響應(yīng)面分析法優(yōu)化杜仲總木脂素提取工藝

潘亞磊，翟遠(yuǎn)坤，牛銀波，李晨睿，武祥龍，梅其炳

(1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西西安 710072;2.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710072;3.第四軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室，陜西西安 710032)

杜仲Eucommia Ulmoides Oliv.，又名木棉(《木草圖經(jīng)》)，為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，我國(guó)特有藥用植物，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。 《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，謂其“主治腰膝痛，補(bǔ)中，益精氣，堅(jiān)筋骨，除陰下癢濕，小便余瀝。久服，輕身耐老”。近代藥理學(xué)研究表明杜仲在抗腫瘤、防治骨質(zhì)疏松、治療心腦血管疾病、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、安胎等方面有著良好的功效［1］。杜仲中的木脂素類化合物是杜仲的主要有效成分之一，是杜仲降壓的主要組分［2-4］，具有防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松［5］的作用。目前關(guān)于提取杜仲總木脂素的研究報(bào)道較少，鄧翀等以正交試驗(yàn)優(yōu)選出實(shí)驗(yàn)室提取杜仲木脂素的有效方法［6］。

松脂醇二葡萄糖苷是杜仲中含有量最豐富的木脂素類化合物之一，也是《中國(guó)藥典》控制杜仲質(zhì)量的所選參照化合物。本實(shí)驗(yàn)以松脂醇二葡萄糖苷為對(duì)照品，測(cè)定計(jì)算加熱回流提取杜仲總木脂素得率。篩選出提取杜仲總木脂素的主要影響因素，再采用響應(yīng)面法對(duì)主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得到了提取杜仲木脂素的最佳工藝，為杜仲這一寶貴中藥資源規(guī)模高效生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 杜仲購(gòu)自陜西省石泉縣，經(jīng)陜西省藥品檢驗(yàn)所郭耀武主任藥師鑒定為杜仲Eucommia Ulmoides Oliv.的皮;松脂醇二葡萄糖苷 (批號(hào)l11537-200501)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，為含量測(cè)定所用。其余試劑均為分析純。

U-3310分光光度計(jì)，日本日立公司;HC2168粉碎機(jī)，上海賽康電器有限公司;BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司;D-37520冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Marin Christ公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總木脂素提取工藝流程 稱量杜仲皮100 g→粉碎→過篩→加入溶劑→加熱回流提取→趁熱抽濾→濾液減壓濃縮→轉(zhuǎn)移至平皿－80℃預(yù)凍→低溫冷凍干燥→得到粉末狀固體。稱量所得固體質(zhì)量 (W，g)。

1.2.2 總木脂素得率測(cè)定方法

1.2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品3.48 mg，甲醇溶解后定容于10 mL量瓶。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確吸取“1.2.2.1項(xiàng)”中對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞試管中，揮干溶劑。每管依次加入10%變色酸溶液0.5 mL，濃硫酸3 mL，水1.5 mL搖勻，水浴加熱30 min，冷卻后搖勻［5-6］。紫外可見分光光度計(jì)560 nm處測(cè)定各管吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)量3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.1133 x－0.0071，r=0.998，松脂醇二葡萄糖苷在13.92～83.52 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取“1.2.1”項(xiàng)中制備的總木脂素固體0.52 mg，甲醇溶解后定容于5 mL量瓶。準(zhǔn)確吸取此溶液0.5 mL至5個(gè)具塞試管中，再分別加入“1.2.2.1”項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按照“1.2.2.2”項(xiàng)中方法測(cè)定吸光度，平均回收率為99.84%，RSD為2.78%。

1.2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“1.2.2.1”項(xiàng)中對(duì)照品溶液0.5 mL于具塞試管中，按照“1.2.2.2”項(xiàng)中方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算RSD為0.94%，表明精度較高。

1.2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“1.2.2.1”項(xiàng)中對(duì)照品溶液0.5 mL于具塞試管中，按照“1.2.2.2”項(xiàng)中方法測(cè)定吸光度，分別測(cè)定0、2、4、6、8、10 h的吸光度，計(jì)算RSD為1.57%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

1.2.2.6 總木脂素得率測(cè)定 適量精密稱取“1.2.1”項(xiàng)制備的總木脂素 (M，g)，按照“1.2.2.2”項(xiàng)中方法測(cè)定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得其中總木脂素的質(zhì)量為 (N，g)，計(jì)算總木脂素得率Y=W×N/M%。

1.2.3 主要因素篩選 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種二水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因素盡可能精確地估計(jì)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究［7］。選用11因素(七個(gè)實(shí)際因素四個(gè)虛擬因素)、實(shí)驗(yàn)次數(shù)為12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法篩選提取杜仲總木脂素的主要影響因素。因素及Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.4 工藝優(yōu)化方法 根據(jù)Box-Bohnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合二水平結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度為考察對(duì)象，采用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面分析法安排優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)選取三因素三水平見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要因素篩選結(jié)果及分析 采用design expert 7.0軟件，對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，杜仲木脂素得率Y及各因素對(duì)得率的影響率見表3。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平

表3的結(jié)果顯示七個(gè)因素中，溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度三個(gè)因素對(duì)木脂素提取影響較大，影響率都高于15%。溶劑種類對(duì)木脂素提取的影響率達(dá)到9.5%，但由于溶劑種類和溶劑體積分?jǐn)?shù)這兩個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響是共同作用的結(jié)果，從安全性考慮，故選擇乙醇為提取溶劑。其余三個(gè)實(shí)際因素影響率都小于3%，說明粉碎程度、液料比和提取次數(shù)三個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響較小，四個(gè)虛擬因素影響率也都小于3%，說明結(jié)果可信。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度三個(gè)因素對(duì)提取杜仲總木脂素的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 提取工藝優(yōu)化 采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化主要影響因素。根據(jù)Box-Bohnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出的3個(gè)主要因素 (乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度)，取三水平進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其余因素從節(jié)約能源的角度考慮，選擇二水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的－1水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立 利用Design Expert 7.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，以乙醇體積分?jǐn)?shù)X1、提取時(shí)間X2、提取溫度X3為自變量，總木脂素得率Y為因變量，獲得杜仲中總木脂素提取的回歸模型:

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5?；貧w方程中各變量對(duì)響應(yīng)值Y影響的顯著性由F檢驗(yàn)來判定。概率P(F＞Fa)值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，P(F＞Fa)＜0.01時(shí)影響為高度顯著，P(F＞Fa) ＜0.05時(shí)影響為顯著。各因素中X1、X3、和對(duì)響應(yīng)值Y的影響極顯著 (P＜0.01);X2對(duì)響應(yīng)值 Y的影響顯著 (P＜0.05);三個(gè)交互項(xiàng)X1X2、X1X3和X2X3對(duì)響應(yīng)值Y的影響不顯著 (P＞0.05)。模型的極顯著，相關(guān)系數(shù) R=0.9647，說明響應(yīng)值的變化有96.47%來自于所選擇的變量。回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用此模型對(duì)總木脂素提取效果進(jìn)行描述。

2.2.2 杜仲總木脂素提取條件響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 應(yīng)用響應(yīng)曲面法對(duì)杜仲總木脂素提取的回歸模型進(jìn)行分析。通過固定一個(gè)因素在零水平，研究另外兩因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響效果。經(jīng)分析乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度兩個(gè)因素在等高線下的曲率較大，而提取時(shí)間在等高線下的曲率較小，這和回歸模型中X1和X3對(duì)響應(yīng)值Y的影響顯著性大于X2對(duì)響應(yīng)值Y的影響顯著性是一致的。響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值存在極高值，且最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。利用Design-Expert軟件，對(duì)提取杜仲總木脂素的回歸模型解逆矩陣得知，3個(gè)因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度)的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)取值分別為 (62、113、72)，此時(shí)Y取最大值1.91。

表5 響應(yīng)曲面的二次模型方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 在乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度取最佳條件，其他因素取Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中二水平的-1水平條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3次平行試驗(yàn)的Y均值為1.86，與預(yù)測(cè)值1.91的相對(duì)誤差為0.26%，證明了回歸模型較為準(zhǔn)確可靠，達(dá)到了優(yōu)化提取條件的預(yù)期目的。

3 討論與結(jié)論

杜仲中木脂素類化合物有27種之多［8］，不易構(gòu)建具有詳細(xì)理論依據(jù)的提取模型，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)Box-Bohnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的模型屬于經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?(化學(xué)動(dòng)力學(xué)模型)通過簡(jiǎn)單擬合方法得到參數(shù)值，雖缺乏理論推導(dǎo)驗(yàn)證，但所得模型簡(jiǎn)單且具有實(shí)用性［9］。

本實(shí)驗(yàn)先用Plackett-Burman二水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響杜仲總木脂素提取的三個(gè)主要因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取時(shí)間和提取溫度，再對(duì)這三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，得到了影響總木脂素提取的模型，對(duì)回歸模型求解后，得到的最優(yōu)提取條件參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)62%，提取時(shí)間113 min，提取溫度72℃，杜仲皮粉碎程度為40目，液料比為10∶1，提取次數(shù)為2次。此時(shí)，總木脂素得率為1.86%。鄧翀等以甲醇為溶劑超聲輔助提取杜仲總木脂素，雖然提取時(shí)間短，但超聲提取方法受現(xiàn)代儀器設(shè)備的限制，主要用于實(shí)驗(yàn)室中藥及其制劑分析方面［6］，本研究采用毒性小的乙醇為溶劑運(yùn)用加熱回流法提取杜仲總木脂素，經(jīng)過優(yōu)化提取條件后總木脂素得率更高，應(yīng)用優(yōu)化所得方法提取制備杜仲總木脂素，得率高，提取工藝簡(jiǎn)便，可廣泛應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。

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