)的水平極顯著增高 (P＜0.001);與模型組大鼠相比，低劑量給藥組大鼠血清中LN的水平顯著降低 (P＜0.05)，HA和Ⅳ-C的水平極顯著降低 (P＜0.01)，高劑量給藥組大鼠血清中LN、HA和Ⅳ-C的水平均極顯著降低 (P＜0.001)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 ()

表2 肝纖維化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 ()

組 別 動(dòng)物數(shù)/只 LN/(μg·L－1) HA/(ng·L－1) Ⅳ-C/(μg·L－1)12 131.68 ±33.21 122.21 ±28.16 89.28 ±18.24模型組 8 485.23±111.69ΔΔΔ 500.31±121.05ΔΔΔ 293.67±48.16ΔΔΔ低劑量組 10 327.99±102.41* 245.61±67.61＊＊ 199.5 ±58.49＊＊高劑量組 10 166.92 ±38.46＊＊＊## 133.89 ±34.61＊＊＊# 109.70 ±16.7＊＊＊#空白組

3.4 抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果表明，與空白組相比，模型組大鼠肝臟組織內(nèi)丙二醛 (MDA)的水平和一氧化氮合酶 (NOS)的活性極顯著增高，超氧化物歧化酶 (SOD)的活性極顯著降低 (P＜0.001);與模型組相比，低劑量給藥組大鼠肝臟組織中MDA的水平和NOS的活性顯著下降(P＜0.05)，SOD的活性極顯著提高 (P＜0.01)，高劑量給藥組大鼠肝臟組織中MDA的水平和NOS的活性極顯著下降，SOD的活性極顯著提高 (P＜0.001)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 ()

表3 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 ()

組 別 動(dòng)物數(shù)/只 MDA/(nmol·mL－1) SOD/(U·mL－1) NOS/(U·mL－1)12 1.95±0.38 98.89±12.17 9.35±1.19模型組 8 5.01±1.48ΔΔΔ 25.34± 4.89ΔΔΔ 28.99±7.21ΔΔΔ低劑量組 10 4.13±0.98* 46.56±10.57＊＊ 20.97±4.81*高劑量組 10 2.23 ±40＊＊＊## 70.33 ±19.71＊＊＊# 13.37 ±3.29＊＊＊#空白組

4 討論

根據(jù)文獻(xiàn)資料及前期實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，在造模過(guò)程中會(huì)有一部分大鼠死亡，所以本實(shí)驗(yàn)在操作過(guò)程中先造模再分組，以避免分組后造模的過(guò)程中某一組大鼠死亡過(guò)多，失去統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

ALP、AST、ALB等均為檢測(cè)肝功能常用指標(biāo)，其數(shù)值的大小可以直接反應(yīng)出機(jī)體肝功能是否正常［11］，例如ALB是肝細(xì)胞特異分泌的功能性蛋白，當(dāng)肝功能障礙時(shí)，肝臟合成總蛋白 (TP)減少，主要以白蛋白的下降最為明顯;血清ALB能反映肝臟合成功能及其貯備能力［12］。試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠ALP、AST、ALB等指標(biāo)與空白組大鼠比較出現(xiàn)明顯異常，證明此時(shí)大鼠的肝功能已經(jīng)嚴(yán)重受損;給藥后，大鼠各指標(biāo)得到顯著恢復(fù)，其中高劑量給藥組大鼠部分指標(biāo)已恢復(fù)到正常值，證明復(fù)方靈丹膠囊具有抗肝纖維化作用。

LN是細(xì)胞外間質(zhì)中非膠糖蛋白的成分，當(dāng)肝臟發(fā)生慢性炎癥損傷時(shí)肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞均參與合成LN，并在肝竇內(nèi)大量累積［13］;HA是一種糖胺多糖，由間質(zhì)細(xì)胞合成、分泌，肝臟受損時(shí)由于合成增多，肝臟代謝能力下降，血清HA水平增高。HA是反映肝纖維化最具價(jià)值的血清學(xué)標(biāo)志物［14］;肝組織中Ⅳ-C的水平與肝纖維化程度成正比，觀察Ⅳ-C的水平變化可以觀察到肝纖維化病情的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠血清中LN、HA、Ⅳ-C的水平均顯著升高，表明其肝纖維化程度比較嚴(yán)重;給藥后，各給藥組大鼠血清中的LN、HA、Ⅳ-C的水平與模型組大鼠比較有顯著下降，表明復(fù)方靈丹膠囊可以干預(yù)LN、HA、Ⅳ-C的合成，使其在血清中的水平降低以減少其在肝臟中的過(guò)度沉淀，達(dá)到抗纖維化的作用。

SOD為抗氧化酶，可以清除體內(nèi)的氧化自由基;NOS為氧化酶，可以促進(jìn)體內(nèi)NO的合成;MDA為氧自由基和生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，可誘發(fā)細(xì)胞損傷［15-16］。以上三種物質(zhì)均為公認(rèn)的、常用的氧化指標(biāo)。試驗(yàn)中模型組大鼠肝組織內(nèi)NOS的活性顯著升高，這與前期試驗(yàn)中模型組大鼠肝組織內(nèi)NO的水平顯著升高相對(duì)應(yīng);SOD的活性顯著下降，同時(shí)MDA的水平顯著升高，證明模型組大鼠肝臟氧化損傷嚴(yán)重。給藥組大鼠與模型組大鼠比較，肝組織內(nèi)MDA水平和NOS活性顯著降低，SOD活性顯著升高，表明復(fù)方靈丹膠囊可以提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低氧化酶的活性，清除體內(nèi)過(guò)量的氧化基已達(dá)到抗氧化損傷的作用，保護(hù)肝臟。

綜上所述，復(fù)方靈丹膠囊具有良好的抗肝纖維化作用，并具有一定量效關(guān)系，其作用機(jī)制可能與其具有抗氧化活性和減少LN、HA、Ⅳ-C在體內(nèi)的合成有關(guān)。

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